一种检测痕量酚类环境雌激素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测痕量酚类环境雌激素的方法，属于生物样品和环境检（监）测【技术领域】。该方法中提取包括以下步骤：调节待测溶液的pH值为2.5～3.5，加入表面活性剂和萃取剂，超声混匀，再低温离心，弃去上层，采用高效液相色谱法定量检测即可。本发明采用超声辅助表面活性剂乳化微萃取技术，用低毒的表面活性剂替代丙酮、甲醇、乙腈等毒性分散剂，再结合高效液相色谱法（HPLC）定量检测，具有高效、低毒、操作简便、费用低等优点，富集倍数达到200倍以上，检测范围为0.01～0.10μg/L，可广泛用于螺旋藻生物样品、环境、食品和药品的中酚类环境雌激素的检（监）测分析。
【专利说明】一种检测痕量酚类环境雌激素的方法
【技术领域】
[0001]本发明具体涉及一种检测痕量酚类环境雌激素的方法，属于生物样品和环境检 (监)测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]酚类环境雌激素是环境中最常见的一类具有雌激素活性的污染物。大量环境调查 结果和实验室研究表明酚类环境雌激素如双酚A、五氯酚和雌二醇等对近年来男性睾丸癌 和前列腺癌发病率的上升、精子数量的减少、女性乳腺癌、子宫癌发病率的增加、雄性动物 的雌性化和免疫功能的改变等均具有不容忽视的作用。故酚类环境雌激素(PEs)已成为近 年来重点研究和监测的热点污染物。目前，美国、日本和欧洲等国家已对水体中部分酚类环 境雌激素的最大残留限量作了规定，一般在0.1y g/L甚至更低的水平。然而，目前的研究 结果表明:该类污染物在更低的水平下，仍然能够对生物产生雌激素效应。因此，建立该类 化合物在生物体内的剂量一响应曲线，并确定其表现雌激素活性的阈值至关重要。为此，必 须尽快建立具有极高灵敏度和选择性的定性和定量分析方法。
[0003]目前已有的萃取技术绝大多数还是依赖于液液萃取或固相萃取进行分离和富集， 操作过程比较繁琐，有机溶剂挥发污染严重，检测费用较高。且现有的微萃取技术所使用的 萃取剂和分散剂仍存在一定的毒性和污染问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种检测痕量酚类环境雌激素的方法。
[0005]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是:
[0006]一种检测痕量酚类环境雌激素的方法，主要包括提取和检测两个步骤，所述的提 取包括以下步骤:调节待测溶液的PH值为2.5?3.5 (以利于提高微萃取回收率)，加入表 面活性剂和萃取剂，超声混匀，再低温离心，弃去上层即可。
[0007]所述的酚类环境雌激素为双酚A (BPA)、17 a-雌二醇(17 a-Estradiol )、4_叔丁 基酚(4-BP )、4溴双酚A (4-Br-BPA )和/或4-叔辛基酚(4_t_0P )。
[0008]所述的表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或吐 温，如吐温20。优选十二烷基硫酸钠。
[0009]所述的萃取剂为氯苯(C6H5Cl )、四氯甲烷(CCl4)或三氯甲烷(CHCl3X优选三氯甲烧。
[0010]所述超声的功率为350?450W，开关间隔为5s: 3s (即开5s关3s)，共计40?60 次。优选50次。
[0011]所述低温离心的温度为0?4°C,转速为4000?6000rpm,时间为2?5min。优选 的，低温超速离心的温度为4°C,转速为5000rpm,时间为2min。
[0012]所述的检测包括如下步骤:将提取得到的溶液用高效液相色谱仪进行定量检测， 流动相为乙腈和去离子水，梯度洗脱条件为:0?6min,乙腈:水=45:55 ；6?20min,乙腈:水=70:30 ;柱温为25°C，紫外波长为270nm，流速为0.8mL/min，进样量为20y L。
