专利名称：快速分析抗肿瘤中药作用机理的dna芯片及其方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种能够快速分析抗肿瘤中药作用机理的DNA芯片及其工艺。
背景技术：
恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病，已成为继心血管疾病之后居各类疾病死亡率的第二致死病因。在我国，每年约有90万肿瘤病人死亡，并且近年来死亡人数呈逐年递增的趋势。因此，世界各国都投入巨资研究开发抗肿瘤药物。很明显抗肿瘤药物市场前景广阔。尽管到目前为止已有数十种化疗或辅助抗肿瘤药物可以用于临床治疗，但大多数药物只能使病情缓解，无法达到治愈的目的。尤其是大多数死亡率很高而又很常见的癌症，如胃癌、食道癌、肺癌等仍缺乏有效的抗癌药物。因此，迫切需要新的、具有明显疗效的抗癌药物的研究和开发。目前，中药正逐步为世界所认识、接受是不可否认的事实与潮流，特别是中药在抗癌、治癌方面有着明显的优势，得到国际的公认。有统计表明，欧美大药厂研制一种新的合成药物需要7～10年的时间和0.8～3.5亿美元，而有些药物如抗肿瘤药，筛选命中率更低至万分之一。而我国的瑰宝中药有数千年辉煌历史、深入系统的理论和丰富宝贵的治疗经验，中药材资源及相关方剂数不胜数，更有各种抗癌的古方、验方、秘方。应该能够大有所为，但如何让中国已知抗癌功效的中药进入规范严格的国际市场，其瓶颈就是分析出成分复杂的中药复方、单方的分子作用机理。这需要发明一种全新的系统。这种系统的特点必须是①能够快速的大规模分析药物作用原理；②通用性强；③适用范围广；④不局限于一种或一类药物。DNA芯片(DNA Microarray)技术，是顺应人类基因组计划(HGP)的进行而产生的一种高通量、大规模研究基因功能的新技术，在基因芯片的表面，以微阵列(array)的方式固定有成千上万的寡核苷酸(oligo)或cDNA。使用DNA芯片可以大规模的对研究者感兴趣的基因表达进行测定。人类基因组计划(HGP)获得了大量基因信息，包括关键疾病基因的确定，为药物作用提供了大量的新靶点。随着分子肿瘤学、分子药理学的发展，越来越多的证据表明，抗肿瘤药物发挥作用的机理均通过影响肿瘤细胞基因表达而进一步引起细胞和瘤体表型的改变。药物作用后细胞内基因表达变化特征与细胞和瘤体表型改变呈现内在规律，根据这种规律，可以在未观察到细胞表型变化之前就推测药物的作用机理。药物引发的基因表达变化非常复杂，呈现基因相互作用和调控后的级联反应。因此，根据个别基因的变化来推测药物最终引起的表型变化往往有失偏颇。而通过观察基因群的变化，虽复杂但能反映药物作用的内在规律。传统的分子生物学技术均无法在同一时间内分析大量的基因表达变化，而基因表达谱芯片集成了成千上万种基因，因此使在同一时间内分析大量的基因表达变化成为可能。
发明内容
为了解决传统的分子生物学技术均无法在同一时间内分析大量的基因表达变化的缺陷，本发明提供一种快速分析抗肿瘤中药作用机理的DNA芯片及其方法，它可以缩短药物研究开发周期及减少药物研究开发费用，加快中药进入国际市场。本发明的目的是这样实现的快速分析抗肿瘤中药作用机理的DNA芯片由下述具有转录，细胞周期，癌基因和肿瘤抑制基因，应激反应蛋白，DNA合成、重组和修复，凋亡相关蛋白，细胞黏附受体蛋白，细胞信号传导，细胞外通讯蛋白，细胞受体，细胞骨架/迁移蛋白，免疫系统蛋白，膜通道和转运蛋白，代谢，翻译后修饰/蛋白折叠，细胞交通定位，DNA结合及染色质蛋白，细胞外基质转运蛋白，细胞内传导/效应/调节子，细胞表面抗原，RNA处理、周转和转运，翻译，蛋白周转，其他功能，和细胞外基质生物学功能的基因片段组成。