一种基于酪胺信号放大技术和适配体识别的金黄色葡萄球菌可视化检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种基于酪胺信号放大技术和适配体识别的金黄色葡萄球菌可视化检测方法，本发明涉及到分子生物学和微生物学的方法及技术，属于生物【技术领域】。其方法主要是利用生物素标记的金黄色葡萄球菌的适配体能够特异性的识别和结合金黄色葡萄球菌，从而实现对菌体的捕获，通过亲和素与生物素的结合将菌体固定到包被链霉亲和素的酶标板的底部，然后再将生物素标记的适配体和Streptavidin-HRP的复合物固定到菌体表面。在H2O2的作用下，HRP催化沉积生物素-酪胺分子沉积在HRP周围的位点上，这时体系中再次加入Streptavidin-HRP，通过生物素与链霉亲和素的结合而导致HRP大量的结合在菌体上，从而使信号实现几何级的放大。本方法建立的方法能够对金黄色葡萄球菌实现快速、灵敏、准确的检测，对于食品安全有着重要的意义。
【专利说明】一种基于酪胺信号放大技术和适配体识别的金黄色葡萄球菌可视化检测方法
【技术领域】
[0001]本发明主要是通过金黄色葡萄球菌适配体对金黄色葡萄球菌的特异性识别，并且通过酪胺信号放大的方法来实现可视化检测的。本发明涉及到分子生物学和微生物学的方法及技术，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]近些年来，食品质量与安全越来越引起人们的关注，并逐渐成为了一个社会焦点和热点问题，这其中由食源性致病菌引起的食品安全问题还是比较多的。金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性菌，它会产生一些对人体有毒的物质，比如毒素、酶和一些菌体成分。根据美国疾病预防与控制中心的统计，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒，占到整个细菌性食物中毒病例的33%，位居第二位，而加拿大则高达45 %。因此研究一种能够对金黄色葡萄球菌实现快速、准确、经济、可靠的检测方法是非常有必要的。但是一些传统的检测方法由于在特异性、灵敏度和操作方面存在着各种缺陷，无法满足人们对于食品安全的要求。
[0003]适配体是一种具有能够与靶分子高亲和性和特异性结合的一段DNA或RNA序列，这些靶分子包括一些药物、蛋白和其他有机、无机小分子，它是利用体外筛选技术一指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment, SELEX)，从含有IO13-1O15不同随机序列的DNA或RNA核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。此外由于适配体具有稳定、容易合成和进行化学修饰等优点，因此，适配体被广泛的应用于分析检测、疾病的诊断和治疗等方面，并且适配体在生物、化学及医学等领域有着十分重要的应用前景。
[0004]酪胺信号放大(TSA)技术是一种基于辣根过氧化物酶(HRP)催化的生物信号放大技术，其原理是在HRP酶催化下，大量连接半抗原的酪胺分子的沉积，这些半抗原主要是生物素、荧光光素等小分子物质。目前TSA技术在分子原位杂交、ELISA、分析检测、疾病诊断等方面有着十分广泛的应用。
【发明内容】
[0005]鉴于现有检测技术在检测的灵敏度、检测时间以及特异性上存在的缺陷，本发明主要是针对这些缺陷，提供了一种快速、特异性强、灵敏度高的可视化检测金黄色葡萄球菌的新方法。
[0006]本发明的优点:
[0007](I)由于金黄色葡萄球菌适配体能够高亲和力和特异性的与靶物质结合，因此本方法具有较高的特异性。
[0008](2)本发明中所涉及的各种试剂廉价易得，节省了实验成本，并且实验的操作步骤比较简单，因此，本发明在成本及实验操作具有优势。
[0009](3)本发明对金黄色葡萄球菌的检测限比较低，达到了 8cfu / mL ;而且检测范围较大，在IO7-1Ocfu / mL范围内线性良好(R2=0.9976)。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是特异性实验；a.金黄色葡萄球菌，b.鼠伤寒沙门氏菌，c.副溶血性弧菌，d.化脓链球菌，e.阪崎杆菌，f.大肠杆菌，g.单增李斯特菌。
[0011]图2是标准曲线；
[0012]图3是酪胺放大技术在本实验中的作用；a.未应用酪胺信号放大技术的检测方法，b.本方法
[0013]图4是本方法与传统平板计数法的相关性实验。
[0014]实验步骤:
[0015]1、合成生物素修饰的金黄色葡萄球菌适配体(上海生工生物工程股份有限公司完成)。
[0016]生物素修饰的适配体:5’-biotin-C6-GCAATG GTA CGG TAC TTC CTC GGC ACG TTCTCA GTA GCG CTC GCT GGT CAT CCC ACA GCT ACG TCA MA GTG CAC GCT ACT TTG CTM-3’。
[0017]2、制备生物素-酪胺。
[0018]准确称取IOmg Bio-NHS,溶于ImL DMF中制成溶液A ;称取2.8mg的酪胺盐酸，溶于0.28mL DMF中，然后加入2.8 μ L的三乙胺，制成溶液B ;将溶液A与溶液B充分震荡混匀，然后在室温下避光反应2h，加入8.72mL无水乙醇，从而制得IOmL生物素-酪胺溶液，并于4°C环境避光保存。
