专利名称：分析芯片以及所述分析芯片用于测定分子结构和功能的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于研究膜蛋白功能性以及它们与分子相互作用的分析芯片。更进一步地，本发明涉及分析在流体生物有效层(fluidbiological effective layer)中整合的非脂类分子，例如蛋白质的功能性(functionality)的方法。此外，本发明涉及所述分析芯片的用途。
对蛋白质结构及其相关功能的详细了解是理解生命分子过程的关键。依靠强大的分子克隆和基因表达技术，可以为分析研究目的制造出足够量的蛋白质。蛋白质组学目前是生命科学研究中非常活跃的领域。最终目的是获得对蛋白质结构和功能的全面的理解。这种知识是对新药进行合理设计的先决条件。G-蛋白偶联受体(GPCR)组成了细胞膜受体的最大亚组，它们中的大约一半被认为是药物的靶。举例而言，牛视紫红质(GPCR蛋白质的一种模型)的实际结构近来可在2.8A的分辨率下被测定。GPCRs具有糖基化的N-末端配体结合位点、七个跨膜螺旋以及细胞内G-蛋白结合结构域。结合到细胞外部分上的配体能诱导受体蛋白跨膜螺旋束中的构象变化，导致与GPCR细胞内区域结合的异源三体G-蛋白解离为α-和βγ-亚基。G-蛋白被共价锚定到脂双层上，根据与不同目标膜蛋白(例如酶或离子通道)反应的α-亚基的性质，它们目前被分类为四个家族。G-蛋白解离之后，α-亚基在脂双层内横向散开，与目标蛋白质结合并对其进行激活。
因此，在任何类型的功能性分析和筛选方法中，脂双层的组成和流动性都是关键的议题，当考虑为筛选目的的经济方法时，其尤其具有很高的兴趣。
在微点(micro-spot)上固定的GPCRs的阵列近来已被用于研究与这种膜蛋白特异性结合的化合物。此类高通量技术使得筛选得以在受体家族间或家族内进行，并且可能适用于针对孤儿(orphan)GPCRs的配体垂钓(ligand fishing)。目前大约140种孤儿GPCR受体的生物学应答是未知的，这使得确定哪些配体是可能有用的药物的过程难于进行。
对非olefatory GPCRs进行去孤儿化(deorphanization)目前是制药工业中的焦点，近来已经鉴定出了一些具有与癌症和糖尿病相关的可能功能的受体。成功发现新的结合化合物强烈依赖于目标蛋白的完全功能性，如同在活细胞中的情况那样。较之激动剂结合位点，不覆盖天然激动剂的结合位点的GPCR上的变构位点具有大量理论上的好处，例如饱和性以及高的组织特异性。因此，对于通过增加或部分降低其活性来调控受体功能的药物来说，变构位点是具有吸引力的目标位点。变构配体或调控蛋白的结合可以产生由若干组分构成的膜蛋白复合体。此外，对于研究此类相互作用而言，需要高敏感度的功能分析系统，其中，目标膜蛋白在脂双层膜内必须是完全流动的，并且它们应当非常容易接近(accessible)。
在下述体外分析系统的几乎全部情况下，未知组分的生物膜被固定于固体支持物上，这通常导致脂双层的流动性受限以及膜蛋白的结构紊乱。因为此原因，在广泛的分析操作活动(assay processingcampagnes)中，这些情况是非常不想要的，因为为进行药物筛选过程，蛋白质的天然功能可能被严重扰乱。
膜蛋白的第二大重要的类是离子通道。真核细胞的电压门控钠通道是复杂的膜蛋白，它由超过2000个氨基酸残基组成。细菌的钠通道要简单得多，其由34kD的一个结构域构成，其可以以高比率表达，因此对于分析技术发展来说非常地有用。高通量筛选分析使用结合脂双层膜的敏感报道分子或融合构建体(由绿色荧光蛋白和离子通道构成)。通过使用提出的高复杂度的分析系统，将能获得对目标膜蛋白功能的更深刻的认识。学术研究和药物探索都能从这种知识获益。