快速分析抗肿瘤中药作用机理的方法按照下述步骤进行分析一、选择上述DNA芯片作为分析抗肿瘤中药作用机理的芯片；二、选择临床常规使用的以及民间流行的抗肿瘤中药作为工具药物；三、选择常用的肿瘤细胞株作为细胞模型；四、用上述抗肿瘤中药分别作用于细胞模型后，利用CCK8方法筛选出各工具药物相应的敏感细胞系，提取mRNA，与DNA芯片杂交检测药物作用的基因；五、应用生物信息学对药物反应基因进行统计和分类；六、依据药物标志基因和特异性中瘤基因的变化规律，进行分子细胞水平的机理验证。本发明的快速分析抗肿瘤中药作用机理的DNA芯片及其方法具有许多商用价值和科研价值，具体表现为(1)能够快速分析已知临床使用的中药以及民间秘方的抑制癌细胞的分子机理，改变中药的出口困难的窘境。(2)该系统能够作为一种商品，广泛应用于临床、医药行业以及实际生产中。(3)探明分子作用机理，寻找到新的药物靶点，为下一步开发小分子药物设计提供候选靶点。
图1为CCK-8法检测药物对Hela癌细胞的半抑制率结果图；图2为CCK-8法检测药物对AGZY癌细胞的半抑制率结果图；图3为CCK-8法检测药物对PC3癌细胞的半抑制率结果图；图4为DNA片断化实验结果图，其中C对照，T药物处理，M标记；图5为癌细胞经5，7，4-三羟异黄酮处理前的形态图；图6为癌细胞经5，7，4-三羟异黄酮处理后的形态图；图7为染料木素对PC3细胞6小时处理表达谱芯片荧光图；图8为RT-PCR验证TGF-β基因的表达变化结果图，其中M分子量标记，C对照，S样品；图9为RT-PCR验证VEGF165和VEGF121基因的表达变化结果图，其中M分子量标记，C对照，S样品；图10为RT-PCR验证Cyclin B和Cyclin A基因的表达变化结果图，其中M分子量标记，C对照，S样品；图11为5，7，4-三羟异黄酮药物抑制PC3癌细胞的基因通路图。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式的快速分析抗肿瘤中药作用机理的DNA芯片的基因类型、参数详见表1～2。
具体实施方式
二.本实施方式按照下述步骤快速分析抗肿瘤中药作用机理一、选择抗肿瘤中药作为工具药物，它们可以是亚砷酸注射液、紫杉醇注射液、寄生多肽、土槿皮酸、5，7，4-三羟异黄酮、大豆皂甙、大豆甾醇等中的一种或几种。二、本发明采用的筛选抗肿瘤药物的细胞株是目前常用的肿瘤细胞株，它们是早幼细胞白血病HL-60、慢性髓细胞性白血病K-562、肝癌HepG2、胃腺癌BGC823、乳腺癌Bcap-37、卵巢癌HO8910、前列腺癌PC3、宫颈癌Hela等中的一种或几种。三、用上述抗肿瘤中药分别作用于细胞模型后，利用CCK8方法筛选出各工具药物相应的敏感细胞系，依据其半抑制浓度值IC50。
公式抑制率(％)＝(对照组OD值-用药组OD值)/对照组OD值×100四、用上述实验获得的药物IC50浓度处理相应肿瘤细胞系，提取mRNA，与DNA芯片杂交，检测药物作用下基因表达水平变化。具体步骤肿瘤细胞用中药相应的IC50浓度处理5分钟，30分钟，1小时，2小时，4小时，8小时，12小时，24小时后，利用RNeasy RNA试剂盒提取各时间段总RNA，通过紫外分光度计检测RNA的Ratio值。进一步利用Oligotex mRNA Midi试剂盒纯化分离mRNA，选取Cy3和Cy5为荧光物，进行后标记，利用紫外分光光度计检测标记效率。探针与杂交液(含50％甲酰胺)均匀混合，平铺于芯片表面，盖上Takara的芯片专用盖玻片，置于42℃避光水浴20小时进行杂交。取出杂交后的芯片，利用严谨的洗片方法进行后处理，自动化的洗片机保证芯片之间的差异程度降到最低。经过洗涤后的芯片立刻用Axon4000A型扫描仪进行扫描，采集数据，获得药物对特定细胞株的基因表达谱。根据生物信息学聚类分析，获得药物作用细胞株后，具有表达规律的靶基因。利用Western blot(免疫印记)以及RT-PCR(反转录聚合酶链反应)验证这些基因的表达规律，推测中药抑制癌细胞的分子机理。
