一种化学发光测定磺胺二甲嘧啶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种化学发光测定磺胺二甲嘧啶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）液态组分1的制备；（2）液态组分2的制备；（3）制备HRP（辣根过氧化物酶）修饰的R1；（4）制备HRP修饰的R2；（5）磺胺二甲嘧啶的检测。本发明的含有聚乙二醇的化学发光体系具有更低的毒性、更高的闪点和更低的蒸气压这些优良特性，具有更好的贮存稳定性。本发明的精确性和特异性强、灵敏度和稳定性高、污染小，成本低、检测简便快捷。通过检测液态奶中磺胺二甲嘧啶的含量并利用加标回收法对该方法进行了考察，回收率在98.0%～100.3%之间，表明此方法在复杂基底中测定磺胺二甲嘧啶具有良好的准确度。
【专利说明】-种化学发光测定横胺二甲略惦的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学和化学发光领域，具体涉一种化学发光测定賴胺二甲嚼巧的 方法。
【背景技术】
[0002] 賴胺类药物为广谱抑菌剂，在结构上类似对氨基苯甲酸（PABA)，可与PABA竞争性 作用于细菌体内的二叶酸合成酶，从而阻止PABA作为原料合成细菌所需要叶酸的过程，减 少了具有代谢活性的四氨叶酸的量，而后者则是细菌合成嘿吟、胸腺嚼巧核巧和脱氧核糖 核酸值NA)的必需物质，因此抑制了细菌的生长繁殖。賴胺药的作用可被PABA及其衍生物 (普鲁卡因、下卡因）所枯抗，此外賊液W及组织的分解产物的存在也起枯抗作用，因其可提 供细菌生长的必需物质。
[0003] 白色或微黄色结晶或粉末，无莫，味微苦，遇光色渐变暗。本品在热己醇中溶解，在 水或己離中几乎不溶；在稀酸或稀碱溶液中易溶。用作饲料添加剂，用于防治葡萄球菌及溶 血性链球菌等的感染，即主要治疗禽霍乱、禽伤寒，鸡球虫病等。用于防治葡萄球菌及溶解 性链球菌等的感染，对溶血性链球菌及胸膜炎球菌等细菌有抑制作用，主要治疗禽霍乱、禽 伤寒、鸡球虫病等。用作抗菌剂，用于防治葡萄球菌及溶血性链球菌等的感染，适用于治疗 溶血性链球菌、脑膜炎球菌、肺炎球菌等感染。主要用于治疗禽霍乱、禽伤寒、鸡球虫病等。
[0004] 目前发展的賴胺二甲嚼巧检测方法包括酶联免疫法、质谱法、表面增强拉曼光谱 法、纳米金颗粒比色法和电化学方法等。该些方法各有其优点，能不同程度的满足对賴胺二 甲嚼巧的检测要求，但方法或者灵敏度不高、或者需要昂贵的仪器。
[0005] 草酸醋化学发光体系应能产生高效的化学光，具有良好的胆存稳定性并且是安全 的。其中含有叔醇的"过氧化氨组分"，一直W来被认为是最佳配方而被广泛应用。但是此 含有叔醇的"过氧化氨组分"胆存稳定性较低、光输出密度不高，尤其是存在着组分闪点低、 蒸气压高、安全性不佳等应予改进的缺陷。
[0006] 化学发光检测既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的 特点，易于标准化操作，且测试中不使用有害的试剂，试剂保质期长，应用于生物学、医学研 究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。目前市售的化 学发光免疫检测试剂盒中的酶促化学发光底物系统的缺点在于：检测的灵敏度和特异性不 够高、试剂稳定性不够、成本较高、检测不够简便快捷等等。所W必须发展一种灵敏度高，简 单的新型检测方法。
【发明内容】
[0007] 当有目标物賴胺二甲嚼巧存在时，通过功能化的磁珠作用，在修饰HRP的HRP-R1 和HRP-R2存在下进行链式杂交反应，发生磁性分离，再利用HRP对化学发光体系的催化作 用产生化学发光，通过测定化学发光强度实现对賴胺二甲嚼巧的测定。
[0008] 本发明是通过W下技术方案实现的：一种化学发光测定賴胺二甲嚼巧的方法，其 特征在于，所述方法包括w下步骤： (1) 液态组分1的制备：将磁性金纳米粒子用磯酸缓冲液洗涂后，加入250 y 1 0. 01M 草酸醋、0. 5X 1(T5 M的催化剂和至少0. 0001M英光剂，在37。C下反应12小时；将所得的 功能化磁性金纳米粒子用磯酸盐缓冲液洗涂，然后分散在磯酸盐缓冲液中，保存在5° C下 备用； (2) 液态组分2的制备；将磁性金纳米粒子用磯酸缓冲液洗涂后，120 yl I.OXIO^M 的溶于聚己二醇的过氧化氨，在37° C下反应12小时；将所得的功能化磁性金纳米粒子用 磯酸盐缓冲液洗涂，然后分散在磯酸盐缓冲液中，保存在5° C下备用； (3) 制备HRP (辣根过氧化物酶）修饰的R1;在150 yl 1.0X10-5 M的甘氨酸、50 yl 0. 003M的DTPA和80 y 1 0. 006M的苯甲酸轴混合液中加入15 mg N服（N-轻基玻巧醜亚 胺)，在37。C下揽拌2小时，然后加入130 yl HRP，在37。C下揽拌2化； (4) 制备HRP修饰的R2;在120 yl 1.0X10-5 M的3-氯-4轻基己醜苯胺、130 yl 0.5X10-5M四水合过测酸轴中加入12mgN服，在37。C下揽拌1小时，然后加入100 yl HRP，在37。C下揽拌2化； (5) 賴胺二甲嚼巧的检测：取含賴胺二甲嚼巧的标准溶液80 y L加入到220 y L的液 态组分1溶液，37° C反应50分钟，然后混合物在磁力架上分离，将上清液转移到液态组分 2溶液中；然后加入含有2. OXICTm HRP-R1和3. 0X10-7 M HRP-R2溶液250 11以在37 °C反应2 h后进行磁分离，除去上清液，将磁珠用120 UL磯酸缓冲溶液清洗两遍后，分散 于1. 0 ml磯酸缓冲溶液中，然后进行化学发光检测。
[0009] 上述催化剂为水杨酸轴、水杨酸四下基馈、水杨酸钟、水杨酸裡、5-氯水杨酸轴、 5-氯水杨酸裡、H氣己酸轴、五氯酷钟、苯甲酸四下基馈、高氯酸四下基馈中的一种或多 种。
[0010] 上述草酸醋组分中的草酸醋，包括双（2,-硝基苯基）草酸醋、双（2,4,6- H氯 苯基）草酸醋、双（2,4-二硝基苯基）草酸醋、双（2,4-二氯苯基）草酸醋、双（2,5-二 硝基苯基）草酸醋、双（2,6-二氯-4-硝基苯基）草酸醋一种或多种。
[0011] 上述的化学发光测定賴胺二甲嚼巧的应用。
[001引本发明所述的样品制备包括W下步骤：称取20 g鲜奶，加入20血CI3CCOOH和 60血C&OH混合溶液中，超声25 min,在10000 r/min转速下离也15 min后取上清液，用 0.4 ym的滤网膜过滤，对所得滤液进行分析测定，并进行加标回收实验。
[0013] 鲜奶样品中賴胺二甲嚼巧的测定检测结果如表1所示。
[0014] 本发明中的化学发光检测条件，具体特征如下： 检测杂交链式反应反应时间。随着反应时间增加，化学发光强度逐渐增大。但在反应 进行到60 min之后化学发光强度的增加幅度减缓。所W，实验选择60 min作为最佳的杂 交链式反应反应时间。