基于细胞的分析很适合用于监测GPCRs在其天然环境下的生物学应答，它们被广泛用于在药物探索过程中鉴定出先导化合物。为理解分子机制，需要进行体外试验，其中，涉及到的组分的数量有所减少。膜蛋白在体内的功能性依赖于很多因素脂双层膜的组成、生物活化反应(例如磷酸化)或细胞内的Ca++浓度。用于膜蛋白的强有力的功能性仿生体外试验的发展是高要求、高度学科融合的领域。第一步是将纯化表达的重组蛋白质重新构建于脂双层膜中，以使它们成为具有功能的形式。由脂双层构成的囊(vesicle)通常被用于在缓冲溶液中保持活性膜蛋白。使用表面等离子共振作为探测方法，当它们结合到传感器表面上时，已能对配体与囊中存在的蛋白质的结合进行监测。但是，此类囊制剂可能需要非常大量的蛋白质，以在测量中获得足够高的敏感性，而且它们不适合研究很多种功能方面。因此，发展出了若干种类型的杂交系统，其中，平面脂双层膜被固定于固体支持物上。
在Teflon支持物上跨越一个洞的独立的(free-standing)膜呈现为黑色。此类黑色的脂双层膜难于制备，并且非常脆弱，因为4nm厚的脂双层必须跨越200μm至1mm范围内的洞。对研究实验而言，这种限制可能是可以接受的，但是，对药物探索中的实际应用而言，分析系统的稳定性是很重要的问题。因此，大约20年来，为获得更高的稳定性，用支持物发展出了多种技术。膜蛋白已通过脂质囊的融合被固定到被支持的脂双层上，或被直接固定到SiO2上。从吸附到亲水表面(例如云母)的囊形成的平面双层可被观察到。
但是，当被支持时，脂双层有所改变的物理性质会严重影响到嵌入的膜蛋白的功能。为克服这些问题，已通过系链(tether)将脂双层膜固定到表面上。得到的脂双层膜与固体支持物之间的裂缝模仿了细胞内空间，跨膜蛋白质的想要的功能性被部分保留。使用荧光探测技术，已能对配体与脂双层中膜蛋白的结合进行监测。还对阻抗进行测量，以确定被支持的离子通道的功能。含有离子载体的被支持的脂双层膜的电导随着配体的结合而改变。该效应已被用于发展基于膜蛋白的生物传感器。
杂交系统的优点是能获得稳定性以及切实可行的制备过程。通过囊与被支持的磷脂单层的融合形成被支持的平面脂双层膜的过程已被建立。为对配体结合进行光学探测，已在烷基化的羧化右旋糖苷聚合物上制备出了脂双层膜，其被以高密度固定到传感器表面。在使用微图案化(micropatterned)的表面的研究中显示，亲水-疏水边缘能促进囊的融合。此外，短链醇、Ca++离子和PEG的融合作用是本领域已知的。这些研究表明，囊的组成、融合试剂、亲水性、表面的拓扑学和化学性质以及温度是影响从吸附到固体支持物上的囊形成脂双层膜的最重要的因素。
根据前文所述的方法获得的被支持的系链化脂双层膜也具有一些重大缺点。脂双层膜和支持物之间的贮库(reservoir)中流体的组成很难被控制，固定的脂双层膜的流动性就受到了限制。这构成了极大的缺陷，因为膜蛋白的功能性与脂双层的流动性以及它们在其中的可动性相关。此外，具有大的跨膜环的膜蛋白(例如，乙酰胆碱受体，具有5nm的大的细胞内部分)的掺入会受到阻碍，因为通过系链获得的支持物和脂双层之间的细胞内空间对于更大的跨膜环来说太小了。
此外，系链化的脂双层膜仅有一侧是可接近的，这使对跨膜变化或分子转运的探测难于进行。非天然环境可能导致功能性受损，在筛选中，生理受体功能可能不会被探测到。
下文中，不同的膜类型，例如制备出的具有预先确定的组分的脂双层、细胞来源的组分大部分未知的生物膜或超分子集合体(supramolecular assembly)的功能层，笼统地被称为生物有效层。
因此，本发明的一个特殊目的就是提供一种具有作为膜的生物有效层的设备，其具有可靠的高稳定性，存在方式使得其流动性能被保持，以将非脂类分子整合进所述的层，并保持其完整的生物功能性。