[0013]一般的，在提取步骤之前，针对不同的样品其前处理步骤存在差异，比如生物样 品、环境样品、食品或药品等。
[0014]当检测对象为生物样品(如螺旋藻细胞)中酚类环境雌激素残留时，需要对生物 样品进行清洗、破碎和净化处理，具体包括如下步骤:(I)清洗生物样品去除培养基及部分 代谢产物，超声破碎；(2)在超声破碎后的样品中加入浓硫酸净化，静置，离心，取上清液备 用。即采用浓硫酸磺化法净化螺旋藻破碎细胞中如蛋白质、脂质等大分子物质，超声破碎后 样品与浓硫酸的体积比为100:3。该上清液即为待测溶液。
[0015]所述步骤(I)中采用离心法清洗生物样品，即将生物样品离心取沉淀(生物样品加 水后离心或生物样品本身即为悬浮液)，在沉淀中加水再次离心，重复上述步骤，最后弃去 上清液即可。
[0016]所述步骤(I)中超声破碎之前先在沉淀中加入适量的水，混匀后备用。对于螺旋 藻细胞悬浮液，优选的，超声破碎的功率为350?450W，开关间隔为5s:3s，开关间隔次数为 30次，共计50?60次。
[0017]所述步骤(2)静置的时间为2?5min，优选2min。超速离心的转速为4000? 6000rpm,时间为2?5min,优选转速为5000rpm,时间为2min。
[0018]当检测对象为环境样品(如水样)中痕量的酚类环境雌激素时,需要对水样进行过 滤除杂操作(如过0.22 的滤膜除杂)，滤液即为待测溶液；或者在滤液中加入浓硫酸净 化，静置，离心，取上清液备用，该上清液即为待测溶液。
[0019]当检测对象为食品或药品(如螺旋藻片剂、颗粒剂等)中酚类环境雌激素残留时， 需要对食品或药品进行研碎、消化和磺化处理，具体包括如下步骤:将食品或药品研碎，力口 A HNO3-HClO4 (4:1，V/V)的混合酸进行消化，加热至溶液变为清亮色并伴有白烟，继续加热 至消化完全，加水离心或直接离心，在上清液中加入过量的浓硫酸，静置，离心，取上清液备 用。最后一步得到的上清液即为待测溶液。
[0020]本发明的有益效果:
[0021]本发明采用超声辅助表面活性剂乳化微萃取技术，与常规的分散液液微萃取技术 相比，替代了丙酮、甲醇和乙腈等毒性分散剂，以低毒的表面活性剂取而代之，具有高效、低 毒、操作简便和低费用等优点，可应用于复杂生物基质样品的痕量多残留提取。
[0022]当检测对象为生物、环境样品或食品、药品等中酚类环境雌激素残留时，先采用浓 硫酸磺化法净化样品中如脂肪、蛋白质等大分子物质，创造一个有利于微萃取的良好基质 条件，再结合超声辅助表面活性剂乳化微萃取技术，即可用于复杂生物基质样品的分析，是 一种操作简便、快速、成本低、富集效率高且对环境友好的样品前处理新技术。该技术集采 萃取、浓缩和净化于一体，结合高效液相色谱法(HPLC)可以快速检测样品中痕量酚类环境 雌激素，且富集倍数高(> 200倍)，高效、灵敏，检测范围达到0.01?0.10iig/L，可广泛应 用于螺旋藻生物样品、环境、食品和药品的中酚类环境雌激素的检(监)测分析。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为萃取剂对酚类环境雌激素提取效率的影响效应图；
[0024]图2为萃取剂体积对酚类环境雌激素提取效率的影响效应图；[0025]图3为表面活性剂对酚类环境雌激素提取效率的影响效应图；
[0026]图4为超声萃取时间对酚类环境雌激素提取效率的影响效应图；
[0027]图5为pH值对酚类环境雌激素提取效率的影响效应图；
[0028]图6为水样和螺旋藻样品中酚类环境雌激素的色谱图。
【具体实施方式】
[0029]下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0030]实施例1
