新型超灵敏性elisa方法的建立的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种具有高检测灵敏度的新型ELISA方法，其检测灵敏度可达现有ELISA方法的100倍，本发明使用更为灵敏的新型的荧光底物取代传统ELISA方法中的化学显色底物，并且选择高效稳定的可催化所述荧光底物产生发光效应的酶作为标记酶，实现使底物的发光效应达到可检测水平所需的酶量最少，本发明还使用生物兼容性良好的金纳米颗粒偶联链霉亲和素系统实现酶促反应的放大效应，综合这三方面的改进措施，最终实现ELISA方法检测灵敏度的大幅度提高。
【专利说明】新型超灵敏性ELISA方法的建立
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种免疫学检测方法，尤其地涉及一种新的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。
【背景技术】
[0002]酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA),是一种基于抗原抗体间特异性反应建立的用于检测样品中抗原或抗体的免疫学检测方法，该方法具有简洁、快速、灵敏等特点。自从Engvall和Perlmann于1971年发明以来该方法得到了迅猛的发展，已广泛应用于各种抗原抗体的检测。其基本原理是将酶分子共价偶联在抗体或抗抗体分子上，这种偶联不改变抗体的免疫学特性以及酶的催化活性，酶标抗体再与吸附在固相载体上的抗原或抗体特异性结合，加入酶底物溶液后，底物在标记酶的催化下产生颜色反应，根据颜色反应的强弱来判断样品中抗原或抗体的含量。ELISA方法集酶催化反应的灵敏性和抗原抗体间结合的特异性于一体，从而赋予了此方法高灵敏性和高特异性。
[0003]以抗原抗体间特异性结合为基础的免疫学定量检测方法始于1959年由Yalow和Berson[2]发明的用放射性同位素标记来检测胰岛素的放射免疫试验。此后科学工作者在研究此类方法时发现，虽然该方法具有灵敏度高的优点，但同时存在用于标记的同位素对人身伤害性大，而且需要复杂的检测设备等缺点，因此大大限制了此方法的发展和广泛应用。1971年,Engval I和Perlmann用碱性磷酸酶代替放射性同位素标记抗体定量检测了血清中的免疫球蛋白，成功地建立了酶联免疫吸附试验，自此免疫血清学试验进入了酶标记时代。酶标记法较之前有明显的优点，首先该标记为共价标记，具有较好的稳定性，可保持数月至数年有效。其次，酶催化反应为显色反应，读数时仅需要廉价简单的光学仪器。再次，酶催化反应具有高效性，所以保证了 ELISA方法的高度灵敏性，这也是该方法一个显著的特点。用于标记的酶应该具备下特性:在不破坏抗原抗体结合的温度和PH条件下具有高度的酶活性；能够以简易敏感的方法检出；能够被大量地高度纯化，且保持可溶性和稳定性；应具有能够与抗原抗体共价结合的活性基团，并且结合后不影响其催化活性以及抗原抗体的结合活性；反应产物易于显现[3]。目前应用较多的有辣根过氧化物酶(HRP)、脲酶、碱性磷酸酶、β -半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最为广泛。HRP最常用的可溶性显色底物为联苯二胺(OPD)和四甲基联苯胺(ΤΜΒ)，其中，TMB是一种优于OPD的新型HRP色原底物。在HRP和H2O2的存在下，OPD氧化而聚合成2，2’ 一二氨基偶氮苯，ρΗ=1.0时，最大吸收波长492nm ；TMB氧化产生联苯醌，最大吸收波长450nm。
[0004]由于ELISA方法的诸多优点，自建立以来得到了迅速的发展和广泛的应用，仅在1976年就有报道称[4]，在当时的条件下已建立了 19种抗原28种抗体的ELISA检测方法。至今，该方法可检测的抗原抗体早已数不胜数。随着科技的进步ELISA方法已实现了高通量和自动化检测，同时检测灵敏度也成为了众多研究者和使用者关心的问题。在过去的几十年科研工作者在如何提高ELISA检测灵敏度上做出了巨大的努力，Kato等于1977年[5]建立了检测鸟氨酸氨基转移酶的非竞争性夹芯(“三明治”)ELISA方法，并且运用纯化抗体和抗体绞链区偶联技术，降低了背景值，检测灵敏性得到了显著的提高。阻碍ELISA方法灵敏性提高的主要因素是酶标抗体的非特异性结合而产生的高背景值，而降低背景值最简单有效的方法是，减小固相载体的表面积，为了解决这一问题，Ruan等于1987年[6]应用微球技术建立了微小型“三明治”酶联免疫试验，在夹芯ELISA的基础上进一步提高了灵敏度。Hashida等又于1988年m建立了一种新型的“三明治”转移酶联免疫试验方法，通过结合-洗脱-再结合的步骤，提高了特异性结合率，显著地降低了背景值，又一次提高了 ELISA方法的检测灵敏性。此后，提高灵敏性的研究主要集中在改进“三明治”转移酶联免疫试验方法以及将微小型“三明治”酶联免疫试验和“三明治”转移酶联免疫试验相结合来提高灵敏性上，包括抗原、抗体以及半抗原的检测技术M。1999年Ishikawat9]等应用“三明治”转移酶联免疫试验和微小型“三明治”酶联免疫试验相结合的方法建立了 HIV-lp24抗原的超敏感检测技术，使抗原的检测浓度低至pg/mL级。但是，无论微小型“三明治”酶联免疫试验还是“三明治”转移酶联免疫试验的试验步骤都较普通的夹芯ELISA法繁琐，而且这些方法每检测一种抗原都需要标记该抗原的一种甚至两种抗体，所以这两种方法没有得到广泛的应用，只有特殊要求的检测才会采用。相比之下，夹芯ELISA操作简单、快捷、标记一种抗抗体就能够检测多种抗原，并且标记的抗抗体容易被商品化，灵敏度能够达到一般的检测要求，所以，该方法得到了广泛接受和应用，并且沿用至今，并已商品化为多种抗原的检测试剂盒。此外，用荧光底物替代显色底物来提高检测灵敏性也有报道[1°]，荧光底物(以碱性磷酸酶为例)较显色底物敏感至少百倍。
[0005]自上世纪80年代纳米技术出现以来，由于其良好的生物兼容性，衍生出纳米生物学分支，将纳米粒子引入生物学研究领域，并已有学者将其应用于检测方法中来[11]，Nam使用微磁球、探针DNA芯片技术和银染相结合的方法(简称BCA法)使前列腺特异性蛋白(PSA)的最低可检测浓度降至lfg/mL (I X 10-18g/mL),与此前传统的PSA检测试剂盒相比灵敏性提高了 IO5倍。Nam等人于2004年又用该技术建立了检测DNA的方法[12]，灵敏性达到与PCR方法相当的水平(10个拷贝)。在随后的几年里，基于BCA方法又出现了多种蛋白的超灵敏性检测方法。Ambrosi等[13]用金纳米偶联酶标抗体的方法将检测乳腺癌的ELISA方法检测灵敏性提高了一倍。Tang等[14’15]于2007和2010年建立HIV_lp24抗原检测的BCA法使P24抗原的可检测浓度达到0.lpg/mL，与传统的ELISA方法相比灵敏性提高了 100倍，可提前3天检测到病人体内的p24抗原。由此可见纳米颗粒在检测方法中应用的广阔前景。
[0006]夹芯ELISA方法是目前最为常用的抗原和抗体的检测手段，该方法具有操作简单、快速、灵敏等优点。其基本原理是，检测抗体时，把相应的抗原分子包被在聚苯乙烯固相载体上，加入被检测样品，孵育，洗涤，加入酶标抗抗体，再孵育、洗涤，然后加入酶底物显色，在酶标仪上读取数据，根据底物显色反应的强弱来判断被检样品中抗体的含量；检测抗原时，把针对该抗原的抗体分子包被在固相载体上，加入被检样品，孵育，洗涤，再加入被检抗原的另一种抗体(二抗)，孵育，洗涤，加入酶标抗二抗的抗体，再孵育、洗涤，最后加入酶底物显色，读数，根据颜色反应的强弱来判断样品中抗原的含量。