该目的将根据本发明来获得，这是通过一种分析芯片实现的，所述芯片用于研究非脂类分子的功能性以及它们与分子的相互作用，所述分析芯片包含a)具有多个纳米孔(nanopore)的纳米孔基底；b)合适的、基本上平面化的支持物层，其放置于(deposited on)所述具有多个纳米孔的纳米孔基底上，与所述纳米孔基底对应；c)生物有效层，能接纳至少一种非脂类分子或功能分子，其被放置于所述支持物层上，覆盖所述多个纳米孔，产生从生物有效层的两侧均可接近的纳米孔用于测量。
该分析芯片提供了具有肉眼可见的横向尺寸的纳米孔阵列，由此提供了用于稳定生物有效层(被定义为能保持其中接纳的非脂类分子的完全的功能性的层)例如脂双层膜的支持区域，以及高密度存在的孔，其中生物有效层保持完全流动性。该分析芯片因此提供了用于多种应用的通用系统，例如药物筛选、功能蛋白质分析、毒性分析等。由于Si3N4层的厚度很薄，具有纳米孔的分别的Si3N4膜也很薄，由于应用的加工技术，这些Si3N4膜在机械上是稳定的。孔直径与纳米阵列厚度的给定纵横比(aspect ratio)允许大分子向脂类层的膜和整合进去的非脂类分子(例如，膜蛋白)的扩散不被阻碍。此外，机械上稳定的生物有效层(指具有纳米孔的Si3N4膜的固体支持物层和在上面固定的生物有效层)提供了从所述生物有效层的两侧的自由接近，这允许对分子(例如天然配体)的复杂相互作用或与人工效应物分子(例如药物)和功能性整合进去的膜蛋白的相互作用加以研究，以阐释信号转导的机制。由于从两侧的可接近性，可在微腔系统中，即，在两区室系统中，对由转运蛋白通过生物有效层对离子、分子和颗粒的运送加以研究。表面图案化和微打点(microspotting)技术将允许展示出(address)特殊的纳米阵列。此外，膜蛋白在空间上不会受到阻碍，因为它们的移动性得以被保持，因此能直接对它们对变构效应的反应加以研究，这对于发展以GCPRs为目标的新药来说很重要。纳米结构化的总表面积在下述范围内一方面，存在有足够大量的膜蛋白分子，从而可以用肉眼可见的方法，通过荧光手段或其它敏感的探测方法来探测明显的结合。另一方面，珍贵的膜蛋白和/或结合化合物的量相对较低，用于获得想要的筛选方法。
这种具有纳米结构化的氮化硅膜的分析芯片能支持生物有效层，因此能对细胞骨架进行生物模拟。
用作为合适的支持物层的材料是氮化硅(Si3N4)或硅氧化物(SiO2)，纳米孔基底可能是含碳和硅的材料，也可以是聚合物、金属、电介质(dielectrica)、玻璃或陶瓷。合适在本发明中被理解为下述定义支持材料的性质允许推想的将被支持物层支持的脂类层附着。此外，应当指出，支持物层可以具有能促进脂类层融合到支持物层上的化学和拓扑学性质。
为提高或诱导流体脂双层在支持物层上形成和/或融合和/或固定至想要的程度，可对支持物层的表面加以修饰，得到一种促进层(promotion layer)，即，使用化学活化的疏水或亲水性硅烷或其它组分来进行修饰，以及对物理性质的修饰，例如拓扑性的修饰或电学修饰。可根据待支持的脂双层的性质，以及按照用于脂双层形成的机制来设计促进层。
在大分子的自由扩散性和稳定性的方面，可对纳米孔阵列部件中支持物层的厚度以及纳米孔的直径加以选择，以使得纵横比在0.25至5的范围内。通常，一个纳米孔阵列部件(section)包含纳米孔，每个孔的直径都在50至2000nm范围内，优选地，100至2000nm范围内，纳米孔阵列部件的厚度在50至2000nm范围内。纳米孔阵列部件的区域具有1×10-6mm2至1mm2范围内的面积。例如，200nm的孔直径需要支持物层的厚度为400nm厚，用于匹配上2的纵横比。优选地，该纵横比可以在0.75至2的范围内。因此，非常合适的孔直径可以在100至400nm的区间内。该尺寸提供了生物有效层和支持物层机械稳定性之间非常好的平衡，并且，其还能保持液体双层膜的流动性以及整合进去的膜蛋白的完全的功能性。此外，目前宏观探测方法所需要的膜蛋白的量被限制为经济上合理的程度。
在获得生物有效层的有效面积的方面，其使纳米孔中独立的脂双层膜面积和被支持的脂双层膜面积保持适当的关系，所述的孔互相之间的间隔在它们直径的0.5至5倍的范围内，优选地，在0.8至2倍的范围内。
实践中，可从天然来源分离出生物有效层，主要是从原核或真核细胞中分离，生物有效层也可以是从脂类囊及它们稍后的融合制备来的脂双层。
重新构建的双层的脂类组分可以选自含有磷脂、心磷脂(cardiolipid)、溶血磷脂、神经酰胺、神经节苷脂、脑苷脂、糖脂、类固醇和鞘脂类的组。
生物有效层包含至少一种非脂类和/或功能分子，其中，非脂类分子可选自含有蛋白质、多肽、肽或合成化合物(例如，具有仿生功能的)的组；蛋白质可以是酶、转运蛋白、结构蛋白、受体、细胞因子、激素、毒素、抑制剂或伴侣分子。这些非脂类分子可以从天然来源例如真核生物或原核生物的细胞分离或纯化。此外，非脂类分子可以是合成的化合物。
生物有效层包含至少一种非脂类和/或功能分子，其中，功能分子可以来自人造来源，例如重组DNA或RNA技术。
生物有效层可以用至少一种完整的活细胞形成。取决于纳米孔阵列的实际几何形状，可以使用多于一种的细胞。细胞可以被嵌入到生物有效层中，生物有效层被预先放置(deposited)到纳米孔阵列上。如果没有此类的层被放置，那么细胞则代表生物有效层自身。
根据本发明，对于在此类分析芯片中的整合到生物有效层中的非脂类分子或功能分子的功能性加以研究的合适程序包含如下步骤a)将含有分子的流体应用到流体生物有效层的一侧，以允许所述分子结合，以与非脂类分子相互作用；b)通过测量分析芯片正面或反面的物理或化学变化，对流体生物有效层中结合分子的相互作用和/或效应物结合诱导的非脂类分子的应答加以监测。
因此，上述分析芯片可根据本发明用于药物探索过程，这针对膜蛋白的响应于将要筛选的可能的药物化合物的完全功能性来进行。结合可以在生物有效层的正面作为例如荧光淬灭被观察到，或者可以在反面被观察到，这可以通过测量pH、K+、Na+浓度，测量小体积中的染料或放射活性来进行。
下述描述将阐释一些优选的实施方式，它们不用于限制本发明；下文的描述还会引用下面的附图，用于阐述本发明。因此，下面给出了对附图的简单的描述。
图1是流体脂双层中发生的生物机制的示意图。
图2是根据本发明的一种特殊的实施方式中，具有纳米孔阵列的分析芯片的设计及其尺寸的示意图；以及图3是根据本发明一种实施方式的具有纳米孔阵列的分析芯片的制造过程的示意图。
根据图1，显示了分析芯片2的一部分，以阐述膜蛋白3的生物学功能。分析芯片2是用于对膜蛋白3的结合活性加以研究的必需先决条件，其联合了上文所述的被支持的4和独立的脂双层膜5的优点。分析芯片2包含阵列基底28和300nm厚的氮化硅层6，氮化硅层6具有直径在50nm至2μm范围内的孔8的阵列7形式的部件(sections)。用于支持的该氮化硅层6被支持促进层9进行了化学修饰，其中使用了经活化的疏水硅烷。分别位于支持物层6或支持促进层9表面上的平面脂双层膜4可以多种方式形成。在这种实施方式中，脂类囊的疏水链10与疏水的支持促进层9相互作用，自发地形成双层4。在第二个步骤中，具有完整膜蛋白3的脂类囊11被加入，其与固定的脂双层4发生相互作用。粘附到支持物促进层9上以及在第二个步骤中粘附到形成的双层上的脂类囊11的融合12可以在合适的条件下自发地发生。或者，可使用融合剂来诱导融合。可以使用光学、荧光和扫描探针显微镜或电化学方法来监测融合过程。
当用纯净的(neat)脂类囊11获得没有缺陷的连续脂双层膜4时，可对具有商业可获得的Na+和Ca++离子载体的脂双层膜加以研究。在第二阶段，按照下文所述对膜蛋白加以研究。或者，溶解的膜蛋白3可被直接包括进制备的脂双层膜4，膜4位于纳米孔阵列部件7上。膜蛋白3被预计能优选地在纳米孔8中的脂双层5的独立区域上聚集。
所提出的概念允许在第一个步骤中在囊悬浮液11中制备膜蛋白3，以及在第二个步骤12中将囊加入到制备得到的脂双层膜4中。得到的独立的(free standing)脂双层膜4具有足够高的机械稳定性以及长范围(long-range)流动性，这是获得跨膜蛋白制剂的完全的功能性所需要的。
分析芯片2用于研究跨膜蛋白3(例如GPCRs)的功能性以及它们与其它膜蛋白(例如离子通道13)的相互作用。为说明流体脂双层对于膜蛋白活性的大致的重要性，详细列出GPCRs的功能。在天然配体14与其结合位点15结合之后(用箭头16表示)，GPCR获得了催化活性，导致了特殊的三体G-蛋白分子18在α-19和βγ20亚基的解离17，这是在当其从脂双层膜4的另一侧结合到该膜蛋白3(箭头21)的时候发生的。G-蛋白18的亚基19和20通过脂类的锚共价偶联到脂双层膜4，它们可以在脂双层膜4内横向扩散到目标膜蛋白13。此外，变构效应物分子22与膜蛋白3的变构位点对接(docking)(由箭头24代表)的作用可被监测，所述监测针对其作为增强子、激动剂和拮抗剂调节受体功能的作用来进行。膜蛋白13中被诱导的结构变化导致了若干生物化学反应，例如，磷酸化、c-AMP产生，这取决于α-亚基19的类型。在该特殊的实施方式中，目标蛋白13是离子通道，通过脂双层4以高特异性转运K+离子，这可以用有效的K+特异性冠醚指示剂的荧光加以监测。
在这种实施方式中，纳米孔具有大约140nm的宽度，这使得本领域技术人员清楚地知道，在描述中膜蛋白3被很大程度地放大了，从而能对生物机制进行示例性描述。箭头25表示，膜蛋白3在沿着独立的孔区域5内的脂双层4移动时，保留了其柔度(flexibility)。事实上，膜蛋白3的大小仅为若干nm，这意味着在同样的孔区域可以容纳大量的多种膜蛋白3，从而允许在其尺寸的大倍数的范围内进行平均的自由横向移动。在本实施例中在1的范围内的纵横比由此允许甚至更大的分子26能不受阻碍地扩散(箭头27)到独立的孔区域5中并实际上到达脂双层4中整合的膜蛋白3的受体位点。
图2以示意图的方式描述了对分析芯片2的设计，在该实施方式中，所述芯片包含总面积为100mm2的阵列基底28，其具有300nm厚的氮化硅层6，氮化硅层6具有实际的纳米孔阵列7。具有实际的纳米孔阵列7的氮化硅膜部件29的尺寸为大约1mm2。400×400μm的纳米孔阵列部件7包含纳米孔8，纳米孔8具有50至2000nm范围内的直径(在30处显示)。纳米孔8互相之间的距离(间距(pitch))被选取为在它们直径31的范围内。这既确保了脂双层4在合适的支持物层6上的足够的稳定性，又确保了膜蛋白3和待筛选的化合物(4，22)的相当高的分子密度，这样彻底地减小了膜蛋白3以及待筛选的化合物的量。为支持该论点，下面给出一种简单的估计纳米孔被安排于400×400μm的面积上(相应于0.16mm2)，其具有125nm的直径，相互之间是相同的距离。这使得在所述面积上有2×106个孔。假设在每个纳米孔8中，将容纳10个直径大约5nm的膜蛋白分子3，这导致膜蛋白分子总量为2×107个，或3×10-7mol，以及0.2％的低填充因子。取决于各种膜分子的分子量，假设分子具有30kD的分子量，对各种分子的需要量即在每分析芯片1pg的范围内。单个离子通道给出大约1pA的电流，其对应于107个离子/秒。100秒内所有离子通道的流量(turnover)将为大约10-7mol离子，在估计为大约10μl的液体体积中，其对应大约1毫摩尔的浓度。很多其它膜蛋白的活性将更低，但是在提到的小体积中，待探测的化合物的浓度将在毫摩尔至微摩尔的范围内。这种估计明显揭示，通过使用该分析芯片设计，仅需要非常小量的各种分子，因此对于通过肉眼水平上的探测方法，例如荧光和阻抗来监测浓度变化而言，该数量仍是足够的。针对其功能性以及与天然配体结合分子和/或变构效应物分子发生的反应或作为天然配体结合分子和/或变构效应物分子进行分析的各种分子的小量使得下述构想成为现实对任何类型的药物探索或筛选过程而言，该分析芯片完全是目前最好的选择。
图3示意性地显示了制造纳米孔以获得芯片32的方法，所述芯片32包含基底28和具有纳米孔8的支持物层6。首先，通过热浮雕(hotembossing)技术复制纳米孔8将印章33(图3A)印到旋涂的(spin-coated)PMMA 34(分子量25kg/mol)上，至厚度为330nm，PMMA 34位于Si3N4(260nm)/Si(300至360μm)/Si3N4(260nm)/Cr(40nm)基底35上。使用扫描电子束，用Leiea LION-LV1电子束直写机(writer)在PMMA抗蚀剂34上写上孔阵列，来制作硅母板(silicon master)(用作为浮雕印章的方形硅片，边长为13.5mm)。此处，孔直径是通过孔径大小和电子束散焦来确定的，孔周期(poreperiod)是通过扫描步长来确定的。母板制作的最后步骤包括将Cr移走以产生点阵列掩模，并且RIE二氧化硅，以产生高度为130nm的、印章中的支柱阵列。基底反面的Si3N4是用方形开孔(边长1×1mm)预先赋予结构的，以被用作为最终的Si3N4-膜制造步骤的掩模(图3B)。在基底正面的Si3N4-层包括对准标记(13.5×13.5mm框)，以对准浮雕母板，使得纳米孔与Si3N4-膜一致，其还包括分割线(10×10mm框)，以从晶片上移出最终的10×10mm芯片，这样能允许改进的操作得以进行。浮雕之后，使用O2等离子体移去PMMA残余层，用Cl2/CO2等离子体将孔转移到Cr层上(图3C)。然后用O2等离子体移去PMMA掩模，之后用CHF3/O2等离子体将孔转移到Si3N4中。用KOH浴在70℃对Si进行蚀刻，以开启氮化硅膜的背侧(图3D)，用Cl2/CO2蚀刻除去Cr掩模，以得到最终的芯片(图3E)。
权利要求
1.一种分析芯片(2)，所述芯片用于研究非脂类分子的功能性以及它们与分子的相互作用，所述分析芯片包含a)具有多个纳米孔(8)的纳米孔基底(28)；b)合适的基本上平面化的支持物层(6)，其放置于所述具有多个纳米孔(8)的纳米孔基底(28)上，与所述纳米孔基底(28)的所述纳米孔相对应；c)生物有效层(4)，其能接纳至少一种非脂类分子或功能分子，其被放置于所述支持物层(6)上，并且覆盖所述多个纳米孔(8)，产生从生物有效层(4)的两侧均可接近的纳米孔(8)用于测量。
2.如权利要求1所述的分析芯片(2)，其特征在于，通过例如被活化的疏水或亲水硅烷或其它组分对支持物层(6)的表面加以化学修饰，得到支持物促进层(9)。
3.如权利要求1或2所述的分析芯片(2)，其特征在于，合适的支持物层(6)选自含有氮化硅(Si3N4)或硅氧化物(SiO2)基底的组，所述基底(28)选自包括含硅和碳的材料、聚合物、金属、电介质、玻璃或陶瓷的组。
4.如前述权利要求中任意一项所述的分析芯片，其特征在于，所述基底的厚度与所述纳米孔(8)的直径被选择以得到在0.25至5的范围内，优选地，在0.75至2的范围内的纵横比。
5.如权利要求4所述的分析芯片，其特征在于，所述纳米孔(8)的直径在50至2000nm的范围内，优选地，100至2000nm的范围内。
6.如前述权利要求中任意一项所述的分析芯片，其特征在于，所述纳米孔被布置于多个面积在1×10-6mm2至1mm2范围内的纳米孔阵列部件(7)中，所述部件位于总面积为1×10-6mm2至10mm2的独立的氮化硅膜(29)上。
7.如前述权利要求中任意一项所述的分析芯片，其特征在于，所述纳米孔(8)相互之间的距离在它们直径的0.5至5倍范围内，优选地，在它们直径的0.8至2倍的范围内。
8.如前述权利要求中任意一项所述的分析芯片，其特征在于，所述生物有效层是优选从原核或真核细胞分离出的生物膜，或者，所述脂双层是通过制备脂类囊以及其后的融合形成的，或是超分子集合体的功能层。
9.如前述权利要求中任意一项所述的分析芯片，其特征在于，所述非脂类分子来自天然来源，例如真核生物或原核生物的细胞。
10.如权利要求9所述的分析芯片，其特征在于，所述非脂类分子是合成的化合物。
11.如权利要求8所述的分析芯片，其特征在于，生物膜和脂双层都包含至少一种非脂类和/或功能分子(3)，其中，所述功能分子(3)是用重组DNA或RNA技术制造的。
12.如权利要求8所述的分析芯片，其特征在于，所述生物有效层是从至少一种完整的活细胞来制备的。
13.一种方法，用于分析非脂类分子或功能分子(3)的功能性，所述分子被整合于前述权利要求1至12中任意一项所述的分析芯片的生物有效层(4)中，所述方法包括a)将含有结合化合物(14，22)的流体应用到流体生物有效层的一侧，以允许所述结合化合物(14，22)与所述非脂类分子相互作用；b)通过测量分析芯片(2)正面或反面的物理或化学变化，对流体生物有效层中通过与结合分子(13)的相互作用和/或效应物结合(14，22)诱导的非脂类分子(3)的应答加以监测。
14.如前述权利要求1至12中任意一项所述的分析芯片在药物探索过程中的用途，所述药物探索过程针对膜蛋白(3，13)应答于待筛选的可能药物与膜蛋白(3)在激动剂位点(15)或变构位点(23)的结合的功能性。
15.如权利要求1至14所述的分析芯片的用途，用于膜蛋白制剂，以使用显微和纳米显微方法(局部探针显微方法)或测量光(特别是荧光)、离子、电流、放射性和机械信号来对分子和分子簇进行成像。
16.如权利要求1至14所述的分析芯片的用途，用于以下应用通过肉眼可见的方式研究或探测两个区室间的分子过程，其中，所述体积在亚毫升至微升范围内的两个区室作为(微)流体系统的部分，通过所述生物有效层被分离开，任选地，所述生物有效层整合有蛋白质，其中，所述蛋白质是跨膜的、完整的、通过肽连接的或连接到脂类锚上的，或通过非共价方式粘附到所述脂双层(4)上。
全文摘要
一种分析芯片(2)，用于研究膜蛋白质的功能性以及它们与分子的相互作用，所述分析芯片包含具有多个纳米孔(8)的纳米孔阵列(7)，其位于放置于所述纳米孔基底(28)上的合适的支持物层(6)中，所述支持物层(6)是基本上平面化的支持物层(6)，其具有多个纳米孔(8)，与所述纳米孔基底(28)的所述纳米孔(8)相对应；生物有效层(4)，其能接纳至少一种非脂类分子或功能分子，其被放置于所述支持物层(6)上，覆盖所述多个纳米孔(8)，产生从生物有效层(4)的两侧均可接近的纳米孔(8)，用于测量或成像。本发明提供了一种结构化的支持物层，其允许产生生物有效膜，例如脂双层膜，它们具有可靠的高稳定性，使得其流动性被保持，以在所述脂双层中使整合的膜蛋白保持其完全的生物学功能性。
文档编号G01N33/543GK1902497SQ200480038567
公开日2007年1月24日 申请日期2004年11月15日 优先权日2003年12月23日
发明者L·蒂菲瑙尔, K·布兰德 申请人:保罗·谢勒学院, 莱斯特加工技术公司