具体实施方式
三本实施方式以5，7，4-三羟异黄酮药物为例，对本发明做详细说明一、制备DNA芯片1、本实施方式使用17000个PCR扩增产物作为点样DNA(基因类型、参数详见表1～2)，用50％DMSO(二甲基亚砜)将PCR产物溶解至浓度为0.2μg/μl～0.5μg/μl，成为点样工作液(注PCR产物点样前应变性99.9℃5min，迅速放于冰上)。2、将点样工作液按所需要的点阵模式进行排列，转移到384孔的微孔板中，即可开始点样(温度20～23℃，相对湿度40～50％)，采用Telechem公司的醛基化玻片进行点样。3、点样完毕后，玻片在室温防尘条件下放置过夜，放置一周更好。4、取出过夜放置的玻片，以60mJ/cm2的能量进行紫外交联两次。5、芯片的后处理(在做芯片的后处理前应在玻片上标记好DNA点阵的位置，因为后处理后点阵将看不到)①紫外交联固定后，将玻片在0.2％SDS(十二烷基磺酸钠)溶液中润洗2次，每次2min，以去掉未结合上的DNA；②将玻片在灭菌去离子水中室温洗2次，每次2min；③将玻片放入95～100℃(刚停止沸腾)的水中，水浴2min，使DNA变性；④取出玻片，室温放置5min，使之冷却；⑤将玻片置于新鲜配制的NaBH4溶液(1.5克NaBH4溶于450ml PBS(磷酸盐缓冲液)溶液中，然后加入133ml 100％乙醇)中，处理5分钟以封闭自由醛基；⑥将玻片置于0.2％SDS中润洗3次，每次1min；⑦将玻片置于灭菌去离子水中润洗2次，每次1min；⑧700rpm/min离心干燥3min，得到可供使用芯片，芯片在室温下防尘保存。
二、CCK-8法分析5，7，4-三羟异黄酮对不同的癌细胞的杀伤抑制率1、经过文献检索以及实验分析，5，7，4-三羟异黄酮微溶于水，而易溶于Na2CO3，将其配成母液10mM，然后经过滤膜过滤除菌；2、CCK-8法分析5，7，4-三羟异黄酮对不同的癌细胞的杀伤抑制率，IC50(50％抑制率)检测；CCK-8实验步骤①细胞计数；②播种5.6×104细胞/ml，每孔90ul，放置于培养箱(37度，5％的CO2)培养24h；③加药每孔10ul混匀，放置于培养箱培养48h；④加CCK-8溶液每孔10ul混匀，注意不要产生气泡，放置于培养箱培养4h(CCK用之前要37度水浴5min)；⑤于酶标仪450nm进行读数，从而得出细胞存活率。药物浓度(五个不同梯度)见图1～3。3、5，7，4-三羟异黄酮药物导致AGZY癌细胞凋亡的确认通过DNA ladder(DNA片断化)以及AGZY细胞形态检测来检测凋亡(见图4～6)。4、处理时间选取通过对PC3细胞进行5分钟，30分钟，1小时，2小时，4小时，8小时，12小时，24小时药物处理，利用RNeasy RNA试剂盒提取各时间段总RNA，通过紫外分光度计检测RNA的Ratio(比值)值，进一步利用Oligotex mRNA Midi试剂盒纯化分离mRNA。
三、探针标记及芯片杂交实验将各时间点样本mRNA(信使核糖核酸)和原始细胞reference RNA(参考RNA)进行杂交分析。步骤如下(1)用amino allyl-dUTP(氨基酰脱氧尿苷酸，AA dUTP)修饰cDNA引物退火①在冰上于1.5ml离心管中加入以下成分mRNA(500ng，小于9μl) Xμl随机引物 1μloligo(dt)(寡聚脱氧胸腺嘧啶) 1μl水(试剂盒提供)Yμl总体积11μl注意如使用总RNA，则略去随机引物，oligo(dT)的使用量为3μl；②用吸头上下轻轻混匀；③反应体系于70℃温育5min；④室温冷却10min，使引物与mRNA模板退火；⑤离心15s。
延伸①在以上的反应体系中加入以下成分(最后加酶)5Xbuffer(缓冲液) 4μl0.1M DTT(二硫苏糖醇) 2μlNucleotide mix(核苷酸混合物) 1μlAA-dUTP(氨基酰脱氧尿苷酸) 1μl反转录酶 1μl总体积20μl②用吸头轻混，离心15s，过激混将使酶降；③42℃温育1.5小时；④将cDNA(互补DNA)放于冰上立即纯化或-20℃储存。
(2)纯化amino allyl修饰的cDNA
降解mRNA①水浴调整至37℃；②在每个反应管中加2μl 2.5M NaOH；③用漩涡混合器混匀，离心15s；④37℃温育15min；⑤在每个反应管中加入10μl 2M HEPES；⑥用漩涡混合器混匀，离心15s；⑦cDNA现在可以用来纯化或者贮存于-20℃。
用GFX纯化试剂盒纯化cDNA(在用GFX纯化之前，需准备新配置的0.1M，pH＝9.0的NaHCO3)①在每个柱上加500μl capture buffer(捕捉缓冲液)；②将未纯化的cDNA转移至柱上，上下吸5次混匀；③13 800g离心30s；④弃去管底部的液体，将柱重新放入收集管；⑤加600ul 80％的乙醇，13 800g离心30s；⑥弃去液体，重复步骤5，共洗3次，最后一次洗后，弃去液体，将管重新放入同一收集管；⑦13 800g离心15s，除去残留乙醇，弃掉管；⑧将GFX柱转移至新管，加60μl 0.1M NaHCO3，使液体覆盖整个膜；⑨室温1～5min，13 800g离心1min收集纯化的aminoallyllabelled cDNA(氨基酰标记的cDNA)；⑩立刻进行以下的反应。
(3)用Cy3、Cy5标记amino allyl修饰的cDNA后标的偶联反应(避光操作)①将cDNA直接放入CyDye NHS ester(Cy染料NHS酯)的1.5ml管中，用吸头反复重悬数次，13 800g离心1分以使所有液体收集于底部；②室温避光作用60～90min；③加15μl 4M的羟胺于每个反应管；④上下吸数次混匀，室温暗处作用15min；⑤继续以下的纯化反应。
纯化荧光标记的cDNA(用CyScribe GFX纯化试剂盒，wash buffer在使用前加入40ml的无水乙醇，加后密封以防挥发)①将GFX柱放入干净的收集管，加500ul capture buffer(捕捉缓冲液)；②将未纯化的cDNA(20-100μl)转移至每个柱，用吸头轻柔混五次；③立即于13 800g离心30s，cDNA探针在capture buffer中超过10min将会使产量降低；④弃去底部液体，将柱重新放入收集管；⑤加600μul的wash buffer(冲洗缓冲液)，13 800g离心30s；⑥重复步骤⑤，共需洗三次，不要缩减洗的次数；⑦最后一次洗后，另需离心10s以充分除去wash buffer；⑧将柱转移至新的收集管，加60μl的elution buffer(洗脱缓冲液)，使其覆盖整个膜，将elution buffer预热至65度将会使收率提高5％；⑨室温作用1～5min，13800g离心1min收集标记的cDNA；⑩重复步骤⑨，在260nm下检测cDNA浓度，649nm和550nm分别检测Cy5和Cy3的掺入率。