[0007]虽然夹芯ELISA方法敏感性高，但随着生命科学、医学和光学检测领域的发展，简单快捷的ELISA方法的敏感性依然亟待提高，尤其在医学临床诊断方面，痕量病原微生物抗原的早期检测，对某些疾病尤其是传染病的早期诊断及时治疗以提高治愈率、尽早抑制病原体的传播具有重要意义。而现行ELISA方法中应用最广泛的标记酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP),其底物为OPD或TMB显色反应底物,该显色底物的灵敏度(在现有的条件下能够检测到显色反应所需的最低酶浓度，酶浓度越高灵敏度越低)要远低于荧光底物[1°]，这为ELISA方法灵敏性的进一步提高提供了理论基础。此外，被标记的抗抗体(MW:75kd)和HRP酶(MW:40kd)的分子大小相近，故每个抗抗体分子上偶联的酶分子个数较少，若被检样品中目的分子含量极少，随抗抗体结合到固相上的酶浓度便达不到显色底物的灵敏度，从而限制了 ELISA方法灵敏性。
【发明内容】
[0008]本发明提供了一种具有高检测灵敏度的新型ELISA方法，其检测灵敏度可达现有ELISA方法的100倍，本发明的改进之处在于:首先，使用更为灵敏的新型的荧光底物取代传统ELISA方法中的化学显色底物。其次，选择高效稳定的可催化所述荧光底物产生发光效应的酶作为标记酶，实现使底物的发光效应达到可检测水平所需的酶量最少。再次，应用生物兼容性良好的金纳米颗粒偶联链霉亲和素系统实现酶促反应的放大效应，综合这三方面的改进措施，最终实现ELISA方法检测灵敏度的大幅度提高(图1)。
[0009]本发明的具有高检测灵敏度的新型酶联免疫吸附试验方法，其特征在于，使用核酸酶作为标记酶，使用由通过核酸分子连接的淬灭基团和荧光基团组成的核酸分子水解荧光底物作为所述酶的底物，并使用可检测荧光的仪器检测所述酶催化所述底物产生的荧光来测量待测样品中目标物水平。
[0010]具体地，本发明的高灵敏度ELISA方法包括以下步骤:
[0011](a)使待测样品与固定化至固体支持物上的捕捉试剂接触并一起孵育，然后除去所述待测样品，其中所述待测样品中的目标物被所述捕捉试剂捕获形成目标物-捕捉试剂复合物，
[0012](b)将连接有核酸酶的结合试剂加入到所述固体支持物中并孵育，然后除去所述结合试剂，其中所述结合试剂与步骤(a)中形成的目标物-捕捉试剂复合物相结合，
[0013](c)将核酸分子水解荧光底物加入到所述固体支持物中并孵育，
[0014](d)使用可检测荧光的仪器检测荧光来测量待测样品中目标物水平，
[0015]其中，所述核酸分子水解荧光底物由通过核酸分子连接的淬灭基团和荧光基团组成，核酸分子完整时淬灭基团和荧光基团接近，荧光基团发射的荧光由淬灭基团吸收，整个分子不能被检测到荧光。当核酸分子被核酸酶水解后淬灭基团和荧光基团远离，荧光基团发射的荧光不能被淬灭基团吸收，从而使光检测系统检测到荧光信号。所述核酸分子可以是RNA (核糖核酸)或DNA (脱氧核糖核酸)，优选DNA。所述核酸分子可以为任意序列，也可以为单链或双链。所述核酸分子的长度可以为2bp以上，优选15bp以上，最大为约50bp，更优选为30bp。
[0016]所述荧光基团可以选自本领域已知的荧光基团，例如JOE (2，7 —二甲基一 4，5 —二氯一 6 —羧基荧光素)、FAM (羧基荧光素)、TET (四氯-6-羧基荧光素)等。JOE荧光产量高，PH敏感性弱，与淬灭基团IAbFQ接近时荧光淬灭完全，背景值低。优选地，所述荧光基团为J0E。
[0017]所述淬灭基团可以选自本领域已知的淬灭基团,例如IAbFQ (1wa Black突光淬灭剂，美国 Integrated DNA Technologies 公司)、BHQl (Black Hole Quencher-1,黑洞淬灭剂-1)、TAMRA (6-羧基四甲基若丹明)等。上述荧光基团与淬灭基团可自由组合成荧光基团淬灭基团对，只要淬灭基团的最大吸收波段落在荧光基团的最大发射波段即可，所述荧光基团和淬灭基团组合例如FAM-TAMRA、TET-BHQl、JOE-1AbFQ等，优选J0E_IAbFQ。
[0018]所述核酸酶可选择已知的可催化核酸分子水解的任何酶,优选TurboNuclease核酸酶。核酸酶可催化所述核酸分子水解荧光底物中的核酸分子水解，使得淬灭基团和荧光基团远离，产生发光效应。TurboNuclease核酸酶是Serratia macescens (沙雷菌属)的一种胞外核酸内切酶，对核酸具有高效的水解活性，对核酸的种类和序列无特异性，可以将单链和双链的DNA或RNA彻底切割成l_4bp的寡聚核苷酸。该酶的高效水解特性保证了ELISA方法的高度敏感性。
[0019]所述TurboNuclease核酸酶与本发明方法步骤(b)所述的结合试剂可直接连接，或者所述TurboNuclease核酸酶与所述结合试剂通过本领域已知的生物素_亲和素放大系统相连接。例如，可使用生物化的结合试剂与所述目标物-捕捉试剂复合物相结合，然后加入链霉亲和素，链霉亲和素与所述生物素化的结合试剂结合，然后加入生物素化的TurboNuclease核酸酶，其与所述链霉亲和素结合，最后加入核酸分子水解荧光底物，通过使用可检测荧光的仪器例如荧光定量PCR仪检测所产生的荧光来测量待测样品中目标物水平。
[0020]另外，使用生物兼容性较好的金纳米颗粒，与链霉亲和素偶联后可连接上数十个酶分子，从而以增加结合酶量的形式产生放大效应，增加荧光产量，进一步提高灵敏性。
[0021]本领域技术人员应理解，本发明的ELISA方法中灵敏度的提高仅涉及ELISA中的生物素-亲和素放大系统以及标记酶-底物检测系统，特别是标记酶-底物检测系统，而与具体检测所使用的抗体/抗原种类以及抗体/抗原与生物素/亲和素或固体支持物的连接方式或顺序无关，因此本发明的高灵敏度ELISA方法可用于检测任何传统ELISA方法可以检测的物质。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1.经典ELISA与本发明新型ELISA方法原理比较示意图。
[0023]图2.使用新型ELISA方法(A)与经典ELISA方法(B)以及无金纳米颗粒的新型ELISA方法(C)检测抗HIV-lgpl20单抗时灵敏度的比较。
[0024]图3.使用新型ELISA方法(A)与经典ELISA方法(B)检测抗EV71VP1单抗时灵敏度的比较。
【具体实施方式】
[0025]以下通过实施例来说明本发明的ELISA方法相对于传统ELISA方法的灵敏度的提高，但应理解，实施例仅为示例性目的，并非意在限制本发明的范围。
[0026]实施例
[0027]本文实施例中用到的实验材料及试剂等如下:
[0028]实验材料:
[0029]仪器:ELISA酶标板(JET BIOFIL, FEP-101-896，中国)，酶标仪(BioTek, ELx800,美国)，荧光定量 PCR 仪(Bio-Rad，Chromo4System, CFB-3240，美国)，PCR 八连管(Bio-Rad,TLS0801，美国)。
[0030]试剂:荧光底物5，_/5IAbFQ/GCG GAT CCC GCC TCT TGA GGC GGG ATC CGC (SEQID NO:1)/3J0E —N/-3’ (IO^4M, Integrated DNA Technologies，美国)，Tris (三羟甲基氨基甲烷，Genview，77-86-1，美国)，TMB (天根，PA107，中国)，氯化镁(Sigma，7786-30-3，美国)，链霉亲和素(Invitrogen,货号S888), 40nm金纳米颗粒-链霉亲和素(中国科学院长春应用化学研究所，中国)，生物素化 TurboNuclease (0.27mg/mL, Accelagen, N0103M,美国)，HIV-lgpl20 (1.86mg/mL,杜克大学人类疫苗研究所，美国)，生物素化抗HIV-lgpl20单抗(3B3,0.83mg/mL,杜克大学人类疫苗研究所，美国)，生物素化HRP (2.5mg/mL, Invitrogen,43-20-40，美国)。BSA (牛血清白蛋白Genview，9048-46-8，美国)，脱脂奶粉(伊利，中国)。EV71VP1蛋白(肠道病毒71型VPl蛋白，1.2mg/mL,由本实验室表达[16]保存)，生物素化抗EV71VP1的186&亚型单抗(2!12，0.81mg/mL,由本实验室制备[17’18]保存)。[0031]溶液:TurboNuclease反应缓冲液:50mM Tris-HCl 和 ImM MgCl2,pH=8.0。憐酸盐缓冲液(PBS):130mM NaCl、3mM KClUOmM Na2HP4,2mM KH2PO4, ρΗ=7.4。碳酸盐缓冲液:15mMNa2CO3, 35mM NaHCOyTurboNuclease 酶反应缓冲液:50mM ρΗ8.0 的 Tris-HCl 和 ImM MgCl20
[0032]实施例1使用本发明的新型ELISA方法检测抗HIV_lgpl20单抗
[0033]实骀步骤:
[0034]一、ELISA酶标板的包被。
[0035]1.将HIV-lgpl20用包被液(碳酸盐缓冲液，ρΗ9.6)稀释至2 μ g/mL，加入至ELISA酶标板孔中，100 μ L/孔。置于4°C，18h。
[0036]2.室温下，甩净孔内溶液，拍干。加入含2%0 (体积)Tween_20的PBS，250 μ L/孔，置于水平摇床上摇5min，甩净孔内洗涤液，拍干。重复洗涤5次。
[0037]3.加入200 μ L/孔的含5% (质量体积比)脱脂奶粉的PBS，置于37°C，4h。
[0038]4.室温下,甩净孔内溶液,拍干。加入含2%0 (体积)Tween_20的PBS，250 μ L/孔，置于水平摇床上摇5min，甩净孔内洗涤液，拍干。重复洗涤5次。真空包装，_20°C保存，待用。
[0039]二、ELISA 试验。
[0040]1.向包被好的ELISA板中加入100 μ L/孔的PBS，置于室温lOmin，甩净。
[0041]2.用含1%(质量体积比)BSA的PBS对生物素化3B3单抗(抗HIV_lgpl20，0.83mg/mL)进行10倍系列稀释，将稀释倍数分别为104、105、106、107、108、109、1010的3B3单抗以100 μ I/孔加入至ELISA板中，设置加入含1% (质量体积比)BSA的PBS而不加入3Β3单抗的孔作为阴性对照，置于37°C孵育1.5h。
[0042]3.室温下，甩净孔内溶液，拍干。加入含2%0 (体积)Tween_20的PBS，250 μ L/孔，置于水平摇床上摇5min，甩净孔内洗涤液，拍干。重复洗涤5次。
[0043]4.用含1%(质量体积比)BSA的PBS稀释40nm金纳米颗粒-链霉亲和素至0.05nM,以50 μ L/孔加入至ELISA板，置于370C 40min。
[0044]5.室温下，甩净孔内溶液，拍干。加入含2%0 (体积)Tween_20的PBS，250 μ L/孔，置于水平摇床上摇5min，甩净孔内洗涤液，拍干。重复洗涤5次。