[0031]自来水中酚类环境雌激素的检测:
[0032]取自来水15mL，过0.22 y m的滤膜；取IOmL过滤后的自来水于15mL离心管中，力口 0.3mL浓硫酸调节溶液pH值为3，再加入500 u L SDS和50 y L CHCl3,将混合液震荡摇匀， 超声混匀，超声功率为400W，开关间隔5s: 3s，共计50次，在5000rpm转速下离心2min，底部 形成小液滴；用微量进样器吸取底部小液滴40 ii L，采用优化的高效液相色谱条件定量检 测酚类环境雌激素的含量，流动相为乙腈和去离子水，梯度洗脱条件为:0?6min，乙腈:水 =45:55 ；6?20min,乙腈:水=70:30 ;柱温为25°C，紫外波长为270nm，流速为0.8mL/min, 进样量为20iiL。
[0033]实施例2
[0034]螺旋藻-350 (ASP-350)中酚类环境雌激素的检测:
[0035]取IOmL处于对数生长期的螺旋藻ASP-350水样，置于15mL离心管中，加去离子水 至15mL,离心2min,去上清液；将管底沉淀的ASP-350加去离子水至IOmL,离心2min,再将 沉淀ASP-350细胞加水至IOmL ;超声破碎，功率为400W，开关间隔为5s:3s，开关间隔次数 为50次，总破碎处理时间为400s ;加0.3mL浓硫酸于离心管放置2min，在5000rpm的条件 下离心2min ;取上清液调节pH值为3，加入500 u L表面活性剂SDS和50 y L萃取剂CHCl3, 超声混匀，超声功率为400W，开关间隔5s: 3s，共计50次，高速低温离心，转速为5000rpm，温 度为4°C，离心时间为2min ;用微量进样针取离心管底的小液滴40 y L，采用优化的高效液 相色谱条件定量检测酚类环境雌激素的含量，流动相为乙腈和去离子水，梯度洗脱条件为: 0?6min，乙腈:水=45:55 ;6?20min，乙腈:水=70:30 ;柱温为25°C，紫外波长为270nm, 流速为0.8mL/min,进样量为20 u L。
[0036]实施例3
[0037]螺旋藻-834 (ASP-834)中酚类环境雌激素的检测:
[0038]取IOmL处于对数生长期的螺旋藻ASP-834水样，置于15mL离心管中，加去离子水 至15mL,离心2min,去上清液；将管底沉淀的ASP-834加去离子水至IOmL,离心2min,再将 沉淀ASP-834细胞加水至IOmL ;超声破碎，功率为400W，开关间隔为5s:3s，开关间隔次数 为50次，总破碎处理时间为400s ;加0.3mL浓硫酸于离心管放置2min，在5000rpm的条件 下离心2min ;取上清液调节pH值为3，加入500 u L表面活性剂SDS和50 y L萃取剂CHCl3, 超声混匀，超声功率为400W，开关间隔5s: 3s，共计50次，高速低温离心，转速为5000rpm，温 度为4°C，离心时间为2min ;用微量进样针取离心管底的小液滴35 y L，采用优化的高效液 相色谱条件定量检测酚类环境雌激素的含量，流动相为乙腈和去离子水，梯度洗脱条件为: 0?6min，乙腈:水=45:55 ;6?20min，乙腈:水=70:30 ;柱温为25°C，紫外波长为270nm,流速为0.8mL/min,进样量为20 u L。
[0039]实施例4
[0040]螺旋藻片中酚类环境雌激素的检测:
[0041]准确称取螺旋藻片(南宁富莱欣生物牌，螺旋藻咀嚼片)样品2.0g，研碎置于50mL 锥形瓶中；加入15mLHN03-HC104 (4:1, V/V)的混合酸消化，于电热板上加热，当溶液变为清 亮无色并伴有白烟时，再继续加热(赶酸)至剩余体积约为2mL ;将消化液转移到15mL离心 管中，加纯水定容至15mL,加入0.3mL浓硫酸磺化,静置2min,在5000rpm转速下离心2min ； 取上清液10mL，再加500 u LSