专利名称：芯片上分离实体分子的方法和所需器件和试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物分离领域，特别是在芯片上对实体分子进行介电电泳和磁力分离。
在对生物样品或是环境样品进行基因分析、生化分析或是生物分析中，样品制备是其中必不可少的环节。样品制备常常需要从混合体系中分离出感兴趣的样品组分。这项工作费时费力，难以自动化。在许多应用中，样品制备步骤需要对样品中的一种或是几种组分进行适当的纯化以便于下一步的分析。介电电泳，有时为了与“行波介电电泳”区分，也称为“常规介电电泳”，可以在非均匀幅值电场中对电中性或是带电微粒进行输运和定位。根据样品的介电性质，介电电泳和行波介电电泳可以提供一种高效、可靠、自动化的方法，用以分离样品中的微粒，并且不会破坏微粒的结构。
介电电泳和行波介电电泳已经被用于从血液中分离乳腺癌细胞(Becker et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92860-864(1995))；从血细胞中分离细菌(Hawkes et al.，Microbios.7381-86(1993)and Chenget al.，Nat.Biotech.16546-547(1998))；从血液中富集具有CD34活性的干细胞(Stephens et al.，Bone Marrow Transplantation 18777-782(1996))；收集病毒颗粒、亚微米级珠体和生物分子(Washizu，et al，IEEETrans.Ind.App.30835-843(1994)，Green and Morgan，J.Phys.DAppl.Phys.30L41-L44(1997)，Hughes et al.，Biochim.Biophys.Acta1425119-126(1998)，and Morgan et al.，Biophys.J.77516-525(1999)。以下专利也使用了介电电泳的方法分离微粒(包括细胞)(U.S.Patent No.4,390,403 issued Jun.28，1983；U.S.Patent No.4,326,934 issued April 27，1982 to Pohl；U.S.Patent No.5,344,535issued Sept.6，1994 to Betts and Hawkes；U.S.Patent No.5,454,472issued Oct.3，1995 to Benecke et al.；U.S.Patent No.5,569,367 issuedOct.29，1996 to Betts et al.；U.S Patent No.5,653,859 issued Aug.5，1997；U.S.Patent No.5,795,457 issued Aug.18，1998 to Pethig，et al.；U.S Patent No.5,814,200 issued Sep.29，1998 to Pethig et al.；U.S.Patent No.5,858,192issued Jan.12，1999 to Becker et al.；U.S.Patent No.5,888,370 issued Mar.30，1999；U.S.Patent No.5,993,630 issued Nov.30，1999 to Becker et al.；U.S.Patent No.5,993,631 issued Nov.30，1999to Parton et al.；and U.S.Patent No.5,993,632 issued Nov.30，1999 toBecker et al)。
介电电泳是指极化的微粒在交流电场(具有不均匀的幅值)中的平移运动。当微粒置入电场，如果微粒和其周围介质的介电性质存在一定的差异，微粒就会被极化。这样，在微粒-介质界面就会诱导出电荷。如果外加电场是非均匀的交流电场，那么，微粒被诱导出的电荷与外加电场相互作用，就会使微粒受到的净作用力不为零，从而使微粒向强场或是弱场区域移动。微粒所受到的净作用力称为介电电泳力，而微粒的运动被称为介电电泳。微粒所受的介电电泳力由微粒本身的介电性质、微粒周围介质的介电性质、外加电场的频率、幅值分布决定。在文献中，介电电泳有时也被称为常规介电电泳(例如，Wang et al.Biochim.Biophys.Acta 1243185-194(1995))。为了简单起见，在本专利中，我们用“介电电泳”来指极化的微粒在非均匀电场中的运动。相应的作用于极化微粒上的力称为“介电电泳力”。
利用介电电泳原理的分离技术有介电滞留(或称介电吸引)、介电迁移和介电电流/重力场流分离(DEP/G-FFF)技术。介电滞留技术是指，一种或多种样品微粒由于受到正向介电电泳力，从而被吸引到并保持在芯片或是反应池(chamber)的强场区域，通常是电极边缘区域。在使用介电滞留技术的分离过程中，样品中受到负向介电电泳力或是微弱正向介电电泳力的组分随着场流被带出反应池。在介电迁移中，微粒基于自身所受到的不同介电电泳力而得以分离。例如，一种或多种微粒由于受到负向介电电泳力而迁移到反应池的某一区域，而另外一种或多种微粒由于受到正向介电电泳力而迁移到反应池的另一区域。在介电电泳/重力场流分离(DEP/G-FFF)中，微粒由于受到负向介电电泳力，在反应池中处于不同高度，而反应池中不同高度的介质具有不同的迁移率，从而实现微粒的场流分离。
行波介电电泳(TW-DEP)，和上述的介电电泳(或有时称为常规介电电泳)相关，又称为“行波场迁移”或是“TWFM”。行波介电电泳的电场具有非均匀的相位分布。行波电场作用于微粒上带有的由电场引发的极化电荷，从而使得微粒受到相应的作用力，使得微粒沿着或是逆着行波电场的传递方向运动。微粒所受的行波介电电泳力由微粒本身的介电性质、微粒周围介质的介电性质、行波电场的频率、幅值和相位分布决定。在“二维介电电泳”(2-D DEP)中，微粒分离是通过在微粒上同时施加介电电泳力和行波介电电泳力实现的。(De Gasperis et al.，Biomedical Microdevices 241-49(1999))。另外，在“二维介电电泳”中，微粒也是处于一个流动场中。
介电电泳和行波介电电泳的理论和使用介电电泳对微粒进行操纵的方法可以参见以下参考文献Wang et al.Biochim.Biophys.Acta1243185-194(1995)；Wang et al.IEEE Transaction on IndustryApplications 33660-669(1997)；Huang et al.J.Phys.DAppl.Phys.261528-1535；Fuhr et al. Sensors and Materials 7131-146；Wang et al.Biophys.J.721887-1899(1997)；and Becker et al.Proc.Natl.Acad.Sci.92860-864(1995)。
待操纵的微粒包括人造粒子、晶体、胶体、分子、化合物、分子复合物、细胞和细胞器。使用介电电泳和行波介电电泳对微粒的操纵方式包括浓缩、聚集、捕获、推斥、悬浮、分离，或是使微粒作线性或其它定向的运动。微粒可被捕获、富集在反应池中的特定区域。微粒可以在精细水平上被细分为各个亚类，也可以在一定的距离上得到输运。用于特异微粒操纵所需的电场分布可以通过相关的介电电泳理论和电场模拟方法进行设计，具体应用中电场的分布由电极的尺寸和几何形状决定。
在许多情况下，由于样品中待分离的实体分子(如细胞和分子)的介电性质相近，仅仅通过介电电泳力和/或行波介电电泳力难以将样品中的各个组分分开。在另一些情况中，由于待分离的实体分子的尺寸较小，也难以从样品中分离。因为实体分子所受的介电电泳力的大小正比于待输运或定位的实体分子的尺寸，所以较小尺寸的实体分子，如分子(例如核酸分子和蛋白质)的操纵需要施加强电场，即需要施加高压。而高压会破坏生物物质，如细胞。高压还会带来热效应，使介质升温，可能对生物或非生物物质都有一定的破坏。所以需要一种可以对各种尺寸、各种介电性质的实体分子进行高效分离的方法。
血液样品的分离和分析是样品分离和分析领域极具挑战性的课题。血液样品很容易获得，并且可以提供大量的和代谢状况相关的、遗传学的、具有诊断和疾病预测价值的信息。
但是，血液中包含的丰富的无细胞核的红细胞，以及大量的血红蛋白却妨碍了基因、代谢、诊断试验的正常进行。去除血液中的红细胞可以通过离心和过滤的方法，这些附加的步骤一般比较难以自动化。在其它一些步骤中，通过先使红细胞胞解然后离心收集其它细胞的方法从血液样品中获得红细胞。这些红细胞胞解缓冲液对白细胞有一定的副作用。这就要求对白细胞的分离必须限定在一定的时间内完成，以避免白细胞被破坏，这就给分析样品的实验者带来很大不便。另外，离心过程需要的附加步骤比较难以实现自动化。
本发明与本申请人在1999年9月16日递交的99120320.8号中国专利申请和2000年8月8日递交的00122631.2号中国专利申请是相关联的，本发明的工作是对上述申请的延续。该两份申请的内容在此引作参考。
本发明充分考虑到了样品中各个组分的分离可以为样品分析带来便利，有时这种分离对于样品分析而言是必须的。基于样品中实体分子的介电性质，介电电泳分离技术可以提供一种高效、可靠、自动化的方法，用以分离样品中的实体分子，并且不会破坏实体分子的结构。本发明给出了对样品中的实体分子进行介电电泳分离的改进的方法和所需的器件和试剂。
首先，本发明给出了这样一种溶液，溶液应满足如下的需求当和样品混合后，可以改变样品中一种或是多种组分的介电性质；溶液的电导率也要合适，以使得样品中的一种或多种实体分子可以通过介电电泳方法得以分离；溶液可以用于芯片上的样品分析；还有当分析需要使用结合物，包括可以被介电电泳力、行波介电电泳力或是电磁力操纵的微粒时，这种溶液也能适用。
其次，本发明给出了一种可以对样品中一种或多种实体分子进行介电电泳分离的方法，其中使用了可以改变样品中一种或是多种组分介电性质的溶液，并且这种溶液具有适当的电导率，样品中的实体分子可以利用介电电泳力或行波介电电泳力在其中得以分离。本方法还可以使用能和实体分子耦联的，并且可以被介电电泳操纵、定位的微粒。
再次，本发明给出了一种使用可以与被分离的实体分子结合的磁珠对样品中的一种或多种实体分子进行分离的方法，该方法同时也使用了一种可以修饰红细胞的溶液以及使用了电磁力。电磁力可以由用于分离的芯片上的电磁部件或结构产生。
图1显示了本发明的一种设计方案，其中本发明所述的样品溶液通过支路被加入血液样品，混合液随后被通入含有相互交错的平行电极阵列的芯片上，白细胞通过介电滞留技术得以分离。
图2显示了本发明的另一种设计方案，样品溶液和一组微粒先被加入血液样品，然后再将混合液加入多项式电极阵列，利用介电滞留技术对实体分子进行分离。
图3显示了本发明的另一种设计方案，样品溶液先被加入血液样品，然后再将混合液加入螺旋电极阵列，利用介电滞留技术对感兴趣的实体分子进行分离。
图4显示了本发明的另一种设计方案，样品溶液先被加入血液样品，然后再将混合液利用行波介电电泳技术对实体分子进行分离。
图5显示了本发明的另一种设计方案，样品溶液和一组磁珠先被加入血液样品，然后再利用电磁力对样品中的实体分子进行分离。
定义除非特殊说明，否则本文中所有的技术和科技术语都和本发明所属的领域中的意义一致。通常，本文中和生产/试验过程所使用的术语在本领域内都是被熟知的。本发明过程中使用了一些传统的方法，见所引用的技术或是综合性的参考文献。方位用语“上”和“下”，或是“上方”和“下方”诸如此类的用法都是指所使用的器件的部件的方位。如下描述的在本文中和试验过程中使用到的术语在相关领域中都是很常用的。当参考文献中的术语和本文中的定义有差异时，在本文中所使用的术语以本文的定义为准。下列术语，除非另外加以特殊说明，否则都以以下的说明为准“低渗透压”溶液是指相对于血细胞是低渗的溶液，通常渗透压低于300mOsm。
“可选择性胞解红细胞的溶液”是指这样一种溶液，当该溶液和包括红细胞的样品混合后，红细胞发生胞解、在细胞膜上打孔使其通透性增强，或其它作用从而使得样品中的红细胞的完整性被破坏。这样，样品混合液中的红细胞就不会对用以分离其它细胞或实体分子的介电电泳力发生响应。
“低电导率”溶液是指一种在一定的介电电泳分离条件下，感兴趣的实体分子可以在其中进行正向介电电泳。最好，低电导率的溶液的电导率介于1μS/cm至1S/m之间；更好溶液的电导率介于5μS/cm至0.5S/m之间；最佳情况是，溶液的电导率介于10μS/cm至0.1S/m之间。
“介电电泳”是极化微粒在非均匀幅值电场中的运动。通常有两种形式的介电电泳，正向介电电泳和负向介电电泳。在正向介电电泳中，微粒受介电电泳力的作用向强场区域运动。在负向介电电泳中，微粒受介电电泳力的作用向弱场区域运动。微粒作正向还是负向介电电泳，是由微粒和介质的相对极化程度决定的。
“介电电泳力”是在非均匀幅值交流电场中极化微粒受到的力。非均匀电场中，半径为r的微粒受到的介电电泳力 可以表示为 其中Erms是场强的均方根值，符号是表示梯度操作的符号，εm是介质的介电系数。xDEP是微粒的极化因子，可以表示为xDEP=Re(ϵp*-ϵm*ϵp*+2ϵm*)]]>这里Re指复数的实部，符号εx*＝εx-jσx/(2πf)是复式介电系数(其中x＝p对应于微粒，x＝m对应于介质)。参数εp、σp分别是微粒的有效介电系数和电导率(可能与外加频率有关)。例如，典型的生物细胞将具有与频率相关的电导率和介电系数(至少部分上是由于细胞质膜极化引发的)。
以上描述介电电泳力的公式还可表示为 其中p(z)是电极上单位电压激励(电压V＝1V)的电场值平方的分布，V是外加电压。
“行波介电电泳力”是指在行波电场中的分子或微粒上受到的力。理想行波场的特征是，交流电场分量的相位值是微粒所处位置的线性函数。对一个半径为r，受行波电场 (即E场的x分量沿z方向行进，x分量的相位值沿z向是位置的线性函数)作用的微粒来说，作用在其上的行波介电电泳力 为FωTW-DEP=-4π2ϵmλ0r3ζTWDE2·aρz]]>其中E是场强大小，εm是介质的介电系数，ζrwDEP是微粒的行波介电电泳极化因子ζtwDEP=Im(ϵp*-ϵm*ϵp*+2ϵm*)]]>其中Im指相应复数的虚部，符号εx*＝εx-jσx/(2πf)是复式介电系数，参数εp、σp分别是微粒的有效介电系数和电导率(可能与外加频率相关)。
在排布在芯片上的微电极上施加合适的交流信号就可以产生行波电场。为了产生行波电场，至少在电极上应施加三组不同相位值的电信号。一个行波电场的例子中，使用了四种不同相位值的电信号(分别为0、90、180、270度)，施加在四个线状的排布在芯片表面的平行电极上，这样的四个电极可以作为一个基本的重复单元用以芯片设计。根据应用的需要，可以把两个以上这样的单元排列起来，从而在电极的上方或是附近产生行波电场。只要把电极单元在空间上按照一定的次序排列起来，外加的不同相位的信号就可以在电极附近区域产生行波电场。
“电场图”是指电场分布，它是电场频率、电场幅值、电极结构的几何形状和电场调制的频率和/或幅值的函数。
实体分子的“介电性质”至少部分是由实体分子对电场的响应决定的。实体分子的介电性质包括实体分子的有效电导率和有效介电系数。对于由相同或是相似结构组成的复合物，例如，聚苯乙烯珠体，它的有效电导率和有效介电系数和至少在很大的范围内(例如1赫兹到100兆赫兹)与电场频率无关。具有均一成分的微粒具有表面净电荷，当这些带电微粒悬浮在介质中，在微粒/介质的接触面将形成电双层。外加电场与该电双层相互作用导致了微粒有效电导率和有效介电系数的改变。外加电场与电双层的相互作用通常是与频率有关的，因此，微粒有效电导率和有效介电系数也与频率有关。对于由不同组分构成的复合物，例如，细胞，它的有效电导率和有效介电系数由两部分组成，即细胞膜的有效电导率和有效介电系数和细胞内部的有效电导率和有效介电系数，并且和电场的频率相关。此外，电场中实体分子所受的介电电泳力和实体分子的尺寸相关，这样，实体分子的尺寸也应被考虑在实体分子的介电性质之中。对实体分子的介电性质有贡献的实体分子的性质包括它所带的净电荷、它的组成(包括所带的化学基团、其它实体分子等等)、它的尺寸、表面参数、表面所带电荷。
“磁场力”是指微粒在磁场中受到的作用力。通常，为了使用磁场力操纵微粒，微粒必须具有磁性或是被磁化。对于一个典型的由顺磁材料制成的磁珠，当这个微粒处于磁场感应强度为 的磁场中，感应出的磁偶极子 可以表示为 =Vp(xp-xm)Hρm]]>其中Vp是微粒的体积，xp和xm分别是微粒和其周围介质的体积磁化系数，μm是介质的磁导率， 是磁场强度。微粒所受的磁场力Fmagnetic由瞬时磁偶极子和磁场梯度决定 其中＂·＂和＂＂分别表示点乘和梯度操作符。微粒是否受到磁场力的作用是由微粒和周围介质的体积磁化系数的差异决定的。通常情况是，微粒(体积磁化系数大大超过零)悬浮在液态、非磁性的介质中(介质的体积磁化系数近似为零)，这样微粒就受到磁场力的作用。当微粒所受的磁场力和液体粘滞力达到平衡时，微粒的速度νparticle可以表示为 其中r是微粒的半径，ηm是微粒周围介质的粘度。
样品的“组分”或“样品组分”是指样品的任何组成部分，可以是离子、分子、化合物、分子复合物、器官、病毒、细胞、聚合体、或任何类型的微粒，包括胶体、聚合体、微粒体、晶体、矿物体等。样品的成分在样品介质或提供的样品缓冲或样品溶液中可以是可溶的也可是不可溶的。样品的成分可以是气体、液体、或固体形式的。
“实体分子”或是“感兴趣的实体分子”是指任何可以用介电电泳力、行波介电电泳力或是电磁力进行操纵的特定物质分子。实体分子可以是固体，包括悬浮的固体，也可以是以溶解状态存在。实体分子可以是分子，可被操纵的分子包括，但不仅仅限于，无机分子(包括离子和无机化合物)，也可以是有机分子，包括氨基酸、肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、糖脂蛋白、脂、脂肪、固醇、糖、碳水化合物以及其它小分子或是复杂的有机分子。实体分子也可以是分子复合物，比如细胞器、一种或多种细胞(包括原核和真核细胞)、病原体(包括病毒、寄生虫、朊蛋白或是这些物质的一部分)；实体分子也可以是晶体、矿物质、胶体、碎片等等，可以由一种或是多种无机物质如聚合物、金属、矿物、玻璃、陶瓷等等组成；实体分子也可以是分子聚集体、复合物、细胞、细胞器、病毒、病原体、晶体、胶体或是其它碎片。细胞可以是任何种类的细胞，包括原核和真核细胞。其中真核细胞也可以是任何类型。通常感兴趣的细胞包括，但不仅仅限于，白细胞、恶性细胞、干细胞、分化早期细胞、胎儿细胞、被病原体感染的细胞、细菌细胞等等。
“细胞内实体分子”是指位于细胞内的实体分子，即位于细胞质或细胞器基底中，附着在任何细胞内膜上，位于质膜(如果存在)上，或是位于细胞表面，即附着在细胞质膜或细胞壁(如果存在)的外表面上。
“操纵”是指移动和处理这些实体分子，从而导致实体分子在芯片上(包括在单芯片上或多集成芯片上或之间，在基底上或在装置中的多个基底之间)作一维、二维或三维方向上的运动。“操纵”包括，但不仅仅限于，输运、聚焦、富集、浓缩、聚集、捕获、推斥、悬浮、分离、分馏、隔离、线性或是其它方向上的实体分子的移动。为了实现高效的操纵，待操纵的实体分子和施加于其上的物理力应是协调的。例如，具有磁性的实体分子可以施加以磁力。相似的，具有电荷的实体分子可以施加以静电力(即电泳力)。在操纵连接物—实体分子复合物的情况中，这些实体分子或相应的连接物的性质和用于操纵的物理力必须是协调的。例如，实体分子或它的连接物具有一定的介电性质，可以介电极化的，可以使用介电电泳力。
“待操纵的实体分子与连接物的表面充分结合”是指一定百分比的待操纵的实体分子结合在连接物的表面并且可以用适当的物理力通过操纵连接物进而实现对实体分子的操纵。通常，至少0.1％的待操纵的实体分子是结合在连接物的表面的。更适宜的是至少1％、5％、10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％的实体分子是结合在连接物的表面的。
“待操纵的实体分子完全结合在连接物的表面上”是指至少90％的待操纵实体分子结合在连接物的表面上。更适宜的是，至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的待操纵实体分子结合在连接物的表面上。
“选择性的修饰红细胞的溶液”是指这种溶液可以改变无核红细胞的性质，使其不干扰血液样品中的其它细胞或组分的介电分离，同时尽可能小的影响白细胞的完整性，或是不影响用介电电泳的方法将白细胞和血液样品中的其它组分分开的过程。
“样品”是指任何可以从中分离或分析出组分的流体。样品可以有各种来源，可来自一个生物体，来自相同或不同种类的一群生物，也可以来自环境，如取自一水体或土壤，或者来自食物或工业材料。样品可以是加工过的，也可以是未加工的。样品可以是气体，液体，半固体，也可以是溶液或悬浊液。样品可以是一种提取物，如取自土壤或食物样品的液体提取物，如咽喉或生殖器的提取物，或如取自排泄物样品的提取物。
“血液样品”在这是指加工过或未加工的血样，比如说，但不仅仅限于，它可以是经过离心、过滤、抽提或其他处理的血液样品，还可以是加入了抗凝血剂，稳定剂等一种或多种试剂的血液样品。血液样品可以是任意体积，来源任意，如动物或人类。首选的材料是来自人类。
“白细胞”是指白血球，或是一类可以在动物血液中找到的既非网织红细胞又非血小板的生血细胞。白血球可包括淋巴细胞，如B淋巴细胞或T淋巴细胞。白血球也可包括吞噬细胞，如单核细胞，巨噬细胞以及包含有嗜碱细胞，嗜曙红细胞，嗜中性粒细胞的粒状白细胞。白血球还包括肥大细胞。
“红细胞”是指红血球。
“肿瘤细胞”是指一类细胞增殖生长比正常细胞快得多的异常细胞，它甚至可以在受到导致新生长停滞的刺激后仍继续生长。与正常组织相比，瘤细胞往往会部分或全部缺乏结构组织和功能协调性，它既可能是良性的也可能是恶性的。
“恶性细胞”是指一类具有局部入侵性和破坏性生长及转移的细胞。
“干细胞”是指一类未发生分化的细胞，它可通过一轮或多轮细胞分化引起生长，生成至少一种分化细胞。
“分化早期细胞”是指一类未发生分化但必然将引起生长的细胞，它通过一轮或多轮细胞分化引起生长，生成至少一种分化细胞。比较有代表性的是，一个干细胞对一个特别的刺激或一系列刺激作出响应，通过一轮或多轮细胞分化生成一个分化早期细胞，然后由这个分化早期细胞对一个特别的刺激或一系列刺激作出响应，生成一个或多个分化细胞。
“病原体”是指任何病原体，如可以感染生物的细菌、病毒、寄生虫或朊蛋白。病原体可导致受其感染的生物出现症兆或处于疾病状态。人类病原体是指可以感染人类的病原体。人类病原体既可以是特异性针对人类的，如特异性人类病原体；又可以是可感染多种生物的，如混杂性人类病原体。
“对象”是指任何生物体，如动物或人类。动物可包括任何动物体，如野生动物，家养动物如猫或狗，农用动物如猪或牛，或者是娱乐用动物如马。
“反应池”是组成芯片的一种结构，它可以容纳液体样品。反应池可以具有各种尺寸，容积从0.001ml至50ml。
“端口”是指反应池体的开口，液体样品可通过它进出反应池。端口可以是任何大小的，但适宜的是可允许样品由吸液管，注射器，导管或其它加样方式加入反应池的形状和尺寸。
“导管”在本专利中是用以将液体由容器转移到反应池的一种方式。导管适宜应用于反应池的端口。导管可由任何允许液体通过的材料组成。比较适宜的导管是管状结构，比如橡胶管、聚四氟乙烯管、或聚乙烯管。导管可以是任意尺寸的，但适宜的是内径在10微米到5毫米之间。
“芯片”是指其上可进行一次或多次处理如物理，化学，生化，生物处理的固体物质。这些处理可以是分析，包括生化的，细胞的，和化学的分析；也可是分离，包括使用电的，磁的，物理的，化学的(包括生化的)作用力或是相互作用；也可以是化学反应、酶反应和结合反应，包括捕获。芯片上制有或集成有诸如槽、通道、电极单元等等微加工结构，在其上可以进行物理的、生物物理的、生物的、化学的反应或是处理。芯片是一块薄片。对芯片的表面积大小的要求并不苛刻，比如从1mm2到0.25m2都可以。最好所用的芯片的表面积从4mm2到25cm2左右。芯片可以具有不同形状，规则的形状如矩形、圆形、椭圆形或其它不规则的形状。芯片表面可以是平的，也可以是不平的。具有不平的表面的芯片在表面上应包括通过在芯片表面进行加工或是蚀刻而得的槽、反应池等结构。
“分离”是指将样品中的一种或多种组分和另外的一种或多种组分在空间上相互分开的过程。分离过程可以这样进行，一种或多种感兴趣的实体分子被定位于分离器件中的某个或某些位置，至少部分样品中的其它组分被定位于其它位置，或是从感兴趣的实体分子所在的位置移开。或者，可以将样品中的一种或多种组分定位在某些位置，而一种或多种感兴趣实体分子从该位置处被移走，再进行收集。也可以将样品中的一种或多种组分定位在某些位置，再将另外的一种或多种感兴趣的实体分子定位到另外的位置。分离可以通过使用物理力、化学力、电场力或是磁场力等等实现，还可以使用重力场、流体、介电电泳力、行波介电电泳力和电磁力等等实现。
“捕获”是指这样一类分离方式，这种方式使一种或多种实体分子滞留在芯片的一个或多个区域内，再施加物理力进行捕获。
“分析”是对样品或样品的一个组分进行的测试。分析可检测某组分的存在与否，某组分的数量或浓度，某组分的组成，以及某组分的活性等等。分析可与本发明的方法和器件、试剂一起使用，包括生物化学分析、结合分析、细胞分析以及基因分析。
“反应”是指可改变一种或多种分子或化合物的化学或生化成分，或者改变一种或多种分子与另外一种或多种分子或化合物间相互关系的化学或生化过程。本发明中的反应可以被酶催化，包括，但不仅仅限于，有降解反应，合成反应，修饰反应或结合反应。
“结合分析”是一种分析方式，它通过将特定物质分子与特异性结合物结合来检测该特定物质分子的存在或浓度，或者检测一特定物质分子与另一特定物质分子的结合可能性，或者检测一特定物质分子与另一特定物质分子的结合亲和力。特定物质分子可指一有机或无机分子，一个由有机、无机或一有机无机复合物，细胞器，病毒或细胞组成的分子混合物。结合分析可以使用可检测的标记或在结合特定物质分子存在下可产生可检测标记的信号发生系统。标准的结合分析包括有依赖核酸杂交来检测特殊的核酸序列，依赖抗体对特定物质分子的结合，以及依赖配体对受体的结合。
“生化分析”是指对一种样品的一个或多个组分的存在、浓度、或活性进行分析的方式。
“细胞分析”是指一种检测细胞过程的分析方式，例如，但不仅仅限于，新陈代谢活性、分解代谢活性、离子通道活性、细胞间信号传导活性、受体介导的信号传导活性、转录活性、翻译活性、或分泌活性等等。
“基因分析”是指一种检测某遗传单元的存在或序列的分析方式。此遗传单元可指DNA或RNA的任意片断，包括，但不仅仅限于，基因、重复序列、转座单元、调控单元、端粒、中心粒或其它具有现在尚未知道功能的DNA或RNA片断。基因分析的例子如(但不仅仅限于这些例子)，核酸杂交技术，包括核酸测序反应，可以使用一种或多种聚合酶，例如基于PCR的基因分析。基因分析可以使用一种或多种可检测的标记，比如，但不仅仅限于，荧光素、放射性同位素或是信号发生系统。
“基因表达分析”(或是称为基因表达谱分析)是对不同基因表达产物如mRNA进行的分析。样品中感兴趣的细胞的多种mRNA被同时检测。不同的应用中，被检测的mRNA的数量和类型都可以不同。
“蛋白表达分析”(或是称为蛋白表达谱分析)是对多种蛋白进行的分析。样品中感兴趣的细胞的多种蛋白被同时检测。不同的应用中，被检测的蛋白质的数量和类型都可以不同。
“电极”是一种由高导电材料制成的结构单元。这里所谓的高导电材料是指材料的导电率远大于周围介质或材料。高导电材料包括金属，如金、铬、铂铝等等，也可以是非金属，如石墨、导电聚合物。电极可以制成各种形状，如矩形、圆形、城堡形等等。电极材料中也可以包括掺杂半导体，如硅片上掺磷。