[0045]6.用含1%(质量体积比)BSA的PBS稀释生物素化的TurboNuclease酶至0.27 μ g/mL,以100 μ L/孔加入至ELISA板，设置加入含1% (质量体积比)BSA的PBS而不加入TurboNuclease酶的孔作为空白对照，置于37°C 40min。
[0046]7.室温下，甩净孔内溶液，拍干。加入含2%0 (体积)Tween_20的PBS，250 μ L/孔，置于水平摇床上摇5min，甩净孔内洗涤液，拍干。重复洗涤5次。
[0047]8.用TurboNuclease酶反应缓冲液稀释荧光底物至0.5 X IO^6M,以50 μ L/孔加入至ELISA板，置于37°C孵育lh。
[0048]9.将ELISA板中的反应产物转移至PCR八连管内，用荧光定量PCR仪，读取荧光值。
[0049]试验结果及分析:
[0050]将荧光值> 2.1倍阴性对照均值判断为阳性，荧光值< 2.1倍阴性对照均值判断为阴性。新型ELISA检测结果如图2 (A)所示，阴性对照的平均值为0.104±0.002 (均值土标准差)，故荧光值> 0.22的稀释度为阳性，荧光值< 0.22的稀释度为阴性。本实验中IO6倍稀释的荧光值为0.448，为阳性；107倍稀释的荧光值为0.213，为阴性。所以该新型ELISA方法检测灵敏性可达到IO6倍稀释(对应的3B3单抗浓度为1.86 X 10_6mg/ml )。
[0051]实施例2使用经典ELISA方法检测抗HIV_lgpl20单抗
[0052]在与实施例1相同的试验条件下，使用生物素化HRP (使用浓度2.5Xl(T5mg/ml)替代生物素化TurboNuc I ease，使用TMB显色底物(使用浓度0.05g/L)替代荧光底物，使用无金纳米颗粒的链霉亲和素(使用浓度5X 10_4mg/ml)替代40nm金纳米颗粒-链霉亲和素，按实施例1所述步骤进行经典ELISA方法灵敏度检测。
[0053]试验结果如图2 (B)所示，阴性对照的平均值为0.082±0.001，所以当OD值>
0.17时的稀释度为阳性，OD值< 0.17时的稀释度为阴性，此次的实验结果中IO4倍稀释的OD值为0.884，为阳性；105倍稀释的OD值为0.138，为阴性。所以经典ELISA方法检测灵敏性只达到IO4倍稀释(对应的3B3单抗浓度为1.86X l(T4mg/ml)，比本发明的新型ELISA方法低了两个数量级。
[0054]实施例3使用无金纳米颗粒的新型ELISA方法检测抗HIV_1 gpl20单抗
[0055]在与实施例1相同的试验条件下，使用无金纳米颗粒的链霉亲和素(使用浓度5X l(T4mg/ml)替代40nm金纳米颗粒-链霉亲和素，按实施例1所述步骤进行不使用金纳米颗粒的新型ELISA方法的灵敏度检测。
[0056]试验结果如图2 (C)所示，阴性对照的平均值为0.103±0.001，所以当荧光值> 0.22时的稀释度为阳性，荧光值< 0.22时的稀释度为阴性，此次的实验结果中IO5倍稀释的荧光值为0.625，为阳性；106倍稀释的荧光值为0.20，为阴性，所以使用本发明的TurboNuclease酶及核酸分子水解突光底物而不使用金纳米颗粒的新型ELISA方法的灵敏性达到IO5倍稀释(对应的3B3单抗浓度为1.86X l(r5mg/ml)，相对于经典ELISA方法提高了一个数量级。
[0057]实施例4使用新型ELISA和经典ELISA方法检测抗EV71VP1单抗时灵敏度的比较
[0058](I)在与实施例1相同的试验条件下，使用EV71VP1蛋白和生物素化抗EV71VP1单抗，将抗EV71VP1单抗分别稀释IO1UO2UO3' 104、105、106、107、IO8、IO9和101°倍，按照实施例1所述步骤使用新型ELISA方法检测抗EV71VP1单抗，结果如图3 (A)所示，阴性对照的平均值为0.112±0.002，按照荧光值> 2.1倍阴性对照均值判断为阳性，荧光值< 2.1倍阴性对照均值判断为阴性的判断标准，此次实验中IO6倍稀释的荧光值为0.618，为阳性；107倍稀释的荧光值为0.20，为阴性，所以使用新型ELISA方法检测抗EV71VP1单抗时灵敏度达到IO6倍稀释。