[0019]3、亲和素包被酶标板
[0020]将亲和素(lmg/mL)用碳酸盐包被液(Na2CO30.16g，NaHCO30.29g，IOOmL H2O:ρΗ9.6)按1:100稀释，每孔包被200yL，置于4°C环境，12h，拍干，用I XPBST (I XPBS缓冲液+0.05% (v / V)吐温20)洗涤3次，每次I分钟，拍干。
[0021]4、牛血清蛋白(BSA)封闭酶标板
[0022]每孔加入10(^1^1%85八溶液，371:摇床301^11，拍干，用I XPBST洗涤3次，拍干。
[0023]5、每孔加入10 μ L浓度为10-6πιο1 / L的生物素修饰的金黄色葡萄球菌适配体，37°C摇床30min，拍干，用I XPBST洗涤3次，每次I分钟，拍干。
[0024]6、每孔加入100μ L的样品，37°C摇床30min。同时将生物素修饰的金黄色葡萄球菌的适配体与链霉亲和素标记的HRP(StaptaVidin-HRP)按4:1的比例混匀，37°C孵育30min，拍干，用I XPBST洗涤3次，每次I分钟，拍干。
[0025]7、每孔加入10 μ L生物素修饰的适配体和Str印tavidin-HRP的复合物，37°C摇床30min，拍干，用I XPBST洗涤5次，每次I分钟，拍干。
[0026]8、取10 μ L生物素-酪胺溶液，加到酶标板中，然后再加入5 μ L0.5% (v / V)的过氧化氢(H2O2), 37。。孵育30min，拍干，用I XPBST洗涤3次，每次I分钟，拍干。
[0027]9、在酶标板的每个微孔中加入IOyL的Streptavidin-HRP, 37 °C孵育30min,拍干，用I XPBST洗涤5次，每次I分钟，拍干。
[0028]10、最后在每孔中加入100 μ LTMB显色试剂，室温放置20min后，加入50 μ L的终止液。
[0029]11、酶标仪检测吸光度值[0030]将酶标板置于酶标仪中，检测样品在450nm波长处的吸光度值。根据450nm处的吸光度值计算相应的金黄色葡萄球菌的数量。
【具体实施方式】:
[0031]以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。
[0032]实施例1:应用基于酪胺信号放大和适配体识别的金黄色葡萄球菌可视化检测方法检测水样
[0033]样品的处理:
[0034]本实验所选取的水样均采自于蠡湖，将3份水样室温下静置30min，从而将其中较大的团聚物和悬浮物沉淀，然后IOOOOrpm / min离心20min,再用0.45 μ m的滤膜过滤上清，以去除其中较小的悬浮物，防止其对本实验造成干扰；然后121°C灭菌处理20min。
[0035]应用本方法和传统的平板计数法对样品进行检测:
[0036]将过夜培养的金黄色葡萄球菌菌液用0.9%的生理盐水做梯度稀释，然后将稀释后的不同菌液加到已处理过的水样中；分别取100 μ L不同浓度的水样进行平板计数，另取100 μ L不同浓度的菌液采用本实验的方法进行检测，将得到的检测结果与平板计数法所得到的结果进行比较。实验结果如附图4.
【权利要求】
1.一种基于酪胺信号放大技术和适配体识别的金黄色葡萄球菌可视化检测方法，其特征在于:通过生物素修饰的金黄色葡萄球菌适配体将样品中的金黄色葡萄球菌捕获并将其固定到链霉亲和素包被的酶标板底部，另一条生物素标记的金黄色葡萄球菌的适配体将链霉亲和素标记的HRP(Streptavidin-HRP)引入检测体系中,然后经过酪胺信号放大技术使信号实现几何级的放大，最后加入TMB显色试剂和终止液，利用酶标仪检测吸光度值，基于此建立检测的标准曲线，达到检测金黄色葡萄球菌的目的。
2.如权利要求1所述的一种基于酪胺信号放大技术和适配体识别的金黄色葡萄球菌可视化检测方法，其特征在于生物素-酪胺的制备:准确称取IOmg Bio-NHS,溶于ImL DMF中制成溶液A ;称取2.8mg的酪胺盐酸，溶于0.28mLDMF中，然后加入2.8 μ L的三乙胺，制成溶液B ;将溶液A与溶液B充分震荡混匀，然后在室温下避光反应2h，加入8.72mL无水乙醇，从而制得IOmL生物素-酪胺溶液，并于4°C环境避光保存。
3.如权利要求1所述的一种基于酪胺信号放大技术和适配体识别的金黄色葡萄球菌可视化检测方法，其特征在于酪胺信号放大技术:将生物素标记的金黄色葡萄球菌的适配体与链霉亲和素标记的HRP (Sti^ptavidin-HRP)按4:1的比例混匀，37°C孵育30min，每孔加入10 μ L的适配体和Str印tavidin-HRP的复合物，取10 μ L的生物素-酪胺溶液，加到酶标板中，然后再加入5 μ L0.5% (V / V)的过氧化氢(H2O2)，37°C孵育30min，在酶标板的每个微孔中加入 10 μ L 的 St`reptavidin-HRP, 37°C孵育 30min。
【文档编号】G01N21/31GK103513033SQ201310473852
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年10月11日 优先权日:2013年10月11日
【发明者】王周平, 袁京磊, 何良兴, 茹巧美 申请人:江南大学, 杭州市余杭区农产品监测中心