“槽”是芯片上的结构单元，具有一个较低的表面和一个或多个从底面以一定角度延伸出来的侧面。侧面的参数很随意，例如可以具有S形的或是弯曲的或是具有多个角度的侧面。槽的底面可以低于、高于或是和芯片上表面水平。侧面的材料应和芯片的下表面的材料不同。例如，芯片下表面可以由一层能被电场力(包括介电电泳力、行波介电电泳力和电磁力)穿透的物质构成，而槽的侧面由其它物质组成，如绝缘材料，可以阻碍电场力的穿透。槽的侧面或是芯片上的通道可以由任意适当的材料制成，如硅、玻璃、橡胶、多聚物、塑料、陶瓷、金属等等。
“通道”是一种芯片上的结构单元，具有一个较低的底面和至少两个从底面延伸上来的侧面，侧面的长度比侧面之间的距离要大的多，液体可以从底面和侧面形成的腔体的内部流过。通道可以封闭也可以是开放的。
“连续液流”是指在本发明的分离过程中，流体被连续的泵入或注入反应池。这样，样品中没有被选择性滞留在芯片中的组分就会随着流体被带出反应池。
“连接物”是指任何可以和实体分子以一定亲和性和特异性相连的任何物质，并且可以通过相应的物理力进行操纵。连接物可以是，但不仅仅限于，细胞、细胞器、病毒、微粒、聚合体或复合体，或者分子的聚合体或复合体。
“微粒”是指任何形状，任何组成，具有任何复合结构的微粒，可以通过相应的物理力进行操纵。微粒尺寸可以从大约0.01微米到大约10厘米。更合适的是，在这种方法中的微粒的尺寸从大约0.1微米到大约几千个微米。微粒可以由各种合适的材料制成，例子包括，但不仅仅限于，玻璃、陶瓷、聚合物如尼龙、聚四氟乙烯(TEFLONTM)、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、琼脂糖、纤维素、葡聚糖等等。微粒的例子包括，但不仅仅限于，塑料微粒、陶瓷微粒、碳微粒、聚苯乙烯珠体、玻璃珠、磁珠、中空玻璃珠、金属微粒和微粒复合物、微加工形成的非接触式微结构(“Design of asynchronousdielectric micromotors”，Hagedom et al.，in Journal ofElectrostatics，1994，Volume33，Page 159-185)等。复合成分的微粒是指那些有多种不同成分组成的微粒，例如包被着一层非导电多聚物薄膜的金属球。
“耦联”即结合。例如，实体分子可以和其它微粒进行特异的或非特异的结合。结合可以是共价结合，也可以是非共价结合，是可逆结合也可以是非可逆结合。
“特异结合物”是指这样的两个不同分子中的一个，这样分子的表面具有特定的形态结构可以特异性的和另一分子的空间或极性结构互补结合。特异结合物可以是免疫家族中特异结合的两种物质中的一种，如抗原-抗体、生物素-亲和素、生物素-链霉亲和素、配体-受体、双链核酸、IgG-蛋白A、DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA等等。
“核酸分子”是指多聚核苷酸。核酸分子可以是DNA、RNA或两者的组合。核酸分子也可以包括除了核糖和脱氧核糖外组成骨架链的的糖类，可以是DNA或RNA之外的核苷酸分子。核酸分子可以由自然存在的或非自然存在的核苷酸碱基组成，如黄嘌呤，核苷碱基的延伸物2-氨基酰嘌呤或类似物等。核酸分子可以是肽核酸分子。核酸分子可以是任意长度，可以是单链或双链，或者是部分单链和部分双链。
“可被检测的标记”是一种可以被检测的复合物或分子，它们可以产生输出信号，如荧光、放射性、颜色、化学发光或技术领域现有的或是今后发展出的能产生输出信号的方法。输出可以基于荧光，如通过荧光标记物，例如Cy-3，Cy-5，藻红蛋白，藻蓝蛋白，别藻蓝素，异硫氰酸荧光素(FITC)，罗丹明，或镧系元素等等，但不是仅仅限制于以上物质；也可以通过荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)和它的变体，要基于酶反应的活性，比如，但不仅仅限于β-牛乳糖，β-内酰胺酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶或荧光素酶等等；或者可以基于放射性同位素(如33P，3H，14C，35C，35S，125I，32P或者131I等)。标记物也可以是被其它基团修饰了的碱基，比如，在C5位置修饰嘧啶或在N7位置修饰嘌呤。修饰基团可以是多种多样的，例如卤素、醚或者聚醚、烷基、脂类或聚脂类，或常见的XR，在这里，X是连接基团，R是修饰基团。在修饰技术领域，存在许多种有效的可能适用于修饰核酸分子、寡核苷酸分子及其类似物的方法。(A Practical Approach，Eckstein，ed.(1991)and inPCT/US94/00193.)“信号发生系统”可以包括一种或多种组分，至少其中一种组分是可检测的结合物。信号发生系统包括所有用以产生或增强可测信号(或是通过一定的方法作用于标记以产生的信号)的试剂。信号发生系统提供了一种可以用外部检测方法检测的标记，这种方法通常是通过测量吸收光和发射光的波长的差异实现的。信号发生系统也可包括生色底物和酶，其中生色底物在酶的作用下，吸收可见光区或紫外光区的光或是磷光、荧光，从而显出颜色。当然，信号发生系统也可以使用诸如放射性同位素之类的可检测标记以提供可检测的信号。
信号发生系统包括至少一种催化剂(通常是至少一种酶)和至少一种底物，也可以包括两种或更多的催化剂和一组底物(比如包括一组酶，其中一种酶的底物是另一种酶的产物)。信号发生系统的操作是在预定的位点产生出可检测的信号，即意味着在这预定的位点具有相应的标记。
为了得到可检测的信号，这就要求将在预定位点的标记产生的信号进行放大。这样，这个标记一般是催化剂、发光化合物或是放射性同位素，最好是催化剂。催化剂最好是可以从单个标记产生多种信号发生分子的酶或是辅酶。酶或是辅酶可以通过产生可以吸收光的产物，如染料或是产生在照射下会激发出光的产物，如荧光剂以达到将所需信号放大的目的。或者，催化反应也可以直接产生激发光，例如化学发光。许多酶和辅酶都可以用以这一目的，见美国专利No.4,275,149和U.S.Pat.No.4,318,980(在参考文献中)。另外，许多也可以实现上述作用的非酶类催化剂可见美国专利No.4,160,645(July 10，1979)。
上述酶反应的产物通常是染料或是荧光剂。在美国专利No.4,275,149中给出了大量荧光剂的说明。
其它用于此处的术语具有和本领域中通常使用时一致的意义，在技术性词典中都有解释。
专利介绍本发明认识到介电电泳提供了一种对样品中的实体分子进行快速、高效和非破坏性分离的方法。本发明同时还认识到了当样品中各个不同组分的介电性质相近时，用介电电泳的方法难以将样品中的各种实体分子分离。
本发明考虑到了以上的方面和本领域内的一些其它需求。本发明的目的之一就是提供试验所需的器件和试剂，如可以提高样品中实体分子的介电分离效率、并且可直接用于介电电泳分离的样品溶液。本发明的另一个目的在于提供一种使用本发明的样品溶液对样品中的实体分子进行分离的方法。本发明的还一个目的就是提供一种使用电磁力且同时使用可以选择性地修饰红细胞的溶液对血液样品中的实体分子进行分离的方法。
作为本发明的简短介绍，下面给出本发明的一些常见和实用的方面(但不仅仅限于这些方面)，包括1)一种溶液，当和样品混合后，可以对样品中至少一种实体分子的介电性质进行修饰，同时溶液的电导率也允许在溶液中直接对感兴趣的实体分子进行分离；
2)一种可以对样品中一种或多种实体分子进行介电电泳分离的方法，其中使用了可以调整样品中一种或是多种组分介电性质的溶液，并且这种溶液具有适当的电导率，样品中的实体分子可以利用介电电泳力在其中得以分离；3)一种使用电磁力对样品中的实体分子进行分离的方法，其中使用了一种可以选择性地修饰红细胞的溶液、且使用了磁珠和集成在芯片上的能产生电磁力的结构单元。
可以通过这里描述的方法、给出的器件和试剂，并参照相应的文献，就可以实现发明的这些方面。为了对本发明具有一个更全面的了解，必须意识到本发明的不同方面可以相互结合，实现各种需要。
可以对样品中至少一种组分的介电性质进行修饰的溶液本发明包括提供这样一种样品溶液，当该样品溶液和样品混合后，可以对样品中至少一种实体分子的介电性质进行修饰，同时样品-样品溶液混合物的电导率也允许在溶液中直接对感兴趣的实体分子进行分离。最好样品溶液的电导率可以满足这样的条件，当和样品混合后得到的样品-样品溶液混合物的极化程度较之待使用介电电泳方法分离的感兴趣的实体分子的极化程度要低。这样，和微粒结合的感兴趣的实体分子就可以通过正向介电电泳力进行分离。但是这点要求对于本发明而言不是必须的。例如，当样品溶液和样品混合后得到的样品-样品溶液混合物的极化程度较之待使用介电电泳方法分离的感兴趣的实体分子的极化程度要高时，也包含在本发明的范围内。考虑到样品-样品溶液混合物的极化程度可能比待分离的实体分子高，故实体分子也应可以使用负向介电电泳或是基于负向介电电泳的方法得以分离。这些方法包括所有介电电泳分离技术，例如，但不仅仅限于，介电迁移、介电滞留、介电电泳/重力场流分离、基于行波介电电泳的分离技术和二维介电电泳。
本发明中的样品-样品溶液混合物的电导率一般介于0.1μS/cm至1S/m之间，更好介于5μS/cm至0.5S/m之间，最好是介于10μS/cm至0.1S/m之间。样品溶液的电导率和样品-样品溶液混合物的电导率可以使用市售的电导仪测量。溶液的电导率是可以调节的，如可以向溶液中加入盐以增加溶液的电导率。
本发明中的样品溶液可以以任意比与样品互溶，例如，样品可以与样品溶液以10∶1至1∶10000的比例混合，一般以5∶1至1∶1000的比例混合，更好的是以1∶1至1∶250的比例混合，最佳混合比例介于1∶2至1∶50之间。
当将样品与样品溶液混合后，样品中的一种或几种组分会受到一定程度的修饰，这样利用介电电泳力对样品中的一种或多种实体分子进行分离的效率较之不使用样品溶液时要高。如果感兴趣的实体分子与样品中其它组分的介电差异可以被加大，那么就可以提高对这种实体分子的分离效率。对同一电场的不同的响应可以表现为，在电场中运动方向的不同或是在电场中运动程度的不同。当加入样品溶液后，介电分离效率得以提高的一种或多种实体分子可以是样品中被溶液修饰的组分，当然被溶液修饰的组分也可以恰好是除了这些实体分子之外的样品中的其它组分。例如，原先对电场没有相应的样品组分通过修饰可以在电场中表现出正向介电电泳。或者，通过使用本发明的方法，某种样品中的组分对电场不再表现出正向介电电泳，这样就可以通过介电滞留技术对样品中其它组分进行分离。
被样品溶液修饰的样品中的组分可以是那些被滞留在反应池中某一或某些位置的实体分子，或是那些被从反应池中的某一或某些位置推斥开的实体分子，也可以是那些既不被反应池中某一或某些位置吸引，又不被从反应池中的某一或某些位置推斥开的实体分子。起修饰作用的样品溶液可以使样品中的一种或多种组分的介电性质发生改变，使得这些原先不被正向介电电泳滞留在反应池中某一或某些位置的组分可以被正向介电电泳滞留在反应池中的某一或某些位置；或是使得原先不作负向介电电泳的组分作负向介电电泳运动；也可以使得原先作正向或是负向介电电泳运动的组分不再对对电场作出响应，不再作正向或是负向介电电泳运动。
本发明中的样品溶液可以对样品中的多种组分进行修饰，其中对多种组分进行修饰的方式可以是相似的，也可以是不同的。例如，本发明的一种样品溶液可以对两种组分进行修饰以使得这两种组分在给定的电场中都作负向介电电泳运动。或者，本发明中的另一种样品溶液可以对两种组分进行修饰，使得一种原先在电场中不作正向介电电泳的组分作正向介电电泳运动，而另一种原先不作负向介电电泳的组分作负向介电电泳运动。对样品中的一种或多种组分的介电性质进行的修饰不需要完全改变组分对电场的相应，只要有一定的改变即可，例如，改变组分在给定电场中的响应程度。
本发明中可以被样品溶液修饰的样品组分包括分子(如生物分子，例如核酸、蛋白质、碳水化合物和脂类；化合物，例如各种有机物和无机物)、复合物(如转录复合物或是核糖体)、细胞器(如线粒体和细胞核)、病毒、寄生虫(如锥体虫和疟原虫)和细胞(包括真核和原核细胞)。这些组分的介电性质和组分的介电系数、电导率和尺寸相关。这些性质部分决定了微粒所受的介电电泳力的幅值和方向。
半径为r的微粒所受的介电电泳力 为 其中Erms是场强的均方根值，是梯度操作符号，εm是介质的介电系数。因子XcDEP是微粒的极化因子，可以表示为xDEP=Re(ϵp*-ϵm*ϵp*+2ϵm*),---(2)]]>这里Re指复数的实部，符号εx*＝εx-jσx/(2πf)是复式介电系数。 ，参数εp、σp分别是微粒的有效介电系数和电导率(可能与外加频率有关)。当一个微粒的介电电泳极化因子为正(xcDEP＞0)时，微粒受介电电泳力作用向强场区域运动。当一个微粒的介电电泳极化因子为负(XcDEP＜0)时，微粒受介电电泳力作用远离强场区域向弱场区域运动。
对一个半径为r，受行波电场 (即E场的x分量沿z方向行进，x分量的相位值沿z向是位置的线性函数)作用的微粒来说，作用在其上的理想行波电场的行波介电电泳力FtwDEP为 其中E是场强大小，εm是介质的介电系数，ζtwDEP是微粒的行波介电电泳极化因子ζTW-DEP=Im(ϵp*-ϵm*ϵp*+2ϵm*)]]>其中Im指相应复数的虚部，符号εx*＝εx-jσx/(2πf)是复式介电系数，参数εp、σp分别是微粒的有效介电系数和电导率(可能与外加频率相关)。
这样根据行波介电电泳极化因子的正负，行波介电电泳力的行波分量将沿着或逆着行波场的传播方向作用于微粒上。如果在工作频率下微粒的行波介电电泳极化因子是正的(ζTWD＞0)，则作用在微粒上的行波介电电泳力将与电场行进方向相反。如果在工作频率下微粒的行波介电电泳极化因子是负的(ζTWD＜0)，则作用在微粒上的行波介电电泳力将与电场行进方向相同。
