单分子检测用扫描分析器和使用方法

单分子检测用扫描分析器和使用方法
【专利摘要】本发明涉及用于检测单分子或分子复合物的分析器，所述分析器使用迁移穿过样品的电磁辐射以检测分子的存在或不存在而不会在样品之间夹带。
【专利说明】单分子检测用扫描分析器和使用方法
[0001]本申请是申请日为2008年12月18日、申请号为200880127122.X、发明名称为“单分子检测用扫描分析器和使用方法”的专利申请的分案申请。
【背景技术】
[0002]生物医学研究、医学诊断、预后、监测和治疗选择、生物恐怖检测和其它涉及分析物的多个低体积、低浓度样品的分析的领域中的进展已经导致了能在不断降低的浓度下灵敏地检测样品中的颗粒的样品分析系统的发展。美国专利第4，793，705和5，209，834号描述了此前的实现极为灵敏的检测的系统。本发明提供了在该领域中进一步的发展。

【发明内容】

[0003]本文提供了一种单分子分析器，所述单分子分析器包含:(a)用于为包含样品的样品容器提供电磁福射的电磁福射源；(b)用于将来自所述电磁福射源的电磁福射导向样品中的询问空间(interrogation space)的系统；(c)用于使询问空间迁移通过样品的至少一部分由此形成可移动询问空间的迁移系统；和(d)用于检测询问空间中的单分子在该分子存在时所发射的电磁辐射的检测器，其中检测器与询问空间可操作地相连。在某些实施方式中，单分子分析器具有如下迁移系统:其中所述迁移系统能在一个或多个线性路径和非线性路径中迁移所述询问空间。在某些实施方式中，所述非线性路径基本为环形路径。在某些实施方式中，所述非线性路径基本为螺旋形模式。在某些实施方式中，所述非线性路径基本为栅格模式(raster pattern)。在某些实施方式中,本文所述的单分子分析器还包含具有表面的容器，所述表面适于和构造为将至少一个样品收纳和限制在该表面上。在某些实施方式中，所述样品容器是板。在某些实施方式中，所述板是微滴定板。
[0004]在所述单分子分析器的某些实施方式中，所述询问空间的有效体积为大于约I μ m3、大于约2 μ m3、大于约3 μ m3、大于约4 μ m3、大于约5 μ m3、大于约10 μ m3、大于约15 μ m3、大于约30 μ m3、大于约50 μ m3、大于约75 μ m3、大于约100 μ m3、大于约150 μ m3、大于约200 μ m3>大于约250 μ m3>大于约300 μ m3>大于约400 μ m3>大于约450 μ m3、大于约500 μ m3、大于约550 μ m3、大于约600 μ m3、大于约750 μ m3、大于约1000 μ m3、大于约2000 μ m3、大于约4000 μ m3、大于约6000 μ m3、大于约8000 μ m3、大于约10000 μ m3、大于约12000 μ m3、大于约 13000 μ m3、大于约 14000 μ m3、大于约 15000 μ m3、大于约 20000 μ m3、大于约30000 μ m3、大于约40000 μ m3或大于约50000 μ m3。在某些实施方式中，所述询问空间的体积为小于约50000 μ m3、小于约40000 μ m3、小于约30000 μ m3、小于约20000 μ m3、小于约 15000 μ m3、小于约 14000 μ m3、小于约 13000 μ m3、小于约 12000 μ m3、小于约 11000 μ m3、小于约9500 μ m3、小于约8000 μ m3、小于约6500 μ m3、小于约6000 μ m3、小于约5000 μ m3、小于约4000 μ m3、小于约3000 μ m3、小于约2500 μ m3、小于约2000 μ m3、小于约1500 μ m3、小于约1000 μ m3、小于约800 μ m3、小于约600 μ m3、小于约400 μ m3、小于约200 μ m3、小于约100 μ m3、小于约75 μ m3、小于约50 μ m3、小于约25 μ m3、小于约20 μ m3、小于约15 μ m3、小于约14 μ m3、小于约13 μ m3、小于约12 μ m3、小于约11 μ m3、小于约10 μ m3、小于约5 μ m3、小于约4μ m3、小于约3 μ m3、小于约2 μ m3或小于约I μ m3。在某些实施方式中，所述询问空间的体积为约Iym3?约10000 μ m3。在某些实施方式中,所述询问空间的体积为约I μ m3?约1000 μ m3。在某些实施方式中，所述询问空间的体积为约I μ m3?约100 μ m3。在某些实施方式中，所述询问空间的体积为约I μ m3?约50 μ m3。在某些实施方式中，所述询问空间的体积为约Iym3?约ΙΟμπι3。在某些实施方式中，所述询问空间的体积为约2 μ m3?约10 μ m3。在某些实施方式中,所述询问空间的体积为约3 μ m3?约7 μ m3。在某些实施方式中，所述询问空间的体积为约15 μ m3?约11000 μ m3。在某些实施方式中，所述询问空间的体积为约200 μ m3?约3000 μ m3。在某些实施方式中,所述询问空间的体积为约500 μ m3?约 600 μ m3。
[0005]在所述单分子分析器的某些实施方式中，所述单分子附在容器表面上。在某些实施方式中，所述分子通过非共价键附在所述容器的表面上。在另一个实施方式中，所述非共价键形成于所述分子和与所述容器的表面共价地或非共价地结合的抗体之间。在另一个实施方式中，所述非共价键形成于所述分子和位于容器表面的抗体之间。在某些实施方式中，所述单分子分析器还包含显微镜物镜(microscope objective),其中所述显微镜物镜的视场深度(depth of field)和激光束的侧向幅度共同限定了所述询问空间。在某些实施方式中，视场深度和成像于所述显微镜物镜的光圈(aperture)的直径共同限定了所述询问空间。在某些实施方式中，所述显微镜物镜适于和构造为收集从位于询问空间内的单分子发射的电磁辐射。在某些实施方式中，询问空间能被迁移通过样品的一部分。在某些实施方式中，迁移系统被构造和设置为使询问空间迁移通过样品的所述部分一次以上。在某些实施方式中，迁移系统被构建和设置为在第一次和第二次时以足够慢的速度迁移通过样品的同一部分，从而使得在询问空间第一次迁移通过所述样品部分时检测到的受关注分子能在所述样品部分第一次被询问空间询问以后基本扩散离开所述样品部分，并且还使得后续的受关注分子当存在时能在所述样品部分第二次被询问空间询问时基本扩散进入所述样品部分内。在某些实施方式中，迁移系统被构建和设置为以如下方式迁移询问空间:使得检测点在经过足够的时间后返回所述样品部分，从而在第一次通过时被检测到的分子能扩散离开所述部分而其它分子能扩散进入所述部分。在某些实施方式中，所述单分子分析器还包含能以基本环形模式迁移询问空间的系统。在该实施方式中，所述系统能以约100RPM?约1000RPM的速度迁移询问空间。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度大于100RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度大于300RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度大于500RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度大于700RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度大于900RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度小于1000RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度小于800RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度小于600RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度小于400RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度小于200RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为约100RPM?约1000RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为约200RPM?约900RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为约300RPM?约800RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为约400RPM?约700RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为约450RPM?约600RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为约450RPM?约550RPM。[0006]在某些实施方式中，所述单分子分析器适于和构造为依次检测在第一样品中特定类型的单分子存在或不存在和检测在第二样品中所述类型的单分子存在或不存在，其中在第一样品和第二样品之间没有夹带。
[0007]本文还提供了一种微滴定板，所述微滴定板包含:(a)底部，所述底部包含对于波长为550nm?800nm的光基本透明的材料并包含具有下述厚度的一个或多个部分:该厚度使得能通过位于所述部分的第二侧的大数值孔径透镜而在所述部分的第一侧上形成图像，且其中没有任何图像部分形成于底部内；和(b)表面，所述表面适于和构造为用于将至少一种液体样品收纳和限制在该表面上。在某些实施方式中，所述底部对于波长为600nm?750nm的光基本透明。在某些实施方式中，所述底部对于波长为630nm?740nm的光基本透明。在某些实施方式中，所述底部对于波长为630nm?640nm的光基本透明。在某些实施方式中，所述板表面包含一系列微孔(miCTowell)。在某些实施方式中，所述板包含比聚苯乙烯所发荧光更少的材料。
[0008]本文还提供了一种仪器，所述仪器能依次检测在第一样品中特定类型的单分子存在或不存在和检测在第二样品中所述类型的单分子存在或不存在，其中所述仪器适于和构造为使得在第一样品和第二样品之间没有夹带。
[0009]本文还提供了一种方法，所述方法能依次检测在第一样品中特定类型的单分子存在或不存在和检测在第二样品中所述类型的单分子存在或不存在，其中在第一样品和第二样品之间没有夹带。在某些实施方式中，在第一样品和第二样品中检测到受关注的单分子，其中所述第一样品和第二样品被收纳和限制在非一次性设备中。
[0010]本文提供了一种用于检测样品中单分子存在或不存在的方法，所述方法包括:(a)将来自电磁辐射源的电磁辐射导向样品中的询问空间；(b)在位于样品的第一位置处的询问空间中检测第一单分子存在或不存在；(C)使询问空间迁移通过样品至样品中的后续位置；(d)在样品的后续位置中检测后续单分子存在或不存在；和(e)根据需要重复步骤(C)和(d)，以便在一个以上样品位置中检测单分子存在或不存在。在本发明的某些实施方式中，询问空间的有效体积大于约I μ m3、大于约2 μ m3、大于约3 μ m3、大于约4 μ m3、大于约5 μ m3、大于约10 μ m3、大于约15 μ m3、大于约30 μ m3、大于约50 μ m3、大于约75 μ m3、大于约100 μ m3、大于约150 μ m3、大于约200 μ m3、大于约250 μ m3、大于约300 μ m3、大于约400 μ m3、大于约450 μ m3>大于约500 μ m3>大于约550 μ m3>大于约600 μ m3>大于约750 μ m3、大于约1000 μ m3、大于约2000 μ m3、大于约4000 μ m3、大于约6000 μ m3、大于约8000 μ m3、大于约 10000 μ m3、大于约 12000 μ m3、大于约 13000 μ m3、大于约 14000 μ m3、大于约 15000 μ m3、大于约20000 μ m3、大于约30000 μ m3、大于约40000 μ m3或大于约50000 μ m3。在某些实施方式，询问空间的有效体积小于约50000 μ m3、小于约40000 μ m3、小于约30000 μ m3、小于约 20000 μ m3、小于约 15000 μ m3、小于约 14000 μ m3、小于约 13000 μ m3、小于约 12000 μ m3、小于约11000 μ m3、小于约9500 μ m3、小于约8000 μ m3、小于约6500 μ m3、小于约6000 μ m3、小于约5000 μ m3、小于约4000 μ m3、小于约3000 μ m3、小于约2500 μ m3、小于约2000 μ m3、小于约1500 μ m3、小于约1000 μ m3、小于约800 μ m3、小于约600 μ m3、小于约400 μ m3、小于约200 μ m3、小于约100 μ m3、小于约75 μ m3、小于约50 μ m3、小于约25 μ m3、小于约20μπι3、小于约15 μ m3、小于约14 μ m3、小于约13 μ m3、小于约12 μ m3、小于约11 μ m3、小于约10 μ m3、小于约5 μ m3、小于约4 μ m3、小于约3 μ m3、小于约2 μ m3或小于约I μ m3。在某些实施方式中，询问空间的体积为约Iym3?约10000 μ m3。在某些实施方式中，询问空间的体积为约I μ m3?约1000 μ m3。在某些实施方式中，询问空间的体积为约I μ m3?约100 μ m3。在某些实施方式中，询问空间的体积为约I μ m3?约50 μ m3。在某些实施方式中，询问空间的体积为约I μ m3?约10 μ m3。在某些实施方式中，询问空间的体积为约3 μ m3?约7 μ m3。在某些实施方式中，询问空间的体积为约15 μ m3?约11000 μ m3。在某些实施方式中，询问空间的体积为约200μηι3?约3000μηι3。在某些实施方式中，询问空间的体积为约500 μ m3?约 600 μ m3。
[0011]在所述方法的某些实施方式中，所述询问空间在非线性路径中迁移。在另一个实施方式中，所述非线性路径包含基本环形路径。在另一个实施方式中，所述非线性路径包含基本螺旋形路径。在另一个实施方式中，相对于被导向至位于样品内的询问空间的电磁福射，样品保持基本静止。在某些实施方式中，样品在x-y轴中迁移，且电磁辐射源保持基本静态。在某些实施方式中，电磁辐射与样品均相对于彼此而迁移。在某些实施方式中，询问空间迁移通过样品的第一位置一次以上。在某些实施方式中，所述询问空间再一次以足够慢的速度迁移通过样品的第一位置，从而使得在询问空间迁移通过所述样品位置时被检测到的受关注分子当存在时能在所述样品位置被询问空间第一次询问以后基本扩散离开所述样品位置，并且还使得后续关注分子当存在时能在所述样品位置被询问空间第二次询问时基本扩散进入所述样品位置内。在某些实施方式中，以下述方式迁移询问空间:使得检测点在经过足够的时间后返回所述第一样品位置，从而使在第一次通过时被检测到的分子能扩散离开所述位置而其它分子能扩散进入所述位置。在某些实施方式中，所述方法还包括依次检测在样品中特定类型的单分子存在或不存在和检测在第二样品中同一类型的单分子存在或不存在，其中在第一样品和第二样品之间没有夹带。在所述方法的某些实施方式中，所述第一样品和第二样品被收纳和限制在非一次性设备中。
[0012]通过引用并入
[0013]本文通过引用并入本说明书中的所有出版物和专利申请，其程度等同于具体并单独指定将每个单独的出版物或专利申请通过参考并入。
【专利附图】

【附图说明】
[0014]本发明的新颖特点在所附权利要求中特别进行陈述。通过参考以下详细说明和附图可获得更好的对本方面的特点和优点的理解，所述详细说明对其中利用了本发明的原理的说明性实施方式进行描述，而在所述附图中:
[0015]图1A说明了从顶部观察所见的扫描单分子分析器；
[0016]图1B说明了从侧面观察所见的扫描单分子分析器；
[0017]图2描绘了显示出作为分子量为155KDa的分子的扩散半径的函数的该分子的扩散时间的图。
[0018]图3显示了使用扫描单分子分析器产生的检测事件数据。
[0019]图4显示了使用扫描单分子分析器通过检测一系列已知浓度的样品而产生的标准曲线。
【具体实施方式】[0020]1.引言
[0021]本发明提供了用于高度灵敏地检测单分子和用于确定样品中所述分子的浓度的仪器、试剂盒、组合物和方法。在某些实施方式中，本发明的仪器、组合物、方法和试剂盒的灵敏度和精度可通过选自但不限于以下因素的因素组合而获得:具有适当波长和输出功率的电磁源、适当的询问空间尺寸、大数值孔径的透镜、能检测单个光子的检测器以及用于对单分子计数的数据分析系统。本发明的仪器被称作“单分子检测器”或“单颗粒检测器”，且被术语“单分子分析器”和“单颗粒分析器”所涵盖。在某些实施方式中，本发明的试剂盒和方法的灵敏度和精度通过使用本发明的仪器连同选自但不限于以下因素的因素组合而获得:展示出使得分子能在单分子水平被检测的特性的分子标记和在本文所述的仪器中测试所述标记的方法。
[0022]本发明的仪器、试剂盒和方法尤其可用于灵敏和精确地检测单分子或小分子以及用于确定样品中所述分子的浓度。
[0023]在某些实施方式中，本发明提供了用于通过检测单分子而灵敏检测和确定分子浓度的仪器和试剂盒、用于此类检测和确定的标记和在样品分析中使用此类仪器和标记的方法。特别地，本发明的仪器、试剂盒和方法的灵敏度和精度使得可能处于极低浓度(例如，低于约100飞摩尔、10飞摩尔、I飞摩尔、0.1飞摩尔、0.01飞摩尔或0.001飞摩尔)的分子(例如，生物状态标记物)的浓度。在其它实施方式中，本发明的仪器和试剂盒能确定样品中在较大动态浓度范围内的物种的浓度(例如，分子的浓度)而无需对样品进行稀释或其它处理，例如，在大于IO5倍、IO6倍或IO7倍的浓度范围内。
[0024]本发明的仪器、试剂盒和方法的高灵敏度使得可使用此前因缺乏检测灵敏度而不可用的标记物，例如，生物标记物。本发明的仪器、试剂盒和方法的高灵敏度还有助于建立新型标记物。目前存在大量可获取的可能用于确定生物状态的标记物，但其由于目前受对其较低浓度范围的测定的限制而在目前未被实际使用。在某些情形中，异常高水平的标记物可通过当前方法检测，但正常范围未知。在某些情形中，异常高水平的标记物可通过当前方法检测，但正常范围尚未被确立。在某些情形中，正常范围的较高处的标记物可以被检测，但正常范围的较低处或低于正常范围的水平不能被检测。在某些情形中，例如癌症或感染的标记物，任何水平的标记物都能表明生物状态的存在，且检测灵敏度的提高对于早期诊断是一个优势。在某些情形中，标记物浓度在多个时间点的变化速率或没有变化提供了最有用的信息，但当前分析方法不允许在病况的较早阶段(此时其通常最可治疗)中进行时间点采样。在某些情形中，仅能通过使用在临床设定中不实际或不可用的繁琐方法(例如需要复杂样品处理和较为耗时的分析的方法)来在临床有用的水平对标记物进行检测。另外，存在如下的潜在生物状态标记物:其浓度低至足以使通过当前方法仍极难或无法检测其存在。
[0025]本发明的分析方法和组合物提供了使得能够检测处于此前无法检测的标记物浓度的生物状态标记物的灵敏度、精度和稳健性(robustness)水平，由此使得能将此类标记物从确认性标记物或仅可用于有限的研究设定中的标记物“重新利用(repurposing) ”为可用于临床设定和/或大规模临床设定(包括临床试验)中的诊断性、预后性、治疗针对性或其它类型的标记物。这类方法允许确定此类标记物的正常和非正常范围。
[0026]如此重新利用的标记物可用于例如:检测正常状态(正常范围)、检测(例如对于治疗、如药物施用的)响应物/非响应物(responder/non-responder);检测早期疾病或病变发生(例如，癌症早期检测、心肌缺血的早期检测)；疾病分期(例如，癌症)；疾病监测(例如，糖尿病监测、对治疗后癌症复发的监测)；疾病机制研究；和治疗毒性(例如，药物治疗的毒性)的研究。
[0027]由此，本发明提供了用于灵敏检测标记物的方法和组合物，以及确立标记物的正常和非正常水平的值的进一步方法。在其它实施方式中，本发明提供了基于对于标记物所确立的值的诊断、预后和/或治疗选择的方法。本发明还提供了用于此类方法中的组合物，例如，用于超灵敏检测标记物的检测试剂。
[0028]I1.扫描分析器系统用仪器和系统
[0029]本发明的方法采用扫描分析器，例如，单分子检测器。此类单分子检测器包括如下文所述的实施方式。
[0030]A.设备/系统
[0031]在一方面，本文所述的系统和方法采用能检测样品中的单个分子的扫描分析器系统。在一个实施方式中，所述扫描分析器系统能对位于样品容器内的样品提供来自电磁福射源的电磁辐射。单分子分析器包含将来自电磁辐射源的电磁辐射导向样品中的询问空间的系统。单分子分析器还包含用于将询问空间迁移通过样品的至少一部分由此形成可移动询问空间的迁移系统。在某些实施方式中，单分子分析器的检测器与单分子分析器的询问空间可操作地相连，由此使该检测器可检测到在单分子存在时从询问空间中的所述分子发出的福射。
[0032]在一方面，所述扫描分析器系统包含用于激发以荧光标记进行标记的单分子的电磁福射源。在一个实施方式中，分析器系统的电磁福射源是激光。在另一个实施方式中，电磁辐射源是连续波激光。
[0033]在一个典型实施方式中，当询问空间与标记相遇时，电磁辐射源激发与该标记相连的荧光部分。在某些实施方式中，荧光标记部分包含一个或多个荧光染料分子。在某些实施方式中，突光标记部分是量子点(quantum dot)。如本文所述的任何合适的突光部分均可用作标记。
[0034]在一个典型实施方式中，扫描分析器系统包含用于将电磁福射导向样品中的询问空间的系统。在某些实施方式中，样品的浓度使得询问空间不易于包含一个以上受关注的分子；例如，在多数情况下，询问空间含有O或I个受关注的单分子。然后可使询问空间移动通过样品以便检测位于整个样品中的单分子。在一个典型实施方式中，来自电磁辐射源的电磁辐射将与标记相连的荧光部分激发为电磁辐射，并使该电磁辐射所被导向的询问空间移动通过样品。
[0035]通常，扫描分析器系统还包含用于将询问空间迁移通过样品的至少一部分并由此形成可移动询问空间的迁移系统。该可移动询问空间可检测位于样品的不同部分中的多个受关注的单分子。
[0036]询问空间经过标记，随后该标记在受电磁辐射源激发时发射可检测量的能量。在一个典型实施方式中，单分子分析器含有与询问空间可操作地相连的检测器，该检测器用以检测由询问空间中的单分子发出的电磁辐射。电磁辐射检测器能够检测由标记(例如，由标记的荧光部分)发出的能量。[0037]B.扫描单分子分析器
[0038]如图1A和IB所示，这里所述的是扫描分析器系统100的一个实施方式。分析器系统100包含电磁福射源110、第一校准镜(alignment mirror) 112、第二校准镜114、二向色镜160、安装于扫描电机120的轴124上的旋转扫描镜122。如图1B所示，旋转扫描镜122将电磁辐射源反射通过第一扫描透镜130、通过第二扫描透镜132并通过显微镜物镜140到达样品板170。使用管透镜(tube lens) 180、光圈182、检测器滤光器188、检测器透镜186和检测器184来检测与位于样品板170上的单分子相关的荧光。接着，通过与检测器184可操作地偶联的处理器(未示出)来处理信号。在某些实施方式中，整个扫描分析器系统100安装于底板190上。
[0039]在操作中，校准电磁辐射源110以使得其输出126 (例如，光束)从第一校准镜112的前表面111反射至第二校准镜114再反射至安装于二向色镜托架162的二向色镜160。然后二向色镜160将电磁辐射126反射至位于扫描电极120的轴124尖端处的扫描镜122。然后电磁辐射126通过第一扫描透镜130和第二扫描透镜132到达显微镜物镜140。物镜140将光束126聚焦穿过样品板170的底部174，并将光束126导向位于光束126所进入的样品板170的相对侧的询问空间。使电磁辐射束126通过第一扫描透镜130和第二扫描透镜132以确保所有到达物镜140的光都有效地耦合。光束126使与位于样品板上的受关注单分子相连的标记激发。所述标记发出辐射，该辐射由物镜140收集。其后电磁辐射返回通过扫描透镜130、132，后者确保来自物镜140的辐射的耦合效率。所检测的辐射从扫描镜122的前表面反射至二向色镜160。由于所检测的荧光不同于电磁辐射源110的颜色，通过二向色镜160的荧光因而穿过光透镜180、光圈182、检测器滤光器188和检测器透镜186而到达检测器184。检测器滤光器188使因光散射或环境光产生的异常噪声信号最小化，同时使由与颗粒结合的激发荧光部分所发射的信号最大化。处理器根据本文所述的方法处理来自颗粒的光信号。
[0040]在一个优选实施方式中，显微镜物镜140具有一定的数值孔径(numericalaperture) 0如本文所用的，“大数值孔径透镜”包括具有大于或等于0.6的数值孔径的透镜。数值孔径是对由物镜捕获的经高度衍射的成像光线的数目的量度。较高的数值孔径使得不透明度渐增的光线能够进入物镜并由此产生更高分辨率的图像。图像亮度也随数值孔径增大而增加。大数值孔径透镜可商购自许多供应商，并且在所述分析器系统中可使用任何一种具有大于或等于约0.6的数值孔径的透镜。在某些实施方式中，透镜的数值孔径为约0.6?约1.3。在某些实施方式中，透镜的数值孔径为约0.6?约1.0。在某些实施方式中，透镜的数值孔径为约0.7?约1.2。在某些实施方式中，透镜的数值孔径为约0.7?约1.0。在某些实施方式中，透镜的数值孔径为约0.7?约0.9。在某些实施方式中，透镜的数值孔径为约0.8?约1.3。在某些实施方式中，透镜的数值孔径为约0.8?约1.2。在某些实施方式中，透镜的数值孔径为约0.8?约1.0。在某些实施方式中，透镜的数值孔径为至少约0.6。在某些实施方式中，透镜的数值孔径为至少约0.7。在某些实施方式中，透镜的数值孔径为至少约0.8。在某些实施方式中，透镜的数值孔径为至少约0.9。在某些实施方式中，透镜的数值孔径为至少约1.0。在某些实施方式中，显微镜物镜的孔径约为1.25。
[0041]大数值孔径(NA)的显微镜物镜是在进行透过样品板170的壁或底部的单分子检测时通常必需的，其工作距离较短。工作距离是从透镜前方至处于焦点的物体的距离。在某些实施方式中，物镜必需处在物体的350微米以内。在某些实施方式中，当使用NA为0.8的显微镜物镜 140 时，可使用 01ympus40X/0.8NA 水浸物镜(Olympus America, Inc., USA)。该物镜具有3.3mm的工作距离。在某些实施方式中，可使用具有2mm工作距离的01ympus60X/0.9NA水浸物镜。由于后一种透镜是水浸透镜(water immersion lens),因而物镜与样品之间的空间142必须充满水。这可通过使用水泡器(water bubbler)(未示出)或某些其它适合用于将水贮于物镜和样品板的底部之间的水管装置来完成。
[0042]在所有实施方式中，将电磁辐射源设定为使得激光波长足以激发与颗粒相连的荧光标记。在某些实施方式中，电磁福射源110是发射可见光谱中的光的激光。在某些实施方式中，该激光是波长为639nm的连续波激光。在其它实施方式中，该激光是波长为532nm的连续波激光。在其它实施方式中，该激光是波长为422nm的连续波激光。在其它实施方式中，该激光是波长为405nm的连续波激光。在不脱离本发明的范围的情况下，可使用任何具有适于激发本发明的方法和组合物中所用荧光部分的波长的连续波激光。
[0043]在单分子分析器系统100中，随着询问空间从经标记的单分子经过，被导向至该询问空间的电磁辐射源的光束126使得该标记进入激发态。当颗粒从其激发态弛豫时，发射出可检测的光粹发(burst of light)。在询问空间经过颗粒所需的时间长度中，该激发-发射循环被每个颗粒反复许多次。这使得分析器系统100能在询问空间经过颗粒时对每个颗粒检测到数十至数千个光子。检测器184记录由荧光颗粒发射的光子，并具有时滞，该时滞表明询问空间经过经标记的颗粒的时间。光子强度由检测器184记录，而采样时间被分为多个时段(bin)，其中所述时段是具有可自由选择的时间通道宽度的均一的任意时间段。对每个时段中所含的信号数进行评估。当存在颗粒时，可使用数种统计分析方法中的一种或多种。这些方法包括确定分析器系统的基线噪声和确定处于高于基线噪声的统计水平的荧光标记的信号强度以便减轻来自检测器的错误正信号。
[0044]1.电磁辐射源
[0045]所述分析器系统的某些实施方式采用化学发光标记。这些实施方式可能不需要颗粒检测用EM源。在其他实施方式中，外在标记或颗粒的内在特征是与光相互作用的，例如，荧光标记或光散射标记。在此类实施方式中，使用EM辐射源来照射标记和/或颗粒。优选用于激发荧光标记的EM辐射源。
[0046]在某些实施方式中，分析器系统由电磁辐射源110组成。在不脱离本发明的范围的情况下，可在扫描分析器系统100中使用任何数目的辐射源。此前的美国专利申请第11/048，660号已经公开了多种电磁辐射源，本文通过参考将其并入。在某些实施方式中，不同的连续波电磁(EM)福射源发射处于相同波长的电磁福射。在其它实施方式中，不同的源发射不同波长的EM福射。
[0047]在一个实施方式中，EM源110是产生200nm?IOOOnm的波长的连续波激光。连续波激光提供连续照射而不采用中断其照射的辅助的电子或机械装置(例如，快门)。此类EM源的优点是小型、耐用和相对廉价。另外，它们通常能够产生比其它光源更大的荧光信号。适合的连续波EM源的具体实例包括但不限于:氩气型、氪气型、氦氖型、氦镉型激光以及可调谐二极管激光(红光至红外区)，每种都具有倍频的可能性。在使用连续波激光的实施方式中，3mW的电磁辐射源可以具有足以激发荧光标记的能量。这种能量输出的光束的直径可以为2 μ m?5 μ m。当在3mW曝光时，经标记的颗粒可以被激光束曝光约I毫秒。在替代性实施方式中，颗粒可以被激光束曝光等于或小于约500微秒。在一个替代性实施方式中，曝光时间可小于或等于约100微秒。在一个替代性实施方式中，曝光时间可小于或等于约50微秒。在一个替代性实施方式中，曝光时间可小于或等于约10微秒。
[0048]发光二极管(LED)是另一种低成本、高度耐用的照射源。超亮LED和具有高吸收截面和量子产率的染料的进展已使得LED可用于单分子检测。此类LED光可单独地或与其它光源组合用于颗粒检测，所述其它光源例如汞弧灯、元素弧光灯、卤素灯、电弧放电、等离子放电及其任意组合。
[0049]在一个实施方式中，EM源包含脉冲波激光。在此类实施方式中，脉冲尺寸、尺寸、聚焦光斑和激光发射的总能量必须足以激发所述荧光标记。在某些实施方式中，可使用小于I纳秒的激光脉冲。在某些脉冲激光应用中可能优选具有这种持续时间的脉冲。在其它实施方式中，可用I纳秒的激光脉冲。在其它实施方式中，可用2纳秒的激光脉冲。在其它实施方式中，可用3纳秒的激光脉冲。在其它实施方式中，可用4纳秒的激光脉冲。在其它实施方式中，可用5纳秒的激光脉冲。在其它实施方式中，可用2纳秒?5纳秒的脉冲。在其它实施方式中，可使用具有更长的持续时间的脉冲。
[0050]最佳激光强度取决于单染料的光漂白特性和横穿询问空间所需的时长(包括颗粒速度、如果使用一个以上询问空间时询问空间之间的距离、以及询问空间的尺寸)。为获取最大信号，可在不会使较大百分比的染料发生光漂白的最高强度对样品进行照射。优选强度为使得经过颗粒横穿询问空间的时间后不超过5%的染料被漂白。
[0051]根据染料分子类型和染料分子被刺激的时长来设定激光功率。该功率还取决于询问空间穿过样品的速度。激光功率被定义为光束输送的能量的速率，以焦/秒或瓦为单位。为了在颗粒穿过时对询问空间提供恒定量的能量，随着激光的输出功率的增加，激光能照射颗粒的时间变少。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量大于约 0.1,0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100微焦(microJoule)。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约0.1微焦?100微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约I微焦?100微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约I微焦?50微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约2微焦?50微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约3微焦?60微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约3微焦?50微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约3微焦?40微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约3微焦?30微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约I微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约3微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约5微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约10微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约15微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约20微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约30微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约40微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约50微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约60微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约70微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约80微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约90微焦。在某些实施方式中，激光功率和照射时间的组合使得在照射期间由询问空间接收的总能量为约100微焦。
[0052]在某些实施方式中，激光输出功率被设定为至少约lmW、2mW、3mW、4mW、5mW、6mW、7mW、8mW、9mW、10mW、13mW、15mW、20mW、25mW、30mW、40mW、50mW、60mW、70mW、80mW、90mW、IOOmff或大于lOOmW。在某些实施方式中，激光输出功率被设定为至少约lmW。在某些实施方式中，激光输出功率被设定为至少约3mW。在某些实施方式中，激光输出功率被设定为至少约5mW。在某些实施方式中，激光输出功率被设定为至少约10mW。在某些实施方式中，激光输出功率被设定为至少约15mW。在某些实施方式中，激光输出功率被设定为至少约20mW。在某些实施方式中，激光输出功率被设定为至少约30mW。在某些实施方式中，激光输出功率被设定为至少约40mW。在某些实施方式中，激光输出功率被设定为至少约50mW。在某些实施方式中，激光输出功率被设定为至少约60mW。在某些实施方式中，激光输出功率被设定为至少约90mW。
[0053]激光照射询问空间的时间可以被设定为不少于约1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900 或 1000 毫秒。激光照射询问空间的时间可以被设定为不大于约2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500 或 2000 毫
秒。激光照射询问空间的时间可以被设定为约I毫秒?1000毫秒。激光照射询问空间的时间可以被设定为约5毫秒?500毫秒。激光照射询问空间的时间可以被设定为约5毫秒?100毫秒。激光照射询问空间的时间可以被设定为约10毫秒?100毫秒。激光照射询问空间的时间可以被设定为约10毫秒?50毫秒。激光照射询问空间的时间可以被设定为约10毫秒?20毫秒。激光照射询问空间的时间可以被设定为约5毫秒?50毫秒。激光照射询问空间的时间可以被设定为约I毫秒?100毫秒。在某些实施方式中，激光照射询问空间的时间为约I毫秒。在某些实施方式中，激光照射询问空间的时间为约5毫秒。在某些实施方式中，激光照射询问空间的时间为约10毫秒。在某些实施方式中，激光照射询问空间的时间为约25毫秒。在某些实施方式中，激光照射询问空间的时间为约50毫秒。在某些实施方式中，激光照射询问空间的时间为约100毫秒。在某些实施方式中，激光照射询问空间的时间为约250毫秒。在某些实施方式中，激光照射询问空间的时间为约500毫秒。在某些实施方式中，激光照射询问空间的时间为约1000毫秒。
[0054]在某些实施方式中，激光用提供3mW、4mW、5mW或大于5mW的输出功率的激光照射询问空间I毫秒、250毫秒、100毫秒、50毫秒、25毫秒或10毫秒。在某些实施方式中，用提供3mW的输出功率的激光照射标记，并照射标记约1000毫秒。在其他实施方式中，用提供不超过约20mW的输出功率的激光照射标记少于1000毫秒。在其它实施方式中，用20mW输出功率的激光对标记照射少于或等于约250毫秒。在某些实施方式中，用约5mW输出功率的激光对标记照射少于或等于约1000毫秒。
[0055]2.光学扫描系统
[0056]本文所述的扫描分析器系统不同于此前在其它地方描述的传统单分子分析器。在流式细胞术和其它荧光光谱方法中，样品流经询问空间。相反，本文所提供的分析器中的询问空间相对于样品移动。这可通过将样品容器相对于仪器固定并移动电磁福射束来完成。替代性地，可将电磁福射束固定并将样品板相对于该电磁福射束移动。在某些实施方式中，可使用这两者的组合。在迁移样品板以创建可移动询问空间的实施方式中，限制性因素是可足够光滑地移动板以使位于样品板上的样品不受震动并且使询问空间处于所需位置的能力。
[0057]在一个实施方式中，电磁福射源110聚焦于分析器系统100的样品板170上。来自连续波电磁辐射源110的光束126经光学聚焦穿过样品板的底部而到达处于位于样品板170上的样品内的指定深度平面。可使用反射镜或透镜来完成对样品的光学扫描。在某些实施方式中，反射镜122被安装于扫描电机120的扫描电机轴124的末端上,但相对于轴124以较小角度倾斜。在某些实施方式中，随着反射镜122的转动,其可反射电磁辐射束126，由此创建一个小环。通过将反射镜122置于物镜140与二向色镜160之间，物镜焦点处的光斑可在样品周围移动。在某些实施方式中，以环形模式扫描样品。在此类实施方式中，可形成直径为约500 μ m?约750 μ m的扫描环。在某些实施方式中，可形成直径为约600 μ m?约650 μ m的扫描环。可形成直径为约630 μ m的扫描环。在某些实施方式中，当使用直径为630 μ m的扫描环时，可以以约8转/秒(或约500RPM)横穿扫描环，这相当于将样品以约5μ I/分钟的速率泵入流动源。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为大于100RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为大于300RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为大于500RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为大于700RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为大于900RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为小于1000RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为小于800RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为小于600RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为小于400RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为小于200RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为约100RPM?约1000RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为约200RPM?约900RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为约300RPM?约800RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为约400RPM?约700RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为约450RPM?约600RPM。在某些实施方式中，询问空间的扫描速度为约450RPM?约550RPM。随着改进的电学和光学的发展，除以二维模式扫描以外，可能还需要在ζ轴扫描，以避免重复扫描同一分子。在某些此前提及的实施方式中，光学扫描模式使得在每次扫描样品的一部分时能扫描基本不同的部分。
[0058]在某些实施方式中，样品由电磁福射源扫描，其中该电磁福射询问样品的一部分。受关注的单分子可能存在也可能不存在于询问空间中。在某些实施方式中，将样品的一部分扫描第一次，然后随即扫描第二次。在某些实施方式中，将相同的样品部分扫描多次。在某些实施方式中，对样品进行扫描以使检测光斑在经过足够时间后第二次返回样品的一部分，由此使在第一次通过时被检测到的分子已飘移或扩散离开样品的该部分，而其它分子已飘移或扩散进入该部分。当样品的同一部分被扫描至少一次或多次时，扫描速度可能慢至足以允许分子扩散进入和离开被询问的空间。在某些实施方式中，使询问空间在第一次和第二次以足够慢的速度迁移通过样品的同一部分，从而使得在询问空间迁移通过所述样品部分时被检测到的受关注分子能在所述样品部分被询问空间第一次询问以后基本扩散离开所述样品部分，并且还使得后续关注分子当存在时能在所述样品部分被询问空间第二次询问时基本扩散进入所述样品部分内。图2显示了分子量为155KDa的分子的扩散时间相对于相应扩散半径的图。如本文所用，“扩散半径”是指在X轴所指明的时间中，从起始点起的分子最有可能扩散的距离的标准偏差。
[0059]在某些实施方式中，采用替代性扫描模式。在某些实施方式中，扫描模式可能近似于圆弧。在某些实施方式中，扫描模式包含至少一个90°的角度。在某些实施方式中，扫描模式包含至少一个小于90°的角度。在某些实施方式中，扫描模式包含至少一个大于90°的角度。在某些实施方式中，扫描模式基本为正弦曲线。在某些实施方式中，可使用如前所述的一个反射镜来进行光学扫描。在一个替代性实施方式中，可使用至少两个反射镜来进行光学扫描。多个反射镜允许以直线进行扫描以及允许系统来回进行扫描，从而创建蛇形模式。替代性地，多反射镜光学扫描设置允许以栅格模式进行扫描。
[0060]在一个替代性实施方式中，可使用光楔(optical wedge)来进行光学扫描。楔式扫描仪提供环形扫描模式并且因无需扫描透镜而使光路缩短。光楔类似于具有极小角度的棱镜。可将光楔安装于电磁辐射源的轴上。光楔旋转以创建光学扫描模式。在一个替代性实施方式中，可使用电子机械托架来安装扫描镜。在此类实施方式中，所述电子机械托架将具有两个音圈(voice coil)。一个音圈会使扫描镜在垂直方向位移。另一个音圈会使扫描镜在水平方向位移。使用此实施方式，可以创建任何所需扫描模式。
[0061 ] 在某些实施方式中，扫描颗粒分析器以二维取向扫描位于模具样品板中的样品，例如，沿着样品的χ-y平面。在某些实施方式中，可以以三维取向来扫描样品，这由在x-y平面和ζ方向的扫描构成。在某些实施方式中，可以同时沿x-y和ζ方向对样品进行扫描。例如，可以以螺旋模式扫描样品。在某些实施方式中，可以仅在ζ方向扫描样品。
[0062]在某些实施方式中，扫描透镜(130，如图1A和IB所示)能将扫描光路重新导向物镜的光瞳。扫描透镜将扫描镜上的光轴的图像聚焦至物镜的出瞳(exit pupil)。不论扫描镜与显微镜物镜之间的距离如何，扫描透镜确保扫描光束保持在物镜中心，由此改善图像和扫描光束的光采集效率。
[0063]3.询问空间
[0064]本文所述的发明涵盖了询问空间的使用，可认为该询问空间是其中可在受关注的单分子存在时对其进行检测的有效样品体积。尽管存在各种计算样品的询问空间的方法，最简单的确定询问空间的有效体积(V)的方法是计算检测体积的有效截面。由于通常通过将检测体积迁移穿过静止样品来将检测体积扫过样品，该体积通常是在测量时间段中检测体积的横截面积扫过一定距离的结果。如果样品浓度(C)已知，且一定时段期间所检测到的分子数(N)已知，则样品体积由所检测的分子数除以样品浓度构成，或V = N/C(其中，样品浓度的单位为分子/单位体积)。[0065]例如，在本文所述的系统的某些实施方式中，对所有检测到的光子计数并以I毫秒片段(光子计数时段)进行加和。如果受关注的分子存在于该I毫秒片段中，则所检测到的光子的计数通常显著高于背景。因此，检测体积已相对于样品移动过的距离是用于计算单个片段中采样的体积(即询问空间)的大致距离。在该实例中，如果对样品分析60秒，则可以有效地扫描60，000个片段。如果将有效体积除以片段数，则所得体积基本上是单个片段的体积，即询问空间。在数学上，单个片段的体积(即询问空间体积(Vs))等于所检测分子数(N)除以样品浓度，再乘以片段时段数(On——其中η表示在N个分子数被计数期间的片段时段的数目)。仅出于示例性目的，考虑一个I飞摩尔浓度的已知标准物运行通过60，000个片段，且检测到20个标准物分子。于是，询问空间体积Vs等于N/(On)或20/(602.214..6Ε4)，* 553.513μπι3。因此，在该实例中，作为对应于一个光子计数时段的一个样品的有效体积的询问空间体积为553.513 μ m3。
[0066]另外，从此前所述的询问体积，可用具有与本文所述的发明相似的光学器件的毛细管流动系统来近似得出样品片段的横截面积。横截面积(A)通过以询问体积(Vs)除以检测片段移动的距离(t)来近似得出。检测片段移动的距离(t)由i T.8/χ给出，其中t是流速(r)、样品粘度(i)、片段时段时间(s)和毛细管横截面(X)的函数。仅出于示例性目的，考虑时段时间(s)为I毫秒、流速(r)为5μ L/分钟、粘度因子(i)为2，且毛细管横截面积为(X) 10，000 μ m2。于是，检测片段移动的距离⑴*?..8/χ*(2*5μΙν^Ηψ*1Ε-3秒)或16.7μπι给出。检测器光斑的有效横截面积(A)还可以以Vs/t来计算，或者(553.513 μ m3)/(16.7 μ m)或33 μ m2。注意，询问体积(Vs)和询问体积的横截面积的值均取决于时段划分时间。
[0067]询问空间的尺寸的下限受当前可利用的激发能量的波长的限制。询问空间尺寸的上限由所需的信噪比决定——询问空间越大，来自例如拉曼散射的噪声越大。在某些实施方式中，询问空间的体积 为大于约I μ m3、大于约2 μ m3、大于约3 μ m3、大于约4 μ m3、大于约5 μ m3、大于约10 μ m3、大于约15 μ m3、大于约30 μ m3、大于约50 μ m3、大于约75 μ m3、大于约100 μ m3、大于约150 μ m3、大于约200 μ m3、大于约250 μ m3、大于约300 μ m3、大于约400 μ m3、大于约500 μ m3、大于约550 μ m3、大于约600 μ m3、大于约750 μ m3、大于约1000 μ m3、大于约2000 μ m3、大于约4000 μ m3、大于约6000 μ m3、大于约8000 μ m3、大于约10000 μ m3、大于约 12000 μ m3、大于约 13000 μ m3、大于约 14000 μ m3、大于约 15000 μ m3、大于约 20000 μ m3、大于约30000 μ m3、大于约40000 μ m3或大于约50000 μ m3。在某些实施方式中，询问空间的体积为小于约50000 μ m3、小于约40000 μ m3、小于约30000 μ m3、小于约20000 μ m3、小于约 15000 μ m3、小于约 14000 μ m3、小于约 13000 μ m3、小于约 12000 μ m3、小于约 11000 μ m3、小于约9500 μ m3、小于约8000 μ m3、小于约6500 μ m3、小于约6000 μ m3、小于约5000 μ m3、小于约4000 μ m3、小于约3000 μ m3、小于约2500 μ m3、小于约2000 μ m3、小于约1500 μ m3、小于约1000 μ m3、小于约800 μ m3、小于约600 μ m3、小于约400 μ m3、小于约200 μ m3、小于约100 μ m3、小于约75 μ m3、小于约50 μ m3、小于约25 μ m3、小于约20 μ m3、小于约15 μ m3、小于约14 μ m3、小于约13 μ m3、小于约12 μ m3、小于约11 μ m3、小于约10 μ m3、小于约5 μ m3、小于约4 μ m3、小于约3 μ m3、小于约2 μ m3或小于约I μ m3。在某些实施方式中，询问空间的体积为约I μ m3~约10000 μ m3。在某些实施方式中，询问空间的体积为约I μ m3~约1000 μ m3。在某些实施方式中，询问空间的体积为约I μ m3~约100 μ m3。在某些实施方式中，询问空间的体积为约I μ m3?约50 μ m3。在某些实施方式中，询问空间的体积为约I μ m3?约10 μ m3。在某些实施方式中，询问空间的体积为约2 μ m3?约10 μ m3。在某些实施方式中，询问空间的体积为约3 μ m3?约7 μ m3。
[0068]4.样品板
[0069]本文所述的发明的某些实施方式使用样品板170来收纳针对受关注的分子进行检测的样品。在某些实施方式中，所述样品板是微滴定板。微滴定板由底部172和顶表面174组成。在某些实施方式中，微滴定板的顶表面174由至少一个孔构成，以收纳受关注的样品。在某些实施方式中，微滴定板由多个孔构成，以收纳多个样品。本文所述的系统足够灵敏，因此仅需要较小的样品尺寸。在某些实施方式中，样品尺寸可小于约100μ I。在某些实施方式中，样品尺寸可小于约10 μ I。在某些实施方式中，样品尺寸可小于约I μ I。在某些实施方式中，样品尺寸可小于约0.1 μ I。在某些实施方式中，样品尺寸可小于约0.001 μ L.在某些实施方式中，微滴定板可以是用微细加工技术构建的微滴定板。在某些实施方式中，板的顶表面可以是光滑的。可将样品的尺寸设定为使得该样品因该样品自身的表面张力而独立(self-contained)。在此类实施方式中,样品在板表面上形成微滴。在某些实施方式中，可在其后对样品进行针对受关注分子的扫描。
[0070]通常，透过样品板材料(例如，透过微孔的壁)对样品进行扫描。在某些实施方式中，透过样品板的底部对样品进行扫描。在某些实施方式中，样品板的底部由对光透明的材料制成。在某些实施方式中，样品板的底部由对电磁辐射透明的材料制成。样品板对于受关注的激发波长是透明的。使用透明材料使得激发光束的波长能通过样品板并激发受关注的分子或与受关注分子偶联的荧光标记。板的透明度还使得检测器能检测来自受激发的受关注分子的发射。在某些实施方式中，底部材料对于波长为550nm?800nm的光是基本透明的。在某些实施方式中，底部材料对于波长为600nm?700nm的光是基本透明的。在某些实施方式中，板材料对于波长为620nm?680nm的光是基本透明的。在某些实施方式中，板材料对于波长为630nm?660nm的光是基本透明的。在某些实施方式中，板材料对于波长为630nm?640nm的光是基本透明的。
[0071]此外，还考虑到样品板的厚度。样品通过穿过板材料的一部分的电磁辐射源进行扫描。板的厚度使得能在通过通过大数值孔径透镜扫描的板部分的第一侧上形成图像，所述大数值孔径透镜位于被扫描的板部分的第二侧上。此类实施方式有助于在样品内而不是在底部内形成图像。所形成的图像对应于系统的询问空间。图像应形成于受关注的单分子的深度。如前所述，板的厚度取决于所用透镜的工作距离和视场深度。商购板的厚度通常为650微米。
[0072]板可由允许激发能量穿透该板的任何合适材料制成。在某些实施方式中，板由聚苯乙烯制成。在某些实施方式中，板由聚碳酸酯制成。在某些实施方式中，板由聚乙烯制成。在某些实施方式中，可使用商购板，例如品牌为NCNC?的板。在优选实施方式中，板由具有低荧光的材料制成，由此减少背景荧光。例如，优选的材料可能比由聚苯乙烯制成的板发出的荧光更少。因板材料造成的背景荧光还可通过使板的厚度最小化而避免。
[0073]在某些实施方式中，样品由可能含有特定类型的分子的较小体积的流体构成。在此类实施方式中，受关注的单分子在存在时能在流体体积中的任何位置被检测和计数。在某些实施方式中，对样品进行扫描包括对更浓缩的较小样品进行扫描。在此类实施方式中，光学扫描可在样品板的表面发生，例如，如果最高浓度的分子位于样品板表面时。如果单分子吸附于板表面或者如果其与板表面所附着的抗体或其它结合分子相结合，则可能发生这种情况。当使用抗体来捕获受关注的单分子时，可将抗体涂布于样品板表面，例如微孔的底部。其后受关注的单分子与位于微孔内的抗体结合。在某些实施方式中，执行洗脱步骤以除去结合的关注单分子。然后可在较小的样品体积中检测未结合的分子存在或不存在。在执行洗脱步骤的某些实施方式中，单分子可能与顺磁珠相连，也可能不与之相连。如果不使用珠，则可将洗脱缓冲液添加至样品孔中，且可以检测受关注的单分子存在或不存在。在某些实施方式中，将顺磁珠用作捕获珠以便捕获受关注的单分子。
[0074] 在本文所述的扫描单分子分析器的某些实施方式中，电磁(EM)辐射源被导向样品询问空间而不通过样品板的材料。在导向样品的光束的同一侧上的样品中发生成像。在此类实施方式中，可以但并非必须使用水浸透镜，以透过气-液界面而将样品成像。在物镜不与样品接触的零夹带系统中，不会发生样品间的样品夹带。
[0075]5.检测器
[0076]在一个实施方式中，对在暴露于电磁福射之后由突光标记发出的光进行检测。所发出的光可为例如紫外光、可见光或红外光。参见图1A和1B,检测器184 (或其它实施方式)能捕获来自荧光部分的光子猝发(Photo burst)的振幅和持续时间，并将光子猝发的振幅和持续时间转化为电信号。可使用如CCD相机、视频输入模块相机和条纹相机(streakcamera)等检测装置来产生具有连续信号的图像。其它实施方式使用如辐射热计、光电二极管、光电二极管阵列、雪崩式光电二极管和产生连续信号的光电倍增管等装置。可使用前述检测器的任何组合。
[0077]可对询问空间与其对应检测器之间的发射电磁辐射的数种明显特性进行检测，这些特性包括:发射波长、发射强度、猝发尺寸、猝发持续时间和荧光偏振。在某些实施方式中，检测器是在反向偏压中使用的光电二极管。这种光电二极管组通常具有极高的电阻。该电阻在适当频率的光照射于P/N结上时减小。因此，受到反向偏压的二极管可通过检测流经其的电流而被用作检测器。基于该效应的电流比基于零偏压的电流对光更为敏感。
[0078]在所述分析器系统的一个实施方式中，光电二极管可以是雪崩式光电二极管。相比于常规光电二极管，这些光电二极管能在高得多的反向偏压下工作，由此使得每个由光产生的载体被雪崩式击穿(avalanche breakdown)倍增。这一内部结果在光电二极管内增益，由此增加装置的有效响应性和灵敏度。光电二极管的选择由荧光标记的颗粒所发出的能量或发射波长决定。在某些实施方式中，检测器是检测300nm~1700nm的能量的雪崩式光电二极管检测器。在另一个实施方式中，可使用娃雪崩式光电二极管来检测300nm~IlOOnm的波长。在另一个实施方式中，光电二极管是检测800nm~2600nm的能量的砷化铟镓光电二极管。在另一个实施方式中，可使用铟镓砷光电二极管来检测900nm~1700nm的波长。在某些实施方式中，光电二极管是检测190nm~IlOOnm的能量的硅光电二极管。在另一个实施方式中，光电二极管是检测800nm~1700nm的能量的锗光电二极管。在其它实施方式中，光电二极管是检测1000nm~3500nm的能量的硫化铅光电二极管。在某些实施方式中，雪崩式光电二极管是设计来检测波长为400nm~IlOOnm的能量的单光子检测器。单光子检测器可商购(例如，Perkin Elmer, Wellesley, MA) ?