[0059](2)在与实施例1相同的试验条件下，使用生物素化HRP (使用浓度2.5X 10—5mg/ml)替代生物素化TurboNuclease，使用TMB显色底物(使用浓度0.05g/L)替代荧光底物，使用无金纳米颗粒的链霉亲和素(使用浓度5X10—4mg/ml)替代40nm金纳米颗粒-链霉亲和素，使用EV71VP1蛋白和生物素化抗EV71VP1单抗，将抗EV71VP1单抗分别稀释1O102^103、104、105、106、107、108、IO9和1O10倍，按实施例1所述步骤使用经典ELISA方法检测抗EV71VP1 单抗。
[0060]结果如图3 (B)所示，阴性对照的平均值为0.098±0.002，按照OD值>2.1倍阴性对照均值判断为阳性，OD值< 2.1倍阴性对照均值判断为阴性的判断标准，此次实验中IO4倍稀释的荧光值为0.687，为阳性；IO5倍稀释的荧光值为0.18，为阴性，所以使用经典ELISA方法检测抗EV71VP1单抗时灵敏度达到IO4倍稀释。
[0061]由以上实施例可以看出，本发明的新型ELISA方法灵敏度可达经典ELISA方法的100倍，同时也证明本发明的新型ELISA方法可适用于以高灵敏度检测任何传统ELISA方法可以检测的物质。
[0062]参考文献:
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【权利要求】
1.一种酶联免疫吸附试验方法，其特征在于，使用核酸酶作为标记酶，使用由通过核酸分子连接的荧光基团和淬灭基团组成的核酸分子水解荧光底物作为所述酶的底物，并使用可检测荧光的仪器检测所述酶催化所述底物产生的荧光来测量待测样品中目标物的水平。
2.权利要求1的酶联免疫吸附试验方法，包括以下步骤: (a)使待测样品与固定化至固体支持物上的捕捉试剂接触并一起孵育，然后除去所述待测样品，其中所述待测样品中的目标物被所述捕捉试剂捕获形成目标物-捕捉试剂复合物； (b)将连接有核酸酶的结合试剂加入到所述固体支持物中并孵育，然后除去所述结合试剂，其中所述结合试剂与步骤(a)中形成的目标物-捕捉试剂复合物相结合； (c)将核酸分子水解荧光底物加入到所述固体支持物中并孵育； Cd)使用可检测荧光的仪器检测荧光来测量待测样品中目标物的水平。
3.权利要求2的方法，其中，所述核酸酶与所述结合试剂通过生物素-亲和素放大系统相连接。
4.权利要求3的方法，其中，所述核酸酶和结合试剂分别与生物素相连，它们通过偶联有链霉亲和素的金纳米颗粒连接。
5.权利要求2的方法，其中，所述捕捉试剂是抗原，所述结合试剂是抗体；或者所述捕捉试剂是抗体，所述结合试剂是抗原。
6.权利要求1-5之一的方法，其中，所述荧光基团为JOE、FAM或TET，所述淬灭基团为IAbFQ、BHQl 或 TAMRA。
7.权利要求6的方法，其中，所述荧光基团为J0E，所述淬灭基团为IAbFQ。
8.权利要求1-5之一的方法,其中,所述核酸酶为TurboNuclease核酸酶。
9.权利要求8的方法，其中，所述核酸分子的长度为2bp以上，最大为50bp。
10.权利要求9的方法，其中，所述核酸分子的长度为30bp。
【文档编号】G01N21/64GK103513027SQ201310455146
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】高峰, 姜春来, 范培虎, 孔维 申请人:长春百克生物科技股份公司