这样，在非均匀电场中的微粒的运动部分由微粒的尺寸(r)、介电系数(εp)和电导率(σp)决定。微粒的尺寸部分决定着微粒所受介电电泳力的大小，而微粒的介电系数和电导率则会影响微粒在非均匀电场中的介电电泳的方向。因此，具有不同介电性质的微粒处于同一电场中时，将受到不同的常规介电电泳力和不同的行波介电电泳力的作用。
以下对微粒介电性质的讨论是作为本发明中选择试剂并说明试剂来源的背景知识而给出的，仅仅是当作例子，并不意味着本发明仅仅限于如下所说的部分。
微粒(例如样品中的组分)的介电系数和电导率由组分的组成结构相关。例如，由同一结构单元组成的微粒例如聚苯乙烯珠体具有确定的介电系数和电导率从而具有确定的有效介电系数和有效电导率。这些性质在很大的范围内(例如1赫兹到100兆赫兹)与电场频率无关。具有均一成分的微粒具有表面净电荷，当这些带电微粒悬浮在介质中，在微粒/介质的接触面将形成电双层。外加电场与该电双层相互作用导致了微粒有效电导率和有效介电系数的改变。外加电场与电双层的相互作用通常是与频率有关的，因此，微粒有效电导率和有效介电系数也与频率有关。
相对应的是，具有不均一组成的微粒如细胞，具有表面介电系数(又称膜介电系数)和内部介电系数、表面电导率(膜电导率)和内部电导率。具有不均一组成的微粒的有效介电系数由表面介电系数和内部介电系数共同决定，有效电导率也由表面电导率和内部电导率共同决定。具有不均一组成的微粒的有效介电系数和有效电导率和电场频率相关。对于不同种类的细胞已经建立了相应的不同介电模型。特别是，单壳模型对应着哺乳动物细胞，其中细胞的模型是导体球(对应着细胞内物质)被一层导电性较弱的壳(对应着细胞膜)包围。细胞有效介电性质由细胞内物质和细胞膜的介电参数共同决定，可以通过下式计算
其中， 电系数(当x＝cell)，或是膜(x＝mem)的或是细胞内部(x＝int)的复式介电系数。参数r和d分别表示细胞半径和细胞膜厚度。
由于具有不均一组成的微粒如细胞的介电性质与频率相关，这样微粒的常规介电电泳极化因子和行波介电电泳极化因子就和频率相关。对于哺乳动物细胞，细胞的介电性质受到细胞尺寸、膜厚度、细胞膜的介电性质和细胞内部的介电性质等因素的影响。一般来说，一个活细胞有一个导电性较差的细胞膜(膜电导率很小，小于10-4S/m)，它包围了导电性中等的细胞内物质(内部电导率较高，大于0.1S/m)。这样在低频情况下，施加的电场主要加在细胞膜上，这样细胞膜的介电性质就决定了整个细胞的介电性质。这时通常细胞的常规介电电泳因子是负值(xcDEP＜0)，表现出负向的常规介电电泳行为。随着频率的增加，电场逐渐穿透细胞膜作用于细胞内部物质。这样，细胞的常规介电电泳因子xcDEP逐渐从负值变为正值。一般在这样的频率范围内，外加电场使细胞受到的作用力倾向于使细胞的行波介电电泳因子ζtwDEP表现为正值(ζtwDEP＞0)。当频率进一步增加，细胞内含物的性质(即开始是有效电导率，之后是有效介电系数)决定了细胞的反应。开始，细胞的常规介电电泳极化因子XcDEP大于零，然后随着频率的升高，xcDEP逐渐减小。在这个频率范围内，行波介电电泳极化因子ζtwDEP＜0。细胞的常规介电电泳极化因子和行波介电电泳极化因子的准确频率范围决定于细胞的介电性质以及细胞所处的水溶液的电导率。
微粒或是样品中组分的尺寸决定了它对电场的响应，也属于介电性质的一部分。样品中组分的介电系数、电导率、尺寸以及其它与此相关的性质都可以被本发明中的溶液改变。
一些细胞，主要是细菌、真菌和植物细胞，在细胞膜外还具有细胞壁。这些复合微粒的介电性质比较复杂，在特定电场频率下的介电电泳行为由细胞壁、细胞膜和细胞内部物质的介电系数和电导率共同决定。细胞壁对微生物介电性质的影响以及具有细胞壁的微生物的介电电泳行为可以参见这篇文章Markx et al.Microbiology140585-591(1994)。
可以被本发明的样品溶液改变介电性质的样品组分的性质包括组分的组成(包括复合物的内部组成)、样品组分的净电荷、样品组分的电荷分布、样品组分的表面电荷、样品组分的表面电荷密度、样品组分的表面形态以及样品组分的尺寸等等。
本发明中的样品溶液可以通过以下的方式改变样品中的一种或是多种组分的介电性质的在样品组分加入某些结合实体，或是去除样品组分的某些结合单元，即通过改变组分的尺寸以实现这一目的。例如，某种特异的结合物，比如抗体，可以识别连接于某一微粒上的一种蛋白，通过在某种细胞胞解物样品中加入抗体，可以使用介电电泳力捕获这种蛋白。在另一个例子中，可以在由细胞组成的样品中加入含有细胞裂解剂的溶液，比如洗涤剂，从而使得所有或是部分细胞发生部分或是全部降解，这样就不会还有细胞对用以分离细胞胞解物的电场发生响应。可以使得某些细胞发生胞解的低渗溶液便是本发明中可以用以改变样品中一种或是多种组分介电性质的样品溶液。这种低渗溶液可以允许对样品中一种或是多种感兴趣的实体分子进行介电电泳分离。可以通过增加或是减小样品组分尺寸以改变样品组分的介电性质的样品溶液包括特异性的结合物，即能和其它特定物质分子特异性结合的结合物，如微粒、酶、洗涤剂、表面活性剂、离液剂、变性剂、盐、螯合剂等等。
本发明中的样品溶液还可以通过以下的方式改变样品中的一种或是多种组分的介电性质的在样品组分加入某些结合实体，或是去除样品组分的某些结合单元，即通过改变样品组分的净电荷、电荷分布、表面电荷、表面电荷密度以实现这一目的。这里，被加入样品组分的特定物质分子可以是离子、分子、化学基团、多聚物、微粒等等。其中，分子可以是任何类型的分子，有机的、无机的或是两者的组合体，例如蛋白质(包括抗体)、碳水化合物、脂类、类固醇、洗涤剂等等。样品组分的组成部分包括亚基(包括辅助因子)、蛋白质、脂类、固醇、碳水化合物、核酸、有机化合物、无机化合物、有机化合物和无机化合物的组合体以及化学基团。样品组分中的组成部分可以通过使用盐、螯合剂、变性剂、离液剂、洗涤剂、表面活性剂、酶、化学试剂(如肼、哌啶和过碘酸)等等。例如，本发明中的带有特异结合物如抗体(抗体与一个带大量电荷的实体分子，如多聚赖氨酸相连)的样品溶液加入样品后，抗体可以与相应的样品组分结合从而改变组分的净电荷或是表面电荷密度。本发明的样品溶液也可以是包含有诸如洗涤剂、脂类或是多聚物之类可以包被在组分的表面从而改变样品组分的净表面电荷或是表面电荷密度。
在本发明的某些例子中，待分离的组分是细胞或是细胞器，其中一种或是多种类型的细胞被溶液中的一种或是几种成分胞解或是在细胞膜上打孔使其通透性增强。当细胞或是细胞器在细胞膜上被打孔使其通透性增强这样的作用，这通常是指在这种作用下，一定尺寸以下的化合物可以通过细胞膜进入或是离开细胞，或者也可以指具有一定选择性的物质交换，如仅仅特定的物质，比如钾离子可以进入或是离开细胞。本发明中的可以胞解或是对样品中的一种或是多种细胞在细胞膜上打孔使其通透性增强的溶液的渗透压应该比待通过低渗胞解或是待在细胞膜上打孔使其通透性增强的细胞的渗透压低。或者，本发明中可以引起胞解或是在细胞膜上打孔使其通透性增强的溶液可以从细胞膜上(例如细胞膜上的蛋白，如转运蛋白和例子通道蛋白)作用于细胞，溶液中可以包含盐、洗涤剂、表面活性剂、脂类、固醇、多聚物、乙醇、酶、离子载体、代谢抑制剂、离子通道阻碍剂和离子通道调节剂等等试剂。细胞胞解和在细胞膜上打孔使其通透性增强的作用可以改变细胞的电荷密度、净电荷和电荷分布。
样品溶液也可以通过酶或是化学试剂改变样品组分表面净电荷或是表面电荷密度从而对组分的介电性质进行修饰。由于细胞表面的糖脂和糖蛋白的碳链通常带有负电荷，所以细胞表面通常都是带负电荷。包含有神经氨酸苷酶的样品溶液可以通过切割细胞表面的碳链从而改变细胞表面电荷密度或是细胞表面净电荷。蛋白酶、洗涤剂、还原剂或是螯合剂如EDTA都可以去除细胞表面的蛋白或是其它分子，从而对细胞的介电性质加以修饰。
样品溶液也可以通过对样品组分表面进行化学修饰从而改变样品组分的表面电荷、表面电荷密度或是净电荷。氧化剂例如高碘酸，还原剂例如二硫苏糖醇可以加入样品溶液以使得它们对样品组分的表面进行化学修饰。通过促使样品组分的表面发生化学反应，酶也可以改变样品组分的介电性质。激酶、磷酸酶、还原酶、氧化酶等各种酶类都可以加入到样品溶液中去。
样品溶液也可以包含通过改变样品组分的形态或是细胞分化的方式对样品组分(例如细胞)的表面组成进行修饰的化合物。例如，包含有植物血球凝集素或是白细胞介素-2(用以刺激T淋巴细胞中MHC的表达)的样品组分可以增加细胞膜表面构型的复杂度，从而改变细胞膜的介电性质(Huang et al.，Biochimica Biophys.Acta 141751-62(1999))。
通过对具有不均一组成的样品(如细胞)组分的内部组成的改变，本发明的样品溶液也可以改变样品组分的净电荷和电荷分布。本发明中的溶液可以通过以下的方式改变具有非均一组成的样品组分的内部组成，在样品组分中引入新的特定物质分子，从样品组分中去除某种特定物质分子或是使得样品组分的内部组成发生化学或是形态上的变化。例如，通过脂质体可以将带电分子引入细胞内，也可以使用其它市售的载体，如lipofectin(Life Technologies，Rockville，MD)、gene porterTM(Gene Therapy Systems，San Diego，CA)或是InfluxTMPinocytic Cell-Loading Reagent(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)等等将分子或是化合物(例如带电和不带电的多聚物)引入细胞内。样品溶液也可以通过使细胞释放出分子或是化合物的方法改变细胞的内部组成。例如，样品溶液中可以包含一种或是多种离子载体使得细胞释放出某些离子，从而改变细胞内部的净电荷和电荷密度。或者，也可以直接改变细胞膜表面的膜蛋白如离子通道蛋白，从而使得细胞内部的离子组成发生改变。
样品溶液也可以包含通过改变样品组分的形态或是细胞分化的方式对样品内部组成进行修饰的化合物。例如，B细胞可以在抗原和生长因子的作用下分泌出免疫球蛋白。当分泌量增大时，细胞的内部结构会发生改变，比如细胞内膜结构发生改变。这样的变化会改变细胞内部的介电系数和电导率。离子载体、离子通道阻碍剂、代谢抑制剂和其它的能够改变细胞内部组成的药物都可以包括在本发明的样品溶液中。
本领域内的技术人员可以根据待分离或是待去除的样品组分的知识选择合适的样品溶液。例如，当样品中有具有高度糖基化的细胞(具有较大的密度和负的表面电荷)时，样品溶液中可以含有神经氨酸苷酶，即一种可以切除细胞表面碳链的酶。在另一个例子中，样品溶液可以包含一种特异结合物(例如一种二价抗体)，这种抗体可以和线粒体的表面结合，从而可以使得线粒体可以被介电电泳的方法分离。在还一个例子中，样品溶液中可以包含连接有具有高密度电荷的基团(如多聚赖氨酸)的特异识别某种细胞的单价抗体，当抗体与相应的细胞结合后，可以改变细胞的表面电荷从而改变细胞的介电性质。也可以在样品溶液中加入那些还不知道会对特定的样品组分产生何种效果的物质，例如，代谢抑制剂、离子通道阻碍剂或者其它可以对生物样品组分的内部组成产生影响的药物。这些改变都可以对它们的介电性质进行一定程度的修饰。
可以通过经验性的测试以确定样品组分的介电性质是否被改变样品溶液改变。例如，技术人员可以通过电旋转的方法判断样品组分的介电性质。通过测量实体分子在旋转电场中的转速可以推导出该实体分子的介电性质，这种方法可参见Huang et al.，Phys.Med.Biol.371499-1517(1992)；Huang et al.Phys.Med.Biol.401789-1806(1995)；Huang et al.Biochim.Biophys.Acta 128276-84(1996)；andHuang et al.Biochim Biophys.Acta 141751-62(1999)；通过测量实体分子悬液的吸光率也可以确定实体分子的有效电导率(如实体分子在加入样品溶液之前或之后的电导率)，参见Price et al. Biochim.Biophys.Acts 964221-230(1988)；Burt et al.，and J.Phys.E Sci.Instrum.22952-957(1989)；另外，通过判断实体分子在给定条件下，在多项式电极阵列上作正向介电电泳还是负向介电电泳，就可以测试出实体分子在用样品溶液处理前和处理后的介电性质，这种方法可见Huang and Pethig Meas Sci Technol 21142-1146(1991)andMarkx et al.，Microbiology 140585-591。
除了具有修饰样品组分的介电性质的功能之外，样品溶液的电导率还要能够满足样品中的一种或是多种实体分子的介电电泳分离的需要。在大多数但不是全部的例子中，技术人员可以对所需的样品-样品溶液的电导率范围具有大概的估计。可以将样品溶液和样品以各种不同的比例混合，再用电导仪对溶液的电导进行测量。在大多数但不是全部的例子中，需要使用低电导率溶液，低电导率是指溶液的电导率低于0.5S/m。但是，在某些例子中，当需要使用负向介电电泳进行分离的时候，就要求样品-样品溶液混合液的电导率不低于待分离的实体分子。样品溶液的电导率可以通过加入盐(如NaCl)或是螯合剂(如EDTA)进行调整。
含有不止一种细胞的样品可以对其中一种或是多种细胞进行胞解，例如可以通过显微镜观察当加入低渗溶液后细胞的胞解状况。
本发明实体例子中的样品溶液具有较低的电导率，当和血液样品混合后，样品溶液可以选择性的修饰红细胞，从而使得不被介电电泳力滞留在反应池中。在这些实体例子中，本发明的样品溶液主要修饰红细胞而不是白细胞，下文中这样的溶液指可以选择性的胞解红细胞的溶液。一般要求，样品溶液和血液样品混合后，溶液中天然的红细胞和天然的白细胞之比要小于20∶1，更好是小于10∶1，最好是小于5∶1。这可以通过显微镜观察。本发明的样品溶液可以与血液样品以1∶10至10000∶1的比例混合，一般是以1∶5至1000∶1的比例混合，更好的是以1∶1至250∶1的比例混合，最好是以2∶1至50∶1的比例混合。这些样品溶液的电导率较低，即溶液在外加电场中的极化程度与待分离的实体分子相比要低。
在实体例子中，本发明中的样品溶液具有较低的渗透压，这样当样品溶液加入血液样品时，血细胞位于低渗的环境中。实体例子中，一般溶液的最终渗透压介于20mOsm至150mOsm之间，最好是介于30mOsm至80mOsm之间。可以用于本发明的低渗溶液的合适溶质包括甘油、糖(如蔗糖、葡萄糖和甘露糖)和糖醇(如甘露醇和山梨醇)。其它可以用于本发明的低渗溶液的溶质还包括在接近中性pH时不带电的两性离子，如甘氨酸、丙氨酸、γ-氨基-丁酸、半胱氨酸、组氨酸(包括D-，L-，3(τ)甲基-和1(π)甲基-组氨酸)、肌肽、嘧啶、咪唑和4-乙基-2-甲基吡啶(见Edman，et al.Nucl.AcidsRes.254907-4914(1997))。
电极阵列可以用于测试本发明中的样品溶液。例如，可以观察在电场中原先作正向或是负向介电电泳的样品组分在与样品溶液混合后的运动状况。例如，可以将少量样品-样品溶液混合液加到电极阵列上，电极上施加了适当频率(10Hz至500MHz之间)和幅值(峰峰值小于20伏)正弦电信号。作正向介电电泳的样品组分在阵列的末端被收集，而作负向介电电泳的样品组分聚集在电极阵列的中央区域(Huang and Pethig，Meas.Sci.Technol.21142-1146(1991)。
为了对通过介电电泳分离的实体分子进行检测，样品中的至少一种实体分子上应带有可检测的标记。例如，在将生物样品和本发明的样品溶液混合进行介电电泳分离时，可以使用特异性的识别样品中的一种细胞或是组分的抗体对某种细胞或是组分进行标记。抗体上可以带有可检测的标记，例如荧光分子(如罗丹明、荧光素、Texas红、藻红蛋白，藻蓝蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等等。细胞也可以使用带有不同标记的不同抗体标记。这样，带有荧光标记的细胞所处的位置可以被检测到，从而可以判断出使用样品溶液对样品组分进行介电电泳分离的效果。除了细胞外的样品组分，如细胞器、病毒、蛋白质、复合物和核酸等等都可以利用抗体进行标记，从而检测它们的介电电泳分离。
另外，还有一种检测方式是在分离之后，通过结合分析检测蛋白质、核酸和其它化合物的存在。例如，将本发明的样品溶液和样品混合后，再进行细胞分离，分离的效果可以通过检测能够和给定细胞所表达的蛋白特异性结合的抗体或是检测能够和确定细胞(如特异种类的细菌)中的特异序列结合的探针核酸序列等等方法而得到。对可以代表特异类型细胞或是特异细胞组分的核酸序列和蛋白质的检测可以通过酶促检测过程(如PCR)或分析(如P450分析)。
通过向细胞内部引入可检测的标记(如染料)可以对细胞介电电泳分离过程进行监控。例如，细胞中可以引入BCECF-AM(Molecular Probes，Eugene，OR)，这种荧光素探针可以被活细胞吸收，在介电电泳分离后，这种荧光素分子的位置可以确定(Gascoyneet al.IEEE Transcactions 33670-678(1997))。用以分离细胞的芯片被证明可以用显微镜进行观察，这样被分离的实体分子可以被洗出反应池，再通过显微检测、流式细胞技术、细胞生长分析等等方法(但不仅仅限于这几种)进行分析。
本发明的样品溶液中也能包括除了可以选择性修饰样品中的一种或是多种实体分子的介电性质的物质之外的化合物。这些化合物可以是，但不仅仅限于，盐、缓冲液、酶、稳定剂、防腐剂、螯合剂(如EDTA和EGTA)、离液剂、变性剂、洗涤剂、抗凝血剂、特异性的结合物和可检测的标记等等。
本发明所需试剂可以以混合包装或是单独分装的形式提供。试剂可以以试剂盒的形式给出，其中这种试剂盒至少包括一种或是多种可以对一种或是多种样品组分的介电性质进行修饰的样品溶液和一种或是多种附加试剂，如微粒、特异性的结合物、缓冲液、相应的试剂和溶液等等和一份用以实现本发明功能的说明书(说明书可以单独以一本手册的形式给出，也可以分散在各个试剂的包装内)。
II使用可以选择性对样品中的一种或是多种实体分子的介电性质进行修饰的样品溶液并在芯片上对样品中的实体分子进行分离的方法本发明包括一种在芯片上对样品中的感兴趣的实体分子进行分离的方法，其中要使用本发明中的样品溶液，这种溶液与样品混合后，可以对样品中的至少一种组分的介电性质进行修饰，同时样品-样品溶液混合物的电导率满足样品中一种或是多种实体分子进行介电分离的需要。这种方法的过程是在样品中加入本发明的样品溶液，对样品中的实体分子进行介电电泳分离。这种方法也可以包括使用可以与实体分子耦联且能被介电电泳力操纵的结合物。
样品溶液本发明的样品溶液可以是满足以下条件的任何种类的溶液当和样品混合后，可以对样品中的一种或是多种组分的介电性质进行修饰，并且溶液的电导率能满足样品中实体分子介电分离的需要。本发明推荐的样品溶液是可以选择性胞解红细胞的溶液，比如低渗的聚乙烯甘油溶液、糖溶液或是糖醇溶液，这些溶液与限于血液样品混合后，样品-样品溶液混合物的渗透压介于20mOsm至150mOsm之间。
样品样品可以是任何种类的流体样品，例如环境样品，包括空气样品、水样品、食品样品；也可以是生物样品，包括生物样品的抽提物。生物样品可以是血液、血清、唾液、尿液、精液、眼泪、鼻、咽喉、生殖器或排泄物的提取物。生物样品也可以是器官、组织、细胞培养基样品(包括培养基和细胞株)。首选的样品是血液样品。
血液样品可以是任何种类的血液样品，从个体新鲜抽提的、从贮存库中获得的、从个体外获得的，如衣物、家具、器械等等。血液样品可以是通过抽提得到的，例如，把带有血液的物品浸入特定的缓冲液或是溶液得到。血液样品可以是处理过的，也可以是未处理过的，或是部分处理过的，处理的方式可以是离心以去除血清、透析、进行流式细胞计数、加入试剂等等。血液样品的处理步骤大致包括，但不仅仅限于，buffy coat，通过诸如流式细胞计数技术、密度梯度离心技术和磁力细胞分选技术等等对细胞样品进行分离。血液样品可以是任意体积，例如不到5微升，或是超过5升，这完全由试验需要而定。
结合物任何能以一定特异性和亲合性与实体分子结合并可以被介电电泳力操纵的结合物都可以应用于本发明的方法。为了在微流体系统中操纵实体分子而使用的结合物可以参见美国专利“Methods forManipulating Moieties in Microfluidic Systems”(专利序列号09/636,104，递交日期2000年8月10日)。结合物可以是细胞如动物、植物、真菌和细菌细胞；细胞器如细胞核、线粒体、叶绿体、核糖体、内质网、高尔基体、溶酶体、蛋白酶体、分泌泡、液泡和微体；病毒；微粒或是它们的聚集体。首选的结合物是微粒。
用于本发明的微粒通常介于0.01微米至几百微米之间。本方法中使用的微粒包括，但不仅仅限于，塑料微粒、聚苯乙烯微粒、玻璃珠、磁珠、中空玻璃球、复合成分的微粒、微加工形成的非接触式微结构(“Design of asynchronous dielectric micromotors”，Hagedom et al.，in Journal of Electrostatics，1994，Volume33，Page 159-185)等。复合成分的微粒是指那些有多种不同成分组成的微粒，例如包被着一层非导电多聚物薄膜的金属球。
选择的结合物的类型、材料、组成、结构和尺寸必须和特定应用中的操纵方式相匹配。例如，微粒必须具有合适的介电性质以便于微粒被介电电泳力操纵。
微粒的选择和具体操纵过程相关。例如，为了通过介电电泳的操纵方法对样品混合物中的感兴趣的组分进行分离，必须要求微粒的介电性质和样品中除了待分离的组分之外的其它组分的介电性质差异较大，这样，当微粒和感兴趣的实体分子结合后，感兴趣的实体分子-结合物复合物可以用介电电泳的方法进行选择性分离。
待操纵的实体分子可以通过任何可行的方法与结合物的表面结合。例如，实体分子可以和结合物的表面直接相连或是通过一个连接臂相连，最好是一个可以切割的连接臂。实体分子也可以通过共价或是非共价的结合方式与结合物表面结合。实体分子与结合物表面的连接方式可以是特异的，也可以是非特异的。最好，实体分子和结合物之间的连接是可以被切割的，如可以被化学、物理或是酶反应切断的连接臂。
连接臂(连接键)是任何可以将实体分子和结合物连接起来的特定物质分子。这样的连接臂(连接键)可以包括，但不仅仅限于，氨基酸或是肽键的连接、二硫键、硫醚键、受阻碍硫醚键、自由基(如氨基和硫醇基)之间的共价键等等。其它形式的连接臂包括可被酸切割的连接臂，例如bismaleimideothoxy propane、acid labile-transferrin conjugates、adipic acid dihydrazide这些可以在细胞内偏酸性条件下被切割的物质；也可以是能在紫外光或是可见光下被切割的胶联剂，例如人类IgG1中的恒定区域CH1、CH2和CH3(Batra et al.，Molecular Immunol.，30379-386((1993))。在一些实体例子中，可以同时使用多种连接臂，以便于利用各种连接臂的优势。其它种类的连接臂如三苯甲基连接臂，来自于三苯甲基基团，可以在不同的酸碱性条件下释放实体分子(U.S.Patent No.5,612,474)。还有一些连接用实体分子可以参见下文(Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，855879-5883(1988)，Whitlow，et al.，Protein Engineering，6989-995(1993)，Newton et al.，Biochemistry，35545-553(1996)，Cumber et al.，Bioconj.Chem.，3397-401(1992)，Ladurner et al.，J.Mol.Biol.，273330-337(1997)and in U.S.Patent.No.4,894,443)。本发明中通常选用的连接方式是生物素-链霉亲和素相互作用、抗原-抗体相互作用、配基-受体相互作用或是核酸序列互补作用。用于连接实体分子和微粒的连接臂和方法可以参见美国专利申请，申请序号09/636,104(递交日期2000年8月10日)。
在一些情况下，当实体分子-结合物如分子-微粒复合物被操纵/分离到预定的位置后，微粒的存在并不干扰分子下一步的反应。这样，就不必将分子和结合物再进行分离。但是在某些情况下，这样的分离又是必须的。分离过程的特征由实体分子和结合物的性质、结合物的表面状况和操纵过程决定。通常，分离的条件和聚合的条件恰好相反。例如，如果实体分子和结合物在高盐离子浓度条件下结合，那么实体分子可以在低盐离子浓度条件下从结合物上洗脱下来。相似的，如果实体分子与结合物的连接是通过特异性的连接臂完成的，那么分离的方式就是施加给这个连接臂可以特异性使其断裂的条件。
芯片上的反应池本发明的反应池是一种可以容纳流体的结构。反应池可以是任意尺寸，通常应可以容纳0.001μl至50ml的流体，更好应可以容纳1μl至20ml的流体，最佳情况是容纳10μl至10ml的流体。一般而言，反应池是芯片上的结构单元之一。反应池可以由任何适当的材料制成，如硅、玻璃、金属、陶瓷、聚合物、塑料等等，可以是质地坚硬材料，也可以是质地柔软的材料。首选的材料是那些对样品中的实体分子的介电电泳运动没有干扰的材料，例如那些不与带电或是极化分子结合的材料，如硅、某些种类的塑料或是多聚物(如丙稀酰胺、玻璃等等)。
反应池是芯片的组成部分之一，芯片是一块固体基片，在其上可以进行一次或是多次的分离、分析、捕获等等过程。芯片的材料可以是金属、陶瓷、聚合物、共聚物、塑料、橡胶、硅、玻璃等等中的一种或是几种。芯片可以包含几种具有一定柔韧性的材料。芯片可以由多孔材料制成，也可以由致密的材料制成。芯片上制有或集成有诸如槽、通道、电极单元等等微加工结构，在其上可以进行物理的、生物物理的、生物的、化学的反应或是处理。芯片是一块薄片。对芯片的表面积大小不作要求，比如从1mm2到0.25m2都可以。最好所用的芯片的表面积从4mm2到25cm2左右。芯片可以具有不同形状，规则的形状如矩形、圆形、椭圆形或其它不规则的形状。芯片表面可以是平的，也可以是不平的。具有不平的表面的芯片在表面上可以包括通过在芯片表面进行加工或是蚀刻而得的槽、反应池等结构。
必须指出的是，对于具有较大容量的反应池(如上至50ml)，必须使用具有特定几何形状和参数的芯片。芯片可以制作在柔性材料上，以便于芯片被折叠形成类似于管道的反应池。可以在同一反应池中使用多块芯片，电极单元也要满足能将介电电泳力施加到反应池中感兴趣的区域内。
实体例子中，反应池中包电极(电极制作在芯片上或芯片内)，但是这并不是本发明的要求。芯片上的电极可以具有任意形状，例如矩形、城堡形、三角形、圆形等等。电极的排布方式也有许多种，比如螺旋状、平行状、相互交错形、多项式形等等。芯片上电极的制作可以使用本领域中常见的各种微加工和微机械方法，例如电镀、金属溅射、光化学蚀刻。包含有电极的芯片有，但不仅仅限于，制作在玻璃基片上的介电电泳电极阵列(Dielectrophoretic Manipulationof Particles by Wang et al.，in IEEE Transaction on IndustryApplications，Vol.33，No.3，May/June，1997，pages 660-669)、具有可单个选通电极阵列的微加工生物电子芯片(Preparation andHybridization Analysis of DNA/RNA from E.coli on MicrofabricatedBioelectronic Chips by Cheng et al.，Nature Biotechnology，Vol.16，1998，pages 541-546)和毛细管电泳芯片(Combination of Sample-Preconcentration and Capillary Electrophoresis On-Chip by Lichtenberg，et al.，in Micro Total Analysis Systems 2000 edited by A.van den Berg etal.，pages 307-310)。
本发明中或是本方法中使用的反应池具有一个或多个端口，或是在反应池的壁上具有开口。端口可以是任何大小的，但适宜的是可允许样品由导管加入反应池的形状和尺寸。导管可以是任何允许液体通过的管状结构，比如橡胶管、聚四氟乙烯管、或聚乙烯管。端口可以为反应池壁提供一个开口以便于通过吸液管或是注射器引入样品。
导管可以通过泵(例如蠕动泵或是灌输泵)、注射器或是重力从一个或几个端口向反应池中引入样品。一种或是多种试剂、缓冲液、溶液等等。本发明中可以对样品中的一种或是多种实体分子的介电性质进行修饰的样品溶液，可以和样品同时加入反应池，或是先于、后于样品加入反应池。也可以在进入反应池前，先把样品和试剂、缓冲液或是溶液先混合起来，这样的混合过程可以在将流体引入反应池的导管中进行，也可以在一个或是多个与导管相连的样品池中进行。
样品溶液加入样品样品、样品溶液以及附加的溶液、缓冲液、试剂可以以任何方便的方式加入反应池，例如通过移液管转移，注射器注射、由导管(例如聚乙烯导管等等)利用重力引入。一般，样品、样品溶液以及其它溶液、缓冲液、试剂以连续液流的方式加入反应池，这样的连续液流可以从至少一个入口注射入或是泵入反应池，然后，不含有样品组分和其它液体从至少一个出口流出反应池。
在本发明的一个实体例子中(见图1)，样品溶液通过一个侧管被加入血液样品。通过调节输运本发明中的样品和样品溶液的蠕动泵，可以使得样品和样品溶液以不同的比例混合，以符合在反应池中对样品中的实体分子进行分离的要求。
在样品加入反应池前，可以在样品中先加入样品溶液。在把样品-样品溶液混合液加入反应池前，样品和样品溶液可以共同温育从不到1秒至几个小时以至几天之中任意的时间。样品和样品溶液的混合可以发生在与反应池连通的导管中，如图1所示。也可以先将样品加入反应池，再接着将样品溶液加入反应池；或者是先将样品溶液加入反应池，再接着将样品加入反应池。
其中在本发明中使用的结合物如微粒，可以和样品溶液一起或是单独提供。如果结合物是单独提供的，那么结合物可以在样品溶液加入样品之前、同时或之后加入。
使用介电电泳力进行分离在反应池中外加的非均匀电场作用下，可以对样品中的实体分子进行介电电泳分离。最好，实体分子的分离可以在位于反应池中的芯片上进行，外加的电场可以在反应池或是芯片外进行控制。通过一个或是几个电压、频率、相位都可调的电信号发生器向电极上施加电信号，以产生空间上不均一的交流电场。施加在电极上的电压一般介于0V至100V之间，最好介于0V至15V之间；而电信号的频率一般介于0.01KHz至500MHz之间，最好介于1KHz至20MHz之间。以上所给出的频率范围仅仅是示例作用，具体应用中，所施加的用于分离样品中实体分子的电信号的频率由待分离的实体分子本身的介电性质和实体分子所处的溶液的电导率决定。
可以使用任何一种介电电泳分离机制对实体分子进行分离，如介电滞留、介电迁移、介电电泳/重力场流分离、基于行波介电电泳的分离、2-D介电电泳等等。以下给出的分离的例子仅仅起解释说明的作用，而不意味着本发明仅仅包括例子所涉及的部分。当使用介电滞留时，感兴趣的实体分子被选择性的滞留在反应池中的一个或几个区域，而样品的其它组分被液流洗脱出反应池。当使用介电迁移时，感兴趣的实体分子被介电电泳力转移到芯片上的一处或是多处区域，而样品中的其它组分被转移出这些区域。当使用介电电泳/重力场流分离时，在介电电泳力和重力的共同作用下，不同的实体分子悬浮在反应池的不同高度处，或是一种或多种实体分子悬浮，而样品中的其它组分聚集在芯片上的某些位置，这样，带有不同实体分子的流体以不同的流速流经反应池/芯片，从而实现分离。也可以通过使用行波介电电泳力将感兴趣的实体分子直接转移出反应池。还有二维介电电泳的方法，其中，将介电电泳力和行波介电电泳力同时用于样品中感兴趣的实体分子的分离(De Gasperis et al.，Biomedical Microdevices 241-49(1999))。
由于样品中包含一些在不同电场中介电电泳行为未知的组分，可以通过调节电极几何形状、电场幅值和电场频率这些参数以优化和实现实体分子的介电电泳分离。
可以通过在电极边缘捕获和收集作正向介电电泳的实体分子，而利用其它作用力如流体力去除其它的细胞的方法实现分离操作。相似的方法也可以用于从细胞混合物中分离作负向介电电泳的微粒，如果绝大多数细胞在电场中都表现出正向介电电泳运动。当使用介电电泳/重力场流分离、行波介电电泳或是二维介电电泳方法时，分离可以通过分步收集从反应池中的洗脱液以实现。
以下实体例子的描述仅仅起解释说明的作用，并不意味着本发明仅仅包含所述的部分。
图1中的实体例子，用以选择性的胞解红细胞100的样品溶液通过一个侧管加入到血液样品中。血液样品包含红细胞100、白细胞120和其它血液组分(图1中没有给出)。血液样品-样品溶液流向具有相互交错的平行电极阵列的介电电泳芯片。通过介电滞留技术可以在非均匀电场中将白细胞120滞留在电极的表面，红细胞胞解物140和其它血液样品组分(在图1中没有给出)被液体从反应池中洗出。
图2中的实体例子，样品溶液中包含有特异性结合物160，该结合物160是表面共价结合有抗体的石墨微粒。在这个例子中，抗体可以和样品中的感兴趣的实体分子180例如蛋白质结合。样品-样品混合物可以先预先静置一段时间，例如10至120分钟，再将样品-样品溶液混合液通入由多项式电极阵列组成的芯片上。静置的过程可以使得样品中的实体分子180和结合物160充分结合，形成实体分子-结合物复合物200。这样，在交流电场中，感兴趣的蛋白质-微粒复合物，可以滞留在电极的表面。其它的样品组分可以从反应池中洗涤出去，例如通过微量进样器。
图3的实体例子中，感兴趣的实体分子210，例如从骨髓中分离出的干细胞，可以被含有抗体的样品溶液所修饰，溶液中的抗体可以与细胞表面的抗原结合，从而改变干细胞的表面电荷。除了感兴趣的实体分子210之外，样品中还包含许多其它实体分子，例如未分化的和已经分化的细胞，图中分别用220、240、260和280表示。样品-样品混合物可以先预先静置一段时间，例如5至60分钟，再将样品-样品溶液混合液通入(如通过注射器)由螺旋电极阵列组成的芯片上。这样，已被改变的干细胞300和其它实体分子一起进入芯片等待分离，样品溶液被泵入反应池，干细胞300可以通过介电滞留技术与未分化和已经分化的细胞相分离。
图4的实体例子中，可以选择性的胞解红细胞的样品溶液被加入血液样品。血液样品包括红细胞320、恶性淋巴瘤细胞340、非恶性白细胞360和其它类型的细胞(在图4中未给出)。将样品溶液加入血液样品，可以使得红细胞320被胞解，而恶性淋巴瘤细胞340、非恶性白细胞360和其它类型的细胞保持不变。再将样品-样品溶液混合液加入由平行线状电极阵列组成的芯片的反应池，在电极上通以四相电信号，则利用行波介电电泳可以将恶性淋巴瘤细胞340和非恶性白细胞360相分离。
上述例子都是在使用了本发明中的可以对样品中的一种或是多种组分的介电性质进行修饰，并且本身的电导率可以满足样品中的一种或是多种组分进行介电电泳或是行波介电电泳分离需要的样品溶液后，使用介电电泳方法进行分离的。现在有许多种介电电泳的方法可以用以分离和操纵细胞、生物微粒以及样品混合液中的实体分子。这些方法包括，但不仅仅限于，介电迁移、介电滞留、介电电泳/重力场流分离、行波介电电泳和二维介电电泳。介电电泳操纵和介电电泳分离领域的技术人员可以根据具体的情况，选用本发明中相应的方法进行分离和操纵。以下列出了一些有关介电电泳操纵和介电电泳分离技术方面的参考文章Wang，et al.，Biochim.Biophys.Acta.1243185-194(1995)，Wang，et al.，IEEE Trans.Ind.Appl.33660-669(1997)(关于不同的电极结构的设计，用介电电泳和行波介电电泳进行操纵的方法)；Wang，et al.，Biophys.J.721887-1899(1997)(在螺旋型电极上进行行波介电电泳浓缩和分离)；Wang，et al.，Biophys.J.742689-2701(1998)，Huang，et al.，Biophys.J.731118-1129(1997)and Yang，et al.，Anal. Chem.71(5)911-918(1999)(将微粒从电极上推斥开，并使其悬浮在介质中，再利用介电电泳/重力场流分离技术进行分离)；Gascoyne，et al.，IEEE Trans.Ind.Apps.33(3)670-678(1997)，Becket，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92860-864(1995)andBecket，et al.，J.Phys.DAppl. Phys.272659-2662(1994)(对微粒的捕获、推斥、定位、分离，利用介电滞留技术进行分离，利用介电迁移技术进行分离)；Huang，et al.，J.Phys.DAppl.Phys.261528-1535(1993)(利用行波介电电泳对微粒进行输运、分离和捕获)；and Wang，et al.，Phys.DAppl.Phys.261278-1285(1993)(利用介电迁移技术对微粒进行分离，对微粒的捕获、分离和推斥)。其它可以使用本发明中方法对微粒进行操纵和分离的已经发表的论文有关于从血液细胞或是其它类型细胞中分离细菌的(Hawkes，et al.，Microbios.7381-86(1993)；and Cheng，et al.，Nat.Biotech.16547-546(1998))；从血液中富集具有CD34活性的干细胞(Stephens，et al.，Bone MarrowTransplantation 18777-782(1996))；对病毒颗粒、亚微米磁珠、生物分子进行介电电泳收集(Washizu，et al.，IEEE Trans.Ind.Appl.30835-843(1994)；Green and Morgan，J. Phys.DAppl.Phys.30L41-L44(1997)；Hughes，et al.，Biochim.Biophys.Acta.1425119-126(1998)；and Morgan，et al.，Biophys J.77516-525(1999))；使特异的细胞悬浮(Fuhr，et al.，Biochim.Biophys.Acta.1108215-233(1992))；均一单微粒操纵(Washizu，et al.，IEEE Trans.Ind.Appl.26352-358(1990)；Fiedler，et al.，Anal.Chem.701909-1915(1998)；andMüller，et al，Biosensors and Bioelectronics 14247-256(1999))；介电电泳笼技术(Schnelle，et al.，Biochim.Biophys.Acta.1157127-140(1993)；Fiedler，et al.(1995)；Fuhr，et al.(1995a)；Fiedler，et al.(1998)；Müller，et al(1999))；在线性电极阵列上对细胞进行行波介电电泳操纵(Hagedorn，et al.，Electrophoresis 1349-54(1992)；Fuhr，et al.，Sensors and Actuators A41230-239(1994)；and Morgan，et al.，J.Micromech.Microeng.765-70(1997))。
III使用可以选择性胞解红细胞的样品溶液并在电磁芯片上对血液样品中的实体分子进行分离的方法本发明包括一种在电磁芯片上对血液样品中的实体分子进行分离的方法，其中要使用本发明中的样品溶液，这种溶液可以选择性的胞解红细胞，该方法使用可以被电磁力输运和定位的微粒。这种方法的过程是在样品中加入本发明的可以选择性胞解红细胞的样品溶液，在血液样品中加入一种或是多种磁珠，在电磁芯片上对血液样品中的实体分子进行介电电泳分离。
样品溶液本发明的可以选择性的胞解红细胞的样品溶液可以是满足以下条件的任何种类的溶液当和血液样品混合后，被胞解的绝大多数是红细胞而不是白细胞。一般要求，样品溶液和血液样品混合后，溶液中完整的红细胞和完整的白细胞之比要小于20∶1，更好是小于10∶1，最好是小于5∶1。这可以通过显微镜观察。本发明的样品溶液可以与血液样品以1∶10至10000∶1的比例混合，一般是以1∶5至1000∶1的比例混合，更好的是以1∶1至250∶1的比例混合，最好是以2∶1至50∶1的比例混合。
在实体例子中，本发明中的样品溶液具有较低的渗透压，这样当样品溶液加入血液样品时，血细胞位于低渗的环境中。实体例子中，一般溶液的最终渗透压介于20mOsm至150mOsm之间，最好是介于30mOsm至100mOsm之间。可以用于本发明的低渗溶液的合适溶质包括甘油、糖(如蔗糖、葡萄糖和甘露糖)和糖醇(如甘露醇和山梨醇)。
样品血液样品可以是任何种类的血液样品，从个体新鲜抽提的、从贮存库中获得的、从个体外获得的，如衣物、家具、器械等等。血液样品可以是通过抽提得到的，例如，把带有血液的物品浸入特定的缓冲液或是溶液得到。血液样品可以是处理过的，也可以是未处理过的，或是部分处理过的，处理的方式可以是离心以去除血清、透析、进行流式细胞计数、加入试剂等等。血液样品的处理步骤大致包括，但不仅仅限于，buffy coat，通过诸如流式细胞计数技术、密度梯度离心技术和磁力细胞分选技术等等对细胞样品进行分离。血液样品可以是任意体积，例如不到5微升，或是超过5升，这完全由试验需要而定。
磁珠可以在磁场中被电磁力输运和定位的磁珠可以由任何具有磁性的物质(如γFe2O3，即处于γ相的Fe2O3)。磁化微粒当施加磁场时可以诱导出磁偶极子，而当外加磁场消失时，感应出的磁偶极子也随之变为零。合适的磁性材料包括，例如，铁化合物。磁性材料可以和其它材料相结合，例如多聚物。磁珠表面可以包被一种或是多种化合物，以便于和样品中感兴趣的实体分子直接或是间接的连接。磁珠可以是任意形状的，通常是球状和卵状，但是这并不是本发明必须的要求。在生物和生物化学分离中，磁珠的应用很广泛。磁珠，包括耦联了各种特异结合物的磁珠都已经得到了商品化(DynalBiotech，Lake本发明中可以使用多种磁珠。当使用多种磁珠时，多种磁珠具有多种表面性质，这样它们就可以和样品中的不同实体分子连接。这样，可以使用本发明的方法对多种实体分子进行分离。磁珠的不同表面性质可以相互交换，例如，可以通过在磁珠表面可逆或是不可逆的结合上不同的化合物得以实现。
待操纵的实体分子可以通过任何可行的方法与结合物的表面结合。例如，实体分子可以和结合物的表面直接相连或是通过一个连接臂相连，最好是一个可以切割的连接臂。实体分子也可以通过共价或是非共价的结合方式与结合物表面结合。实体分子与结合物表面的连接方式可以是特异的，也可以是非特异的。最好，实体分子和结合物之间的连接是可以被切割的，如可以被化学、物理或是酶反应切断的连接臂。
连接臂(连接键)是任何可以将实体分子和结合物连接起来的特定物质分子。这样的连接臂(连接键)可以包括，但不仅仅限于，氨基酸或是肽键的连接、二硫键、硫醚键、受阻碍硫醚键、自由基(如氨基和硫醇基)之间的共价键等等。其它形式的连接臂包括可被酸切割的连接臂，例如bismaleimideothoxy propane、acid labile-transferrin conjugates、adipic acid dihydrazide这些可以在细胞内偏酸性条件下被切割的物质；也可以是能在紫外光或是可见光下被切割的胶联剂，例如人类IgG1中的恒定区域CH1、CH2和CH3(Batra et al.，Molecular Immunol.，30379-386((1993))。在一些实体例子中，可以同时使用多种连接臂，以便于利用各种连接臂的优势。其它种类的连接臂如三苯甲基连接臂，来自于三苯甲基基团，可以在不同的酸碱性条件下释放实体分子(U.S.Patent No.5,612,474)。还有一些连接用实体分子可以参见下文(Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，855879-5883(1988)，Whitlow，et al.，Protein Engineering，6989-995(1993)，Newton et al.，Biochemistry，35545-553(1996)，Cumber et al.，Bioconj Chem.，3397-401(1992)，Ladurner et al.，J.Mol.Biol.，273330-337(1997)and in U.S.Patent.No.4,894,443)。本发明中通常选用的连接方式是生物素-链霉亲和素相互作用、抗原-抗体相互作用、配基-受体相互作用或是核酸序列互补作用。用于连接实体分子和微粒的连接臂和方法可以参见美国专利申请，申请序号为09/636,104(递交日期2000年8月10日)。
在一些情况下，当实体分子-结合物如分子-微粒复合物被操纵/分离到预定的位置后，微粒的存在并不干扰分子下一步的反应。这样，就不必将分子和结合物再进行分离。但是在某些情况下，这样的分离又是必须的。分离过程的特征由实体分子和结合物的性质、结合物的表面状况和操纵过程决定。通常，分离的条件和聚合的条件恰好相反。例如，如果实体分子和结合物在高盐离子浓度条件下结合，那么实体分子可以在低盐离子浓度条件下从结合物上洗脱下来。相似的，如果实体分子与结合物的连接是通过特异性的连接臂完成的，那么分离的方式就是施加给这个连接臂可以特异性使其断裂的条件。
磁化物质是指当施加磁场时可以诱导出磁偶极子，而当外加磁场消失时，感应出的磁偶极子也随之变为零。在应用中，可以使用市售的磁化物质或是磁珠。大部分微粒的尺寸介于微米以下(例如50纳米至0.5微米)至几十微米。微粒可以具有不同的结构和组成。一种磁性微粒的结构是在一小块铁磁性材料外包裹一层胶体，如聚苯乙烯层。还可以把纳米级的铁磁性材料和胶体如，聚苯乙烯混合在一起而形成的。这两种微粒的表面都是聚苯乙烯，可以进一步将各种类型的分子修饰在上面。
特异性结合物在本发明中，包含磁性微粒的溶液也可以包含一种或是多种结合物。结合物可以是一种或多种蛋白质，如抗体、抗体片段、抗原、配基(例如，但不仅仅限于，受体配基)、植物血凝素等等。结合物也可以是有机或是无机的分子，例如镍、谷胱甘肽、生物素、亲和素、链霉亲和素、非蛋白的受体配基或是配基类似物等等。结合物也可以是核酸，如RNA、DNA或是任何非天然存在的核酸。结合物可以与磁性微粒可逆或是不可逆的结合。在固相表面耦联分子，如核酸和蛋白的方法都是本领域内常见的方法。
电磁芯片在电磁芯片上可以对具有电磁性质的微粒进行分离。可以提供电流的信号源位于芯片的外部，电磁单元集成在芯片上，操纵用的电磁力可以被操作者控制。电磁单元可以产生磁场，从而对磁珠施加磁场力。电磁单元可以具有不同的几何结构。例如，电磁单元可以是一个由导体材料例如金属制成的围绕着一个铁磁体的线圈，这个单元可以通过溅射、电镀、沉积的方法制作到芯片上。电磁芯片上可以包含一个或是多个如下专利中的电磁单元(美国专利申请，申请专利号为09/399,299，递交日期1999年9月16日)。其它电磁单元的例子可以参见，但不仅仅限于，Ahn，C.，et al.，J.Microelectromechanical Systems.Volume 5151-158(1996)；Ahn，C.，et al.，IEEE Trans.Magnetics.Volume 3073-79(1994)；Liakopouloset al.，in Transducers 97，pages 485-488，presented in 1997 InternationalConference on Silid-State Sensors and Actuators，Chicago，June 16-19，1997；US patent No.5,883,760 by Naoshi et al。这些文章和正在申请过程的美国专利申请(申请专利号09/399,299，递交日期1999年9月16日)中还包括了用于制造芯片上的电磁结构单元所需的材料、方法和制作规程。
电磁芯片可以由以下材料制成，陶瓷、多聚物、共聚物、塑料、橡胶、硅、玻璃等等。电磁芯片的表面积可以从1mm2到0.25m2。最好所用的芯片的表面积从4mm2到25cm2左右。芯片可以具有不同形状，规则的形状如矩形、圆形、椭圆形或其它不规则的形状。芯片的表面应具有通过在芯片表面进行加工或是蚀刻而得的槽、反应池等结构。
电磁芯片可以是反应池的一个组成部分，其中反应池是用以容纳流体样品的结构单元。反应池可以由任何液体不能渗透的材料制成，如硅、玻璃、金属、陶瓷、聚合物、塑料、丙烯酸等等。
本发明中或是本方法中的电磁芯片中的反应池具有一个或多个端口，或是在反应池的壁上具有开口。端口可以是任何大小的，但适宜的是可允许样品由导管加入反应池的形状和尺寸。导管可以是任何允许液体通过的管状结构，比如橡胶管、聚四氟乙烯管、或聚乙烯管。端口可以为反应池壁提供一个开口以便于通过吸液管或是注射器引入样品。
导管可以通过泵(例如蠕动泵或是灌输泵)、注射器或是重力从一个或几个端口向反应池中引入样品。一种或是多种试剂、缓冲液、溶液，例如，但不仅仅限于，本发明中可以对样品中的一种或是多种实体分子的介电性质进行修饰的样品溶液，可以和样品同时加入反应池，或是先于、后于样品加入反应池。也可以在进入反应池前，先把样品和试剂、缓冲液或是溶液先混合起来，这样的混合过程可以在将流体引入反应池的导管中进行，也可以在一个或是多个与导管相连的样品池中进行。
本发明的电磁芯片的反应池可以是任意尺寸，通常应可以容纳1μl至50ml的流体，更好应可以容纳1μl至20ml的流体，最佳情况是容纳10μl至10ml的流体。反应池可以由任何适当的材料制成，如硅、玻璃、金属、陶瓷、聚合物、塑料等等，可以是质地坚硬材料，也可以是质地柔软的材料。
必须指出的是，对于具有较大容量的反应池(如上至50ml)，必须使用具有特定几何形状和参数的芯片。芯片可以制作在柔性材料上，以便于芯片被折叠形成类似于反应池的通道。可以在同一反应池中使用多块芯片，电磁单元也要满足能有效的将电磁力施加到反应池中感兴趣的区域内。
样品溶液加入样品样品、样品溶液以及附加的溶液、缓冲液、试剂可以以任何方便的方式加入反应池，例如通过移液管转移，注射器注射、由导管(例如聚乙烯导管等等)利用重力引入。一般，样品、样品溶液以及其它溶液、缓冲液、试剂以连续液流的方式加入反应池，这样的连续液流可以从至少一个入口注射入或是泵入反应池，然后，不含有样品组分和其它液体从至少一个出口流出反应池。
在样品加入反应池前，可以在样品中先加入样品溶液。在把样品-样品溶液混合液加入反应池前，样品和样品溶液可以共同温育从不到1秒至几小时至几天之中任意的时间。样品和样品溶液的混合可以发生在与反应池连通的导管中，如图1所示。也可以先将样品加入反应池，再接着将样品溶液加入反应池；或者是先将样品溶液加入反应池，再接着将样品加入反应池。
其中在本发明中使用的磁珠，可以和能够选择性胞解红细胞的样品溶液一起或是单独提供。如果磁珠是单独提供的，那么磁珠可以在样品溶液加入样品之前、同时或之后加入。
把样品加到电磁芯片上样品溶液可以在样品沉积到电磁芯片上之前加入样品或是在包含电磁芯片的反应池中混合。在将样品-样品溶液混合液通入反应池进行分离之前，样品和样品溶液可以共同静置一段时间，从不到1秒至几小时甚至几天都可以。样品和样品溶液的混合过程可以发生在通入反应池的导管内。或者，可以先将样品加入到反应池中，再将样品溶液加入反应池；也可以先将样品溶液加入到反应池中，再将样品加入反应池。
通常，应将磁珠加入样品并在进行磁珠分离之前静置一段时间，这段时间可以从几分钟至几小时甚至几天。可以在将能够选择性胞解红细胞的样品溶液加入样品之前、同时或之后在样品中加入磁珠。
样品、样品溶液以及附加的溶液、缓冲液、试剂可以以任何方便的方式加入反应池，例如通过移液管转移，注射器注射、由导管(例如聚乙烯导管等等)利用重力引入。一般，样品、样品溶液以及其它溶液、缓冲液、试剂以连续液流的方式加入反应池，这样的连续液流可以从至少一个入口注射入或是泵入反应池，然后，不含有样品组分和其它液体从至少一个出口流出反应池。
可以通过一个或是多个导管向样品中通入一种或是多种附加试剂，如微粒，但是这并不是本发明的必须要求。例如，可以先将一种或是多种附加试剂，如微粒加入样品，共同静置一段时间之后，再将样品加入到反应池中。或者，微粒可以通过与反应池相连的导管与样品接触，这样，微粒可以在样品流入反应池的过程中与样品相混合。也可以在将样品通入反应池的同时或是之后，将附加试剂如微粒通过一个或是多个导管通入反应池。如果需要使用多于一种的附加试剂，则它们可以按照上述的方法同时或是分别加入样品。
使用电磁力进行分离在电磁芯片上对磁珠进行操纵需要在芯片上产生相应的磁场分布。一种产生这样磁场的方式是使用电磁单元。当在电磁单元上施加电流时，可以产生相应的磁场。通过开/关信号和调节电流强度可以决定磁场的分布。根据所需的磁场分布要求，可以设计出具有不同结构和尺寸的微电磁单元。电磁单元的例子可以参见以下的参考文献，但不仅仅限于以下的内容Ahn，C.，et al.，J.Microelectromechanical Systems.Volume 5151-158(1996)；Ahn，C.，et al.，IEEE Trans.Magnetics.Volume 3073-79(1994)；Liakopouloset al.，in Transducers 97，pages 485-488，presented in 1997 InternationalConference on Solid-State Sensors and Actuators，Chicago，June 16-19，1997；US patent No.5,883,760 by Naoshi et al。其它电磁单元的例子可以参见正在申请过程中的美国专利，申请序号09/399,299，递交日期为1999年9月16日。
对磁性微粒的操纵包括磁性微粒的直接运动、聚焦和捕获。在磁场中，磁性微粒的运动可以称为“磁泳(magnetophoresis)”。关于用于细胞分离和其它应用的微粒磁泳的理论和方法可以参见以下参考文献Magnetic Microspheres in Cell Separation，by Kronick，P.L.in Methods of Cell Separation，Volume 3，edited by N.Catsimpoolas，1980，pages 115-139；Use of magnetic techniques for the isolation ofcells，by Safarik I.And Safarikova M.，in J.of Chromatography，1999，Volume 722(B)，pages 33-53；A fully integrated micromachined magneticparticle separator，by Ahn C.H.et al.，in J.of Microelectromechanicalsystems，1996，Volume 5，pages 151-157。有关使用电磁芯片对结合有磁性微粒的实体分子进行分离的内容可以参见美国专利申请(申请号09/399,299，递交日期1999年9月16日)。