[0079]在某些实施方式中，分析器系统可以包含至少一个检测器。在其它实施方式中，分析器系统可以包含至少两个检测器，且每个检测器可以被选择和设置来检测处于特定波长范围的光的能量。例如，可使用两个分开的检测器来检测用不同标记进行标记的颗粒，所述不同标记在受EM源激发后发出具有不同光谱的能量的光子。在一个实施方式中，分析器系统可以包含能检测450nm?700nm的荧光能量(例如，绿色染料(例如，Alexa Fluor546)发出的荧光能量)的第一检测器和能检测620nm?780nm的荧光能量(例如，深红色染料(例如，Alexa Fluor647)发出的荧光能量)的第二检测器。其它实施方式使用检测400nm?600nm的荧光能量(例如，蓝色染料(例如，Hoechst33342)发出的荧光能量)的检测器，和检测560nm?700nm的能量(例如，红色染料(例如，Alexa Fluor546和Cy3)发出的能量)的检测器。
[0080]可使用包含两个或多个检测器的系统来检测个体颗粒，所述颗粒各自由发射不同光谱的光的两个或多个标记所标记。例如，两个不同检测器能检测已用两种染料标记进行标记的抗体。替代性地，可将包含两个检测器的分析器系统用于检测不同类型的颗粒，每种类型的颗粒各自由不同的染料分子或者由两种或多种染料分子的混合物进行标记。例如，可使用两个不同检测器来检测识别两种不同蛋白的两种不同类型的抗体，每种类型的抗体由不同染料标记或者由两种或多种染料标记分子的混合物进行标记。通过改变两种或多种染料标记分子的比例，可用两个检测器对两种或多种不同颗粒类型进行分别检测。可以理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可使用三个或多个检测器。
[0081]本领域技术人员应该理解，无论是否有一个或多个询问空间被限制于流动池内，可在每个询问空间配置一个或多个检测器，并且可将每个检测器设置来检测上文所列出的发射电磁辐射的任何特性。多检测器的使用(例如，用于多个询问空间)已于此前的在先申请中公开，本文通过参考从美国专利申请第11/048，660号并入。一旦将颗粒标记来使其可被检测(或者如果颗粒拥有使其可被检测的固有特性)，则可在不脱离本发明的范围的情况下使用本领域中已知的任何合适的检测机制，例如，CCD相机、视频输入模块相机、条纹相机、福射热计、光电二极管、光电二极管阵列、雪崩式光电二极管和产生连续信号的光电倍增管及其组合。可以被检测的电磁辐射的不同特性包括:发射波长、发射强度、猝发尺寸、猝发持续时间、荧光偏振及其任意组合。
[0082]II1.单分子检测用分子
[0083]本发明的仪器、试剂盒和方法可用于灵敏地检测和确定许多不同类型的单分子的浓度。特别地，所述仪器、试剂盒和方法可用于灵敏地检测和确定生物状态标记物的浓度。本文所用术语“单分子的检测”既指直接检测，也指间接检测。例如，可用荧光标记对单分子进行标记，且分子-标记复合物在本文所述的仪器中进行检测。替代性地，可用荧光标记对单分子进行标记，然后使荧光标记从该单分子脱离，并在本文所述的仪器中检测所述标记。术语单分子检测涵盖了这两种形式的检测。
[0084]A.概述
[0085]可使用本发明的分析器和相关方法检测的分子的实例包括:例如蛋白、核酸、糖类等生物聚合物和小分子(有机小分子和无机小分子)。具体而言，本文所述的仪器、试剂盒和方法可用于检测生物样品中的蛋白和小分子的单分子，以及确定所述样品中此类分子的浓度。
[0086]术语“蛋白”、“多肽”、“肽”和“寡肽”在本文中可互换使用，并且包括包含由肽键连接在一起的两个或多个氨基酸的任何组合物。可以理解，多肽可以含有除通常称为20种天然存在氨基酸的20种氨基酸之外的其它氨基酸。此外，多肽可以包含一个或多个氨基酸，包括经本领域已知的任何方法修饰(不管是天然地还是非天然地修饰)的末端氨基酸。多肽修饰的实例包括例如糖基化或其它后翻译修饰。可存在于本发明的多肽中的修饰包括但不限于:乙酰化、酰基化、ADP核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、多核苷酸或多核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键的形成、脱甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸酯的形成、甲酰化、Y -羧基化、糖化(glycation)、糖基化、GPI锚定物形成、轻基化、碘化、甲基化、豆蘧酰、氧化、蛋白水解处理、磷酸化、异戊基化、消旋化、硒化、硫化、经转移RNA介导的对蛋白的氨基酸添加(例如，精氨酸化)和泛素化。
[0087]由本仪器、试剂盒和方法检测的分子可以为游离的，或为复合物(例如，抗体-抗原复合物，或更一般而言的蛋白-蛋白复合物，例如肌钙蛋白复合物或前列腺特异抗原(PSA)复合物)的一部分。
[0088]B.生物状态标记物
[0089]在某些实施方式中，本发明提供了用于灵敏检测生物标记物的组合物和方法，和此类标记物在诊断、预后和/或治疗方法的确定中的使用。
[0090]本发明的标记物可以为例如与生物体的生物状态(例如，如疾病或非疾病态等状况)相关的任何组合物和/或分子或者组合物和/或分子的复合物。标记物可以为例如，小分子、多肽、核酸(如DNA和RNA)、脂质(如磷脂)或者胶束、细胞组分(例如，线粒体或叶绿体)等。本发明所考虑的标记物可以是此前所已知的或未知的。例如，在某些实施方式中，本文的方法能鉴定可用作受关注的生物状态或受关注的状况的标记物的新型多肽，而在其他实施方式中，将已知多肽鉴定为受关注的生物状态或状况的标记物。使用本发明的系统可以使得能够观察那些标记物，例如，在确定有机物的生物状态中具有高度应用潜力但仅以低浓度存在的多肽，例如从患病组织“浸出”的那些多肽。其它的具有高度应用潜力的标记物或多肽可以是那些与疾病有关的标记物或多肽，例如，产生于肿瘤-宿主环境中的标记物或多肽。在本发明的方法和组合物中可使用可提供有关生物状态的信息的任何合适的标记物。本文所用术语“标记物”涵盖了可在来自生物体的样品中被检测且其检测或定量提供了关于该生物体的生物状态的信息的任何分子。
[0091]生物状态包括但不限于:表型状态；影响生物体的状况；发育阶段；年龄；健康情况；病理学；疾病检测、过程或分期；感染；毒性；或对于化学因素、环境因素或药物因素的响应(例如，药物响应表型、药物毒性表型或药物有效性表型)。
[0092]本文所用术语“生物体”是指由至少一个细胞组成的任何生命体。生物体可以简单如单细胞生物体，或复杂如哺乳动物。本发明的生物体优选为哺乳动物。此类哺乳动物可以为例如人类，或者如灵长类(例如，猴、猩猩等)、驯养动物(例如，狗、猫、马等)、农场动物(例如，山羊、绵羊、猪、牛等)或实验动物(例如，小鼠、大鼠等)等动物。生物体优选为人类。
[0093]在某些实施方式中，本发明的方法和组合物针对各类标记物，例如，细胞因子、生长因子、肿瘤学标记物、炎症标记物、内分泌标记物、自身免疫标记物、甲状腺标记物、心血管标记物、糖尿病标记物、传染病标记物、神经学标记物、呼吸道标记物、胃肠道标记物、肌肉骨骼标记物、皮肤病学不良状态和代谢标记物。
[0094]下表1提供了已由本发明的方法和组合物测定的这些种类的标记物的实例，并且提供了由本发明的方法和组合物检测的所述标记物的浓度，以及由本发明的单分子分析器系统针对特定标记物所计出的颗粒数目。