(4)杂交及洗片杂交①将标记的两管cDNA合并成一管，避光将cDNA蒸干；②将cDNA溶解于6μl无核酸酶的水中；③95℃变性2min；④冰上冷却30s；⑤加1.5μl的polyA(多聚腺苷酸)(1mg/ml)以封闭polyT(多聚胸腺嘧啶)尾巴，混匀，75℃作用45min；⑥加7.5μl的杂交缓冲液(提供好的)和15μl 100％的甲酰胺，混合均匀，离心15s；⑦铺片，不要有气泡(将Takara的盖玻片盖于杂交区域，然后用移液器从盖玻片两侧分别注入一半体积的杂交液)；⑧42℃湿盒中杂交16～18h，注意避光。
洗片尽量采用严谨的洗片程序。①先在250ml预热至55℃的1×SSC(氯化钠/柠檬酸钠缓冲液)+0.2％SDS(十二烷基磺酸钠)中洗10分钟；②然后在预热至55℃的0.1×SSC+0.2％SDS中洗两次，每次洗10分钟；③室温在0.1×SSC中洗两次，每次1分钟；④最后在ddH2O(双蒸水)中浸一下(小于10s)；⑤短暂离心干燥。
四、用Axon4000A型扫描仪进行扫描，采集数据见图7，经过双通道激光扫描仪在波长为650nm与550nm分别扫描后，得到组图中代表性的一张表达谱芯片荧光图。
五、生物信息学分析经生物信息学数据分析，显示5，7，4-三羟异黄酮药物抑制PC3癌细胞，一些与血管生成密切相关的基因表达明显下调，如血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF-β)和骨衍生生长因子(BDGF)等等。而与细胞生长周期相关的基因也有明显变化，如细胞周期素A(cyclin A)、细胞周期素B(cyclin B)以及细胞分裂周期基因25(CDC25)的表达下调，然而细胞周期素G2(cyclin G2)的表达则上调了。
六、RT-PCR验证RT-PCR验证分析芯片得到的表达差异基因，TGF-β，VEGF，Cyclin B，Cyclin A的变化，见图8～10。
七、分析5，7，4-三羟异黄酮药物抑制PC3癌细胞的基因通路，由图11可以看出，红色表示基因表达上调，绿色表示基因表达下调，Genistein染料木素降低CDC25及cyclin B的表达，上调cyclin G2的表达，从而抑制PC3细胞的生长；而且还能通过降低VEGF，BPGF和TGF-β来抑制肿瘤血管的生成达到抗肿瘤的目的。
表1. 17000个基因芯片的基因类别
权利要求
1.一种快速分析抗肿瘤中药作用机理的DNA芯片，其特征在于所述DNA芯片由下述具有转录，细胞周期，癌基因和肿瘤抑制基因，应激反应蛋白，DNA合成、重组和修复，凋亡相关蛋白，细胞黏附受体蛋白，细胞信号传导，细胞外通讯蛋白，细胞受体，细胞骨架/迁移蛋白，免疫系统蛋白，膜通道和转运蛋白，代谢，翻译后修饰/蛋白折叠，细胞交通定位，DNA结合及染色质蛋白，细胞外基质转运蛋白，细胞内传导/效应/调节子，细胞表面抗原，RNA处理、周转和转运，翻译，蛋白周转，其他功能，和细胞外基质生物学功能的基因片段组成。
2.根据权利要求1所述的快速分析抗肿瘤中药作用机理的DNA芯片，其特征在于所述DNA芯片的参数为探针基因类型双链cDNA；cDNA片段长度≥500bp，平均1.4kb；基质玻片；点数17000；包含基因数17000；阳性对照50；阴性对照50；管家基因30；比值变化标准4；质控基因重复次数12；检测方法双色荧光竞争杂交法。
3.根据权利要求1所述的快速分析抗肿瘤中药作用机理的DNA芯片，其特征在于所述具有转录生物学功能的基因片段的数目为1547；具有细胞周期生物学功能的基因片段的数目为412；具有癌基因和肿瘤抑制基因生物学功能的基因片段的数目为423；具有应激反应蛋白生物学功能的基因片段的数目为510；具有DNA合成、重组和修复生物学功能的基因片段的数目为345；具有凋亡相关蛋白生物学功能的基因片段的数目为417；具有细胞黏附受体蛋白生物学功能的基因片段的数目为506；具有细胞信号传导，细胞外通讯蛋白生物学功能的基因片段的数目为678，具有细胞受体生物学功能的基因片段的数目为1697；具有细胞骨架/迁移蛋白生物学功能的基因片段的数目为524；具有免疫系统蛋白生物学功能的基因片段的数目为346；具有膜通道和转运蛋白生物学功能的基因片段的数目为667；具有代谢生物学功能的基因片段的数目为1482；具有翻译后修饰/蛋白折叠生物学功能的基因片段的数目为534；具有细胞交通定位生物学功能的基因片段的数目为742；具有DNA结合及染色质蛋白生物学功能的基因片段的数目为379；具有细胞外基质转运蛋白生物学功能的基因片段的数目为411；具有细胞内传导/效应/调节子生物学功能的基因片段的数目为1669；具有细胞表面抗原生物学功能的基因片段的数目为422；具有RNA处理、周转和转运生物学功能的基因片段的数目为473；具有翻译生物学功能的基因片段的数目为413；具有蛋白周转生物学功能的基因片段的数目为633；具有其他功能生物学功能的基因片段的数目为1112；具有细胞外基质生物学功能的基因片段的数目为326。
4.利用权利要求1所述DNA芯片快速分析抗肿瘤中药作用机理的方法，其特征在于所述分析抗肿瘤中药作用机理的方法按照下述步骤进行分析一、选择权利要求1所述的DNA芯片作为分析抗肿瘤中药作用机理的芯片；二、选择临床常规使用的以及民间流行的抗肿瘤中药作为工具药物；三、选择常用的肿瘤细胞株作为细胞模型；四、用上述抗肿瘤中药分别作用于细胞模型后，利用CCK8方法筛选出各工具药物相应的敏感细胞系，提取mRNA，与DNA芯片杂交检测药物作用的基因；五、应用生物信息学对药物反应基因进行统计和分类；六、依据药物标志基因和特异性肿瘤基因的变化规律，进行分子细胞水平的机理验证。
5.根据权利要求4所述的利用DNA芯片快速分析抗肿瘤中药作用机理的方法，其特征在于所述抗肿瘤中药为亚砷酸注射液、紫杉醇注射液、寄生多肽、土槿皮酸、5，7，4-三羟异黄酮、大豆皂甙、大豆甾醇中的一种或几种。
6.根据权利要求4所述的利用DNA芯片快速分析抗肿瘤中药作用机理的方法，其特征在于所述肿瘤细胞株为早幼细胞白血病HL-60、慢性髓细胞性白血病K-562、肝癌HepG2、胃腺癌BGC823、乳腺癌Bcap-37、卵巢癌HO8910、前列腺癌PC3、宫颈癌Hela中的一种或几种。
全文摘要
快速分析抗肿瘤中药作用机理的DNA芯片及其方法，它属于生物工程技术领域。为解决传统的分子生物学技术均无法在同一时间内分析大量的基因表达变化的缺陷，本发明的DNA芯片所涉及到的基因包括凋亡、细胞周期调控、药物转化代谢等，分析抗肿瘤中药作用机理的方法为选择抗肿瘤中药作为工具药物，肿瘤细胞株作为细胞模型；用上述抗肿瘤中药分别作用于细胞模型后，筛选出各工具药物相应的敏感细胞系，然后用基因表达谱芯片检测药物作用的基因；应用生物信息学对药物反应基因进行统计和分类；依据药物标志基因和特异性肿瘤基因的变化规律，进行分子细胞水平的机理验证。本发明可缩短药物研究开发周期及减少药物研究开发费用，加快中药进入国际市场。
文档编号C12Q1/68GK1766121SQ20051001042
公开日2006年5月3日 申请日期2005年10月12日 优先权日2005年10月12日
发明者韩俊, 李昌利, 顾雪锋, 李克深, 闫作梅, 于小丽, 杨光 申请人:哈尔滨基太生物芯片开发有限责任公司