图5的实体例子中，本发明的样品溶液中含有磁性微粒400，磁性微粒上带有可以与白细胞特异结合的抗体。血液样品包括白细胞420、红细胞450和其它实体分子和细胞(在图5中没有给出)。血液样品中加入样品溶液以使得红细胞胞解，再将样品-样品溶液混合物，包括磁性微粒400通入反应池。样品-样品溶液应在反应池中共同静置一段时间，以使得磁性微粒和白细胞充分结合。反应池中含有由微电磁单元组成的电磁芯片。在微电磁单元上施加电流，可以在芯片上将和白细胞结合的磁性微粒捕获。其它的样品组分可以通过泵如的液体洗去。
上述的例子可以使用其它抗体以捕获其它种类的细胞，那些可以和上皮细胞表面特异的表面抗原结合的抗体可以包被在磁性微粒的表面。这样，上述的方法可以从患者身上提取的外周血液中检测和捕获转移性乳腺癌细胞和转移性肺癌细胞这些上皮细胞。另外一个例子是从孕妇外周血液中捕获胎儿细胞。这个例子中，磁性微粒表面包被了可以与胎儿细胞特异结合的抗体。
实例下列的例子显示了本发明中用以分离样品中的实体分子的样品溶液的特性和使用方法。
例1对可以选择性胞解红细胞的样品溶液的分析下列溶液用以测试选择性胞解红细胞的效果。
(1.1)表格1人类血液样品和2％(质量百分比)的蔗糖缓冲液(大约60mOsm)以1∶19的比例混合。血液样品与蔗糖缓冲液混合后的不同时间，血液样品中的完整白细胞(WBC)和红细胞(RBC)可以在显微镜下观察并计数。根据表格1的数据，2％的蔗糖溶液可以作为本发明中的样品溶液。
(1.2)表格2人类血液样品和2.2％(质量百分比)的蔗糖缓冲液(大约66mOsm)以1∶19的比例混合。血液样品与蔗糖缓冲液混合后的不同时间，血液样品中的天然白细胞(WBC)和红细胞(RBC)可以在显微镜下观察并计数。根据表格2的数据，2.2％的蔗糖溶液可以作为本发明中的样品溶液。
(1.3)表格3人类血液样品和各种蔗糖缓冲液以1∶9的比例混合。血液样品与蔗糖缓冲液混合5-10分钟后，血液样品中的天然白细胞(WBC)和红细胞(RBC)可以在显微镜下观察并计数。根据表格1的数据，蔗糖溶液可以作为本发明中的样品溶液，并且与血液样品以除了9∶1以外的比例混合。
表格4人类血液样品和各种蔗糖缓冲液以1∶24的比例混合。血液样品与蔗糖缓冲液混合5-10分钟后，血液样品中的天然白细胞(WBC)和红细胞(RBC)可以在显微镜下观察并计数。
(1.5)其它类型的低渗红细胞胞解液(浓度为0.5％，0.65％，0.7％，0.75％，0.8％和0.85％甘油溶液，都是质量百分比)的试验结果为考虑到剩余的白细胞的数量以及白细胞和红细胞的比例，最佳情况是将0.8％的甘油溶液和血液样品以9∶1的比例混合。
(1.6)我们还对现在生物学实验室中常用的多种红细胞胞解液进行了测试，一种溶液是含有0.826％的氯化铵(质量/体积)，0.1％的碳酸氢钾，和0.0037％的EDTA的溶液，还有一种是1.1-1.2％(质量/体积)的草酸铵溶液(210mOsm)。这些溶液可以使红细胞胞解，在一段时间内只有一小部分的白细胞会受到影响。但是这些溶液具有非常高的电导率，对白细胞的介电电泳捕获和收集不能在其中进行。而且，这些溶液对白细胞是“有害的”，因为一段时间后(如30分钟)，溶液中的大多数白细胞也被胞解。所以这些溶液不适于用作本发明的样品溶液。
例2在低渗溶液中，利用介电迁移和介电滞留技术在芯片上对白细胞进行介电电泳分离将血液样品和2％的蔗糖溶液以1∶19的比例混合。再用微量进样器将40μl混合液注入容积为40μl的反应池。2μl血液样品中的白细胞数量为10-20×103个细胞。反应池中包含了一个玻璃芯片，其上制有相互交错的金/铂电极阵列。电极的特征尺寸(例如电极宽度、尖端宽度、相邻电极的距离)为50微米。电信号源(Hewlett Packard)产生的是频率为5MHz，峰峰值为5V的电信号。白细胞在电极边缘被收集，胞解的红细胞碎片被负向介电电泳力悬浮在电极平面上方，被引入的缓冲液冲出反应池。再将电极表面收集的白细胞洗出并计数。被收集的白细胞的数量为4.65×103。
例3在能够选择性胞解红细胞的溶液中，利用介电滞留技术对白细胞进行介电电泳分离将血液样品和2％的蔗糖溶液以1∶19的比例混合，在室温下静置5分钟以使得红细胞胞解。再将样品-样品溶液混合物加入由制作在玻璃基片上的相互交错的金/铂电极组成的介电电泳芯片上。电极的特征尺寸(例如电极宽度、尖端宽度、相邻电极的距离)为50微米。电信号源(Hewlett Packard)产生的是频率为5MHz，峰峰值为5V的电信号。白细胞在电极边缘被收集，剩余的样品-样品溶液可以在不影响被收集的白细胞的前提下被吸出反应池。再将电极表面收集的白细胞用PBS缓冲液洗出。
收集到的白细胞样品再用PCR技术对DQB基因进行分析。PCR反应体系(25μl)1μl的收集样品，19μl H2O，2μl引物，2.5μlPCR缓冲液，0.5μl dNTP(10mM)，1μl Taq酶。其中，特异针对DQB基因的引物是向生工(Sangon)公司订购的，序列为DQB 1引物15′-CATGTGCTACTTCACCAACGG-3′DQB 1引物25′-CTGGTAGTTGTGTCTGCACAC-3′在加入一单位的Taq酶(Cetus)之前，反应混合液先在95度下加热3分钟，再立刻冰浴3分钟。这样的步骤重复3次，使用的PCR仪为GeneAmp PCR System 9700，程序为94度解链30秒，55度退火30秒，72度延伸40秒，40个循环。
然后PCR产物在琼脂糖胶上电泳，特异的条带显示已经对白细胞成功的进行了分离，红细胞无核，不含有DQB基因。
例4使用可以选择性胞解红细胞的样品溶液和磁性微粒在电磁芯片上从血液样品中对白细胞进行磁力捕获用以准备结合白细胞的磁性微粒是12.5μl抗CD15的免疫分离磁珠(Dynal)和12.5μl抗CD45的免疫分离磁珠(Dynal)的混合物，装在微量离心管中。先用一块磁铁将磁珠吸附到管壁上，去除其它杂质，移开磁铁，在微量离心管中加入25μl Dyual公司白细胞磁性分离试剂盒中的PBS/BSA缓冲液(磷酸盐，Ph 7.4，含有0.1％BSA和0.6％柠檬酸钠)，使磁珠悬浮。用磁铁吸住磁珠，去除缓冲液，再加入缓冲液，使磁珠复溶在其中。
将100μl冷的血液样品和2％的蔗糖溶液以1∶19的比例混合。在室温下静置5分钟以使得红细胞降解。将抗CD15的免疫分离磁珠(Dynal)和抗CD45的免疫分离磁珠(Dynal)的混合物加入样品-样品溶液混合液。用进样器将样品和磁珠充分混合，将血液和磁珠在2-8度下静置15分钟。再将样品-样品溶液-磁珠混合物加入电磁芯片，其中电磁芯片包含一块硅的基片，其上制有导体线圈，线圈中心有铁磁核心。
用Keithley制造的直流源向线圈施加电流，可以对结合有磁珠的白细胞进行分离。这样结合有白细胞的磁珠被吸附在芯片的表面，而其它血液组分被流体洗出芯片。
所有的标题都是为了读者的方便，并不起限制标题下内容的作用。
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权利要求
1.一个样品溶液，当该样品溶液与样品混合后具有(a)选择性地修饰样品中至少一种成分的至少一个介电特性；(b)样品溶液具有合适的电导率，可以采用介电电泳力来分离样品中的一种或多种实体分子。
2.权利要求1中所述的样品溶液，其中所述的样品溶液具有比较低的渗透压。
3.权利要求1中所述的样品溶液，其中所述的溶液包含一种或多种两性离子。
4.权利要求1中所述的样品溶液，其中所述的溶液包含一种或多种酶。
5.权利要求1中所述的样品溶液，其中所述的溶液包含一种或多种洗涤剂。
6.权利要求1中所述的样品溶液，其中所述的溶液包含一种或多种特殊的结合体。
7.权利要求2中所述的样品溶液，其中所述的样品溶液可以选择性地对红细胞进行破胞处理。
8.权利要求7中的样品溶液，其中所述的样品溶液包含甘油。
9.权利要求8中所述的溶液，其中所述的溶液包含的甘油浓度保证当溶液与全血样品混和后，混和液中甘油的浓度介于0.075％到0.085％之间。
10.权利要求7中所述的样品溶液，其中所述的样品溶液包含蔗糖、甘露糖、甘露醇或山梨醇。
11.权利要求10中所述的样品溶液，其中所述的样品溶液包括蔗糖。
12.权利要求10中所述的样品溶液，其中所述的样品溶液中包含的蔗糖浓度保证当溶液与全血样品混和后，混和液中蔗糖的浓度介于0.05％到0.15％之间。
13.权利要求7中所述的样品溶液，其中所述的样品溶液不包括0.7％到1％的氯化铵和0.5％到2％的碳酸钾。
14.权利要求7中所述的样品溶液，其中所述的样品溶液不包括0.8％到1.6％的草酸铵。
15.用于分离样品中一种或多种实体分子的方法包括(a)加入权利要求1中所述的样品溶液；(b)利用介电电泳力分离所述样品中的一个或多个实体分子。
16.权利要求15中所述的方法，其中所述的实体分子是细胞。
17.权利要求16中所述的方法，其中所述的细胞是白细胞、肿瘤细胞、干细胞、未分化细胞、胎儿细胞、被病原体感染的细胞或是细菌细胞。
18.权利要求15中所述的方法，其中所述的实体分子可以是病原体或病原体的一部分。
19.权利要求15中所述的方法，其中所述的样品是血液样品。
20.权利要求19中所述的方法，其中所述的血液样品是来自人的血液样品。
21.权利要求15中所述的方法，其中所述的实体分子是在芯片上的流体池中被分离的。
22.权利要求21中所述的方法，其中所述的流体池是由玻璃、至少一种陶瓷、至少一种塑料或至少一种多聚物构成。
23.权利要求21中所述的方法，其中所述的流体池至少有一个端口。
24.权利要求23中所述的方法，其中所述的流体池含有两个端口。
25.权利要求23中所述的方法，其中所述的一个或多个导管与流体池上至少一个端口相连。
26.权利要求21中所述的方法，其中所述的血液样品是连续地加入流体池中。
27.权利要求21中所述的方法，其中所述的样品溶液是连续地加入流体池中。
28.权利要求21中所述的方法，其中所述的样品溶液是在样品之前加入到反应池中。
29.权利要求21中所述的方法，其中所述的样品是在所述的样品溶液加入之前加入到反应池中。
30.权利要求21中所述的方法，其中所述的往样品中加入样品溶液发生在样品加入到反应池之前。
31.权利要求21中所述的方法，其中所述的样品和所述的样品溶液同时加入到反应池中。
32.权利要求21中所述的方法，其中所述的芯片包括至少两个电极。
33.权利要求21中所述的方法，其中所述的芯片材料可以是玻璃、硅、橡胶、塑料、陶瓷或至少一种多聚物。
34.权利要求15中所述的方法，进一步还包括样品中至少一种实体分子与至少一种结合体之间的结合。
35.权利要求34中所述的方法，其中所述的至少一种结合体是至少一种微粒。
36.权利要求35中所述的方法，其中所述的至少一种微粒包括一个或多个特殊的结合体。
37.权利要求36中所述的方法，其中所述的至少一个结合体可以结合实体分子。
38.权利要求36中所述的方法，其中所述的一个或多个特殊结合体包括至少一个抗体或抗体片段。
39.权利要求36中所述的方法，其中所述的一个或多个特殊的结合体包括生物素、抗生物素蛋白、抗生物素链球菌蛋白。
40.权利要求36中所述的方法，其中所述的至少一种微粒包括一个或多个核酸分子。
41.权利要求35中所述的方法，其中所述的至少一种微粒材料是金属、陶瓷、塑料、碳、玻璃或多聚物。
42.权利要求35中所述的方法，其中所述微粒直径的大小介于2微米到50微米。
43.权利要求15中所述的方法，其中所述的分离是通过介电滞留、介电迁移、介电/重力场流分离、行波介电电泳或二维介电电泳来实现。
44.用于分离的血液样品中一个或多个实体分子的方法包括(a)加入权利要求1中所述的样品溶液；(b)往血液样品中加入至少一种包括一个或多个磁微粒的配制好的溶液；(c)将所述的血液样品加入到电磁芯片上；(d)所述的血液样品受电磁力的作用，感兴趣的实体分子被选择性地滞留在所述芯片上的一个或多个区域内。
45.权利要求44所述的方法，其中所述的感兴趣的实体分子是细胞。
46.权利要求45所述的方法，其中所述的细胞包括白细胞、肿瘤细胞、干细胞、未分化细胞、胎儿细胞、被病原体感染的细胞或是细菌细胞。
47.权利要求44所述的方法，其中所述的感兴趣的实体分子是病毒。
48.权利要求44所述的方法，其中所述的感兴趣的实体分子包括一个或多个蛋白。
49.权利要求44所述的方法，其中所述的感兴趣的实体分子包括一个或多个核酸分子。
50.权利要求44中所述的方法，其中所述的血液样品是来自人的血液样品。
51.权利要求44中所述的方法，其中所述的芯片包括至少一个能产生电磁力的部件。
52.权利要求44中所述的方法，其中所述的磁微粒包括一个或多个特殊的结合体。
53.权利要求52中所述的方法，其中所述的一个和多个结合体可以结合实体分子。
54.权利要求52中所述的方法，其中所述的一个或多个特殊的结合体包括至少一个抗体或抗体片段。
55.权利要求52中所述的方法，其中所述的一个或多个特殊的结合体包括生物素、抗生物素蛋白、抗生物素链球菌蛋白。
56.权利要求52中所述的方法，其中所述的至少一个特殊结合体包括一个或多个核酸。
57.权利要求44中所述的方法，其中所述的微粒材料为金属、陶瓷、玻璃、塑料或至少一种多聚物。
58.权利要求44中所述的方法，其中所述的微粒直径介于2微米到50微米。
59.权利要求44中所述的方法，其中所述的往血液样品中加入至少一种包含一个或多个磁微粒的溶液是在往电磁芯片中加入血液样品之前加入的。
60.权利要求44中所述的方法，其中所述的往血液样品中加入至少一种包含一个或多个磁微粒的溶液是在往电磁芯片中加入血液样品之后加入的。
全文摘要
本发明提供了一种样品溶液,当该样品溶液与样品混合后具有:(a)选择性地修饰样品中至少一种成分的至少一个介电特性;(b)样品溶液具有合适的电导率,可以采用介电电泳力来分离样品中的一种或多种实体分子。本发明还提供了使用该溶液分离样品中的实体分子的方法。
文档编号G01N27/26GK1348100SQ00131649
公开日2002年5月8日 申请日期2000年10月9日 优先权日2000年10月9日
发明者许俊泉, 王小波, 程京, 杨卫平, 吴镭 申请人:清华大学, 腾隆科技公司