[0095]表1.标记物类别和所述类别中的示例性标记物
[0096]
【权利要求】
1.一种单分子分析器，所述分析器包含: (a)用于为包含样品的样品容器提供电磁辐射的电磁辐射源； (b)用于将来自所述电磁辐射源的电磁辐射导向样品中的询问空间的系统； (C)用于使所述询问空间迁移通过样品的至少一部分由此形成可移动的询问空间的迁移系统；和 (d)用于检测所述询问空间中的单分子在该分子存在时所发射的电磁辐射的检测器，其中所述检测器与所述询问空间可操作地相连。
2.如权利要求1所述的单分子分析器，其中所述迁移系统能在线性路径和非线性路径中的一个或多个中迁移所述询问空间。
3.如权利要求2所述的单分子分析器，其中所述非线性路径包含基本环形路径。
4.如权利要求2所述的单分子分析器，其中所述非线性路径包含螺旋形路径。
5.如权利要求2所述的单分子分析器，其中所述非线性路径包含栅格模式。
6.如权利要求1所述的单分子分析器，所述分析器还包含具有表面的容器，所述表面用于将至少一个样品收纳并限制在该表面上。
7.如权利要求1所述的单分子分析器，其中所述样品容器是板。
8.如权利要求7所述的板，其中所述板是微滴定板。
9.如权利要求1所述的单分子分析器，其中所述询问空间的体积为约15μ m3~约11000 μ m3。
10.如权利要求1所述的单分子分析器，其中所述询问空间的体积为约200μ m3~约3000 μ m3。
11.如权利要求1所述的单分子分析器，其中所述询问空间的体积为约500μ m3~约600 μ m3。
12.如权利要求6所述的单分子分析器，其中所述分子附在所述容器的表面上。
13.如权利要求12所述的单分子分析器，其中所述分子通过非共价键附在所述容器的表面上。
14.如权利要求13所述的单分子分析器，其中所述非共价键形成于所述分子与一个或多个抗体之间，所述一个或多个抗体与所述容器的表面共价或非共价地结合。
15.如权利要求1所述的单分子分析器，所述单分子分析器还包含显微镜物镜，其中所述显微镜物镜的视场深度和成像于所述显微镜物镜的光圈直径共同限定了所述询问空间。
16.如权利要求1所述的单分子分析器，所述单分子分析器还包含显微镜物镜，其中所述显微镜物镜的视场深度和电磁辐射束的侧向幅度共同限定了所述询问空间。
17.如权利要求1所述的单分子分析器，其中所述迁移系统被构造和设置为为使所述询问空间迁移通过样品的所述部分一次以上。
18.如权利要求17所述的单分子分析器，其中所述迁移系统被构建和设置为在第一次和第二次时以足够慢的速度迁移通过样品的同一部分，从而使得在所述询问空间第一次迁移通过所述样品部分时检测到的受关注分子在存在时能在所述样品部分第一次被询问空间询问以后基本扩散离开所述样品部分，并且还使得后续的受关注分子在存在时能在所述样品部分第二次被询问空间询问时基本扩散进入所述样品部分内。
19.如权利要求18所述的单分子分析器，其中所述迁移系统被构建和设置为以基本环形模式迁移所述询问空间，其中所述系统能够以约IOORPM~约1000RPM的速度迁移所述询问空间。
20.如权利要求17所述的单分子分析器，其中所述迁移系统被构建和设置为以下述方式迁移所述询问空间:使得检测点在经过足够的时间后返回所述样品部分，由此使在第一次通过时被检测到的分子能扩散离开所述部分而其它分子能扩散进入所述部分。
21.如权利要求1所述的单分子分析器，其中所述分析器适于和构造为依次检测在第一样品中特定类型的单分子存在或不存在和检测在第二样品中所述类型的单分子存在或不存在，其中在第一样品和第二样品之间没有夹带。
22.—种微滴定板,所述微滴定板包含: (a)底部，所述底部包含对于波长为550nm~800nm的光基本透明的材料，并包含具有下述厚度的一个或多个部分:该厚度使得能通过位于所述部分的第二侧的大数值孔径透镜而在所述部分的第一侧上形成图像，且其中没有任何图像部分形成于底部内；和 (b)表面，所述表面适于和构造为用于将至少一种液体样品收纳和限制在所述表面上。
23.如权利要求22所述的微滴定板，其中所述底部对于波长为600nm~750nm的光是透明的。
24.如权利要求22所述的微滴定板，其中所述底部对于波长为630nm~740nm的光是透明的。
25.如权利要求22所述的微滴定板，其中所述底部对于波长为630nm~640nm的光是透明的。
26.如权利要求22所述的微滴定板，其中所述表面包含微孔。
27.如权利要求22所述的微滴定板，其中所述板包含下述材料:所述材料发射的荧光少于聚苯乙烯。
28.—种检测样品中单分子存在或不存在的方法，所述方法包括: (a)将来自电磁辐射源的电磁辐射导向样品中的询问空间； (b)在位于样品的第一位置处的询问空间中检测第一单分子存在或不存在； (C)使询问空间迁移通过样品至该样品中的后续位置； (d)在样品的后续位置中检测后续单分子存在或不存在；和 (e)根据需要重复步骤(C)和(d)，以便在一个以上样品位置中检测单分子存在或不存在。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述询问空间的体积为约15μ m3~约11000 μ m3。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述询问空间的体积为约200μ m3~约3000 μ m3。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述询问空间的体积为约500μ m3~约600 μ m3。
32.如权利要求28所述的方法，其中所述询问空间在非线性路径中迁移。
33.如权利要求32所述的单分子分析器，其中所述非线性路径包含基本环形路径。
34.如权利要求32所述的单分子分析器，其中所述非线性路径包含螺旋形路径。
35.如权利要求28所述的方法，其中，相对于被导向至位于样品内的询问空间处的电磁福射，所述样品保持基本静止。
36.如权利要求28所述的方法，其中所述询问空间迁移通过样品的第一部分一次以上。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述询问空间再一次以足够慢的速度迁移通过所述样品的第一位置，从而使得在所述询问空间第一次迁移通过所述样品位置时检测到的受关注分子在存在时能在所述样品位置第一次被询问空间询问以后基本扩散离开所述样品位置，并且还使得后续的受关注分子在存在时能在所述样品位置第二次被询问空间询问时基本扩散进入所述样品位置内。
38.如权利要求36所述的方法，其中所述询问空间以下述方式被迁移:使得检测点在经过足够的时间后返回所述第一样品位置，由此使在第一次通过时被检测到的分子能扩散离开所述位置而其它分子能扩散进入所述位置。
39.如权利要求28所述的方法，所述方法还包括依次检测在样品中特定类型的单分子存在或不存在，然后检测在第二样品中同一类型的单分子存在或不存在，其中在第一样品和第二样品之间没有夹带。
40.如权利要求 39所述的方法，其中所述第一样品和第二样品被被收纳和限制在非一次性设备中。
【文档编号】G01N21/64GK103543094SQ201310484661
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2008年12月18日 优先权日:2007年12月19日
【发明者】理查德.A.利文斯顿 申请人:神谷来克斯公司