[0015] 分析性能如下： 本发明在最佳条件下，考察了賴胺二甲嚼巧浓度与化学发光强度的关系。结果表 明随着賴胺二甲嚼巧浓度增大，化学发光强度越大，并且化学发光强度与賴胺二甲嚼 巧浓度在1 nM?5000 nM范围内成非线性关系巧=547143.47*6义口^/4223147)-4286. 23*exp(-x/669. 24) - 542818. 62, R2= 0.9986 (y;化学发光强度；X;賴胺二甲嚼巧 浓度，单位；nM; n = 7)。化学发光强度与賴胺二甲嚼巧浓度在1 nM?100 nM范围成内线 性关系；y = 6. 9027X + 29. 317, R2 = 0. 9987,检测限为0. 3 nM。对50 nM的賴胺二甲嚼 巧进行7次平行测定的RSD为3. 8%。
[0016] 检测体系对賴胺二甲嚼巧的选择性。实验结果表明，当賴胺二甲嚼巧的浓度为1(T7 mol/L 时，误差在 5% 的范围内 1000 倍的 r、Na\ Mg"、Ca"、Fe3\ 畑4+、Ba"、Zn"、Cr、NO3-、 S042\ P0/\ C032\ CsCV、葡萄糖、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、维生素B2和维生素C ;500 倍的化"、抗坏血酸、腺嘿岭、鸟嘿岭，尿酸、ATP、甲硫氨酸、半脫氨酸；100倍的Cd"、Sn" 和化"均不干扰该方法对賴胺二甲嚼巧的响应。表明方法具有高的选择性。
[0017] 杂交链式反应的链增长是通过R1和R2序列进行交替连接而成的，因此两种 序列对于杂交链式反应体系来说缺一不可。为了进一步研究反应中杂交链式反应的生 长效率，在对比实验中只加入HRP-R2,保证一个目标物賴胺二甲嚼巧对应一个HRP，根据 HRP-luminol-R2化化学发光强度，对目标物进行定量。根据线性范围的下线确定杂交链式 反应的放大倍数。随着賴胺二甲嚼巧浓度的增大，化学发光强度越大，并且化学发光强度 与賴胺二甲嚼巧浓度在70 nM?1000 nM范围内呈线性关系；y = 0. 8891X - 38. 652，R2 = 0.9994,检测限为45 nM。如W线性范围的下限为对象对灵敏度进行比较，则杂交链式反应 灵敏度为非杂交链式反应的70倍。
[0018] 发明的有益效果： 本发明的含有聚己二醇的化学发光体系同传统的化学发光体系相比，也同样具有更低 的毒性、更高的闪点和更低的蒸气压该些优良特性，它输出的化学光光能量增加15%左右。 具有更好的胆存稳定性，明显的提高了它的货架寿命和胆存后的使用性能。本发明的精确 性和特异性强、灵敏度和稳定性高、污染小，成本低、检测简便快捷等，适合于检测免疫分 析。通过检测液态奶中賴胺二甲嚼巧的含量来检验方法的可靠性。并利用加标回收法对该 方法进行了考察，回收率在98.0% ^ 100.3%之间，表明此方法在复杂基底中测定賴胺二甲 嚼巧具有良好的准确度。
【具体实施方式】
[0019] (1)液态组分1的制备：将磁性金纳米粒子用磯酸缓冲液洗涂后，加入250 y 1 0. 01M双（2，-硝基苯基）草酸醋、0. 5X1(T5M的水杨酸轴和至少0. 0001M英光剂，在 37° C下反应12小时；将所得的功能化磁性金纳米粒子用磯酸盐缓冲液洗涂，然后分散在 磯酸盐缓冲液中，保存在5° C下备用； (2) 液态组分2的制备；将磁性金纳米粒子用磯酸缓冲液洗涂后，120 y 1 1. 0X 1(T5 M 的溶于聚己二醇的过氧化氨，在37° C下反应12小时；将所得的功能化磁性金纳米粒子用 磯酸盐缓冲液洗涂，然后分散在磯酸盐缓冲液中，保存在5° C下备用； (3) 制备HRP (辣根过氧化物酶）修饰的R1;在150 yl 1.0X10-5 M的甘氨酸、50 yl 0. 003M的DTPA和80 y 1 0. 006M的苯甲酸轴混合液中加入15 mg N服（N-轻基玻巧醜亚 胺)，在37。C下揽拌2小时，然后加入130 yl HRP，在37。C下揽拌2化； (4) 制备HRP修饰的R2;在120 yl 1.0X10-5 M的3-氯-4轻基己醜苯胺、130 yl 0.5X10-5M四水合过测酸轴中加入12mgN服，在37。C下揽拌1小时，然后加入100 yl HRP，在37。C下揽拌2化； (5)賴胺二甲嚼巧的检测：取含賴胺二甲嚼巧的标准溶液80 y L加入到220 y L的液 态组分1溶液，37° C反应50分钟，然后混合物在磁力架上分离，将上清液转移到液态组分 2溶液中；然后加入含有2. OXICTm HRP-R1和3. 0X10-7 M HRP-R2溶液250 11以在37 °C反应2 h后进行磁分离，除去上清液，将磁珠用120 UL磯酸缓冲溶液清洗两遍后，分散 于1. 0 ml磯酸缓冲溶液中，然后进行化学发光检测。
[0020] 样品的制备 本发明所述的样品制备包括W下步骤：称取20 g鲜奶，加入20血CI3CCOOH和60血 甜3册混合溶液中，超声化min,在10000 r/min转速下离也15 min后取上清液，用化4 ym 的滤网膜过滤，对所得滤液进行分析测定，并进行加标回收实验。
[0021] 结果与讨论 随着反应时间增加，化学发光强度逐渐增大。但在反应进行到60 min之后化学发光强 度的增加幅度减缓。实验选择60 min作为最佳的杂交链式反应反应时间。
[0022] 考察了食品中常含有的离子、氨基酸、维生素等成分对该方法测定賴胺二甲嚼巧 的选择性。实验结果表明，当賴胺二甲嚼巧的浓度为1(T 7 mol/L时，误差在5%的范围内 1000 倍的 K\ 化\ Mg2\ Ca"、化3+、畑4+、Ba2\ 化"、C1-、NO]-、SO*'-、PO*'-、COs'-、C2O4-、葡萄糖、 色氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、维生素B2和维生素C ;500倍的化"、抗坏血酸、腺嘿岭、鸟 嘿岭，尿酸、ATP、甲硫氨酸、半脫氨酸；100倍的CcT、Sn"和化"均不干扰该方法对賴胺 二甲嚼巧的响应。表明方法具有高的选择性，本方法具有应用到真实样品检测的可行性。
[0023] 考察了賴胺二甲嚼巧浓度与化学发光强度的关系。结果表明随着賴胺二甲嚼巧 浓度增大，化学发光强度越大，并且化学发光强度与賴胺二甲嚼巧浓度在1 nM ^5000 nM 范围内成非线性关系巧=547143.47*6又口（又/4223147)- 4286.23*6又口（-又/669.24)-542818.62, R2 = 0.9986。化学发光强度与賴胺二甲嚼巧浓度在1 nM?100 nM范围成内 线性关系；y = 6. 9027X + 29. 317, R2 = 0. 9987,检测限为0. 3 nM。对50 nM的賴胺二甲 嚼巧进行7次平行测定的RSD为3. 8%。
[0024] 杂交链式反应的链增长是通过R1和R2序列进行交替连接而成的，因此两种序 列对于杂交链式反应体系来说缺一不可。为了进一步研究反应中杂交链式反应的生长 效率，在对比实验中只加入HRP-R2,保证一个目标物賴胺二甲嚼巧对应一个HRP，根据 HRP-luminol-R2〇2化学发光强度，对目标物进行定量。根据线性范围的下线确定杂交链式 反应的放大倍数。随着賴胺二甲嚼巧浓度的增大，化学发光强度越大，并且化学发光强度 与賴胺二甲嚼巧浓度在70 nM?1000 nM范围内呈线性关系；y = 0. 8891X - 38. 652，R2 = 0.9994,检测限为45 nM。如W线性范围的下限为对象对灵敏度进行比较，则杂交链式反应 灵敏度为非杂交链式反应的70倍。
[00巧] 通过检测液态奶中賴胺二甲嚼巧的含量来检验方法的可靠性。并利用加标回收 法对该方法进行了考察，结果列于表1。回收率在98.0% ^ 100. 3%之间，表明此方法在复杂 基底中测定賴胺二甲嚼巧具有良好的准确度。
[0026] 表1鲜奶样品中賴胺二甲嚼巧的测定结果。
【权利要求】
1. 一种化学发光测定磺胺二甲嘧啶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 液态组分1的制备：将磁性金纳米粒子用磷酸缓冲液洗涤后，加入250 ill 0. 01M 草酸酯、〇. 5X 10_5 M的催化剂和至少0. 0001M荧光剂，在37° C下反应12小时；将所得的 功能化磁性金纳米粒子用磷酸盐缓冲液洗涤，然后分散在磷酸盐缓冲液中，保存在5° C下 备用； (2) 液态组分2的制备：将磁性金纳米粒子用磷酸缓冲液洗涤后，120 yl 1. OX 1(T5 M 的溶于聚乙二醇的过氧化氢，在37° C下反应12小时；将所得的功能化磁性金纳米粒子用 磷酸盐缓冲液洗涤，然后分散在磷酸盐缓冲液中，保存在5° C下备用； (3) 制备HRP (辣根过氧化物酶）修饰的R1:在150 ill 1.0X10_5M的甘氨酸、50 ill 0. 003M的DTPA和80 ill 0. 006M的苯甲酸钠混合液中加入15 mg NHS (N-羟基琥珀酰亚 胺)，在37 ° C下搅拌2小时，然后加入130 ill HRP，在37 ° C下搅拌24h; (4) 制备HRP修饰的R2:在120 ill 1.0X1(T5M的3-氯-4羟基乙酰苯胺、130 ill 0.5X10_5M四水合过硼酸钠中加入12mgNHS，在37 ° C下搅拌1小时，然后加入100 ill HRP，在37。C下搅拌24h ; (5) 磺胺二甲嘧啶的检测：取含磺胺二甲嘧啶的标准溶液80 yL加入到220 yL的液 态组分1溶液，37° C反应50分钟，然后混合物在磁力架上分离，将上清液转移到液态组分 2溶液中；然后加入含有2. 0X10-7 M HRP-R1和3. 0X10-7 M HRP-R2溶液250 iiL，在 37 °C反应2 h后进行磁分离，除去上清液，将磁珠用120 yL磷酸缓冲溶液清洗两遍后， 分散于1. 0 ml磷酸缓冲溶液中，然后进行化学发光检测。
2. 根据权利要求1所述一种化学发光测定磺胺二甲嘧啶的方法，其特征在于，所述催 化剂为水杨酸钠、水杨酸四丁基铵、水杨酸钾、水杨酸锂、5-氯水杨酸钠、5-氯水杨酸锂、 三氟乙酸钠、五氯酚钾、苯甲酸四丁基铵、高氯酸四丁基铵中的一种或多种。
3. 根据权利要求1所述一种化学发光测定磺胺二甲嘧啶的方法，其特征在于，所述草 酸酯组分中的草酸酯，包括双（2，_硝基苯基）草酸酯、双（2,4,6_三氯苯基）草酸酯、双 (2,4-二硝基苯基）草酸酯、双（2,4-二氯苯基）草酸酯、双（2, 5-二硝基苯基）草酸 酯、双（2,6_二氯-4-硝基苯基）草酸酯中的一种或多种。
4. 根据权利要求1所述一种化学发光测定磺胺二甲嘧啶的方法，其特征在于，所述的 化学发光测定磺胺二甲嘧啶的应用。
【文档编号】G01N21/76GK104422687SQ201310398119
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月4日 优先权日:2013年9月4日
【发明者】宋波 申请人:青岛蓝农谷农产品研究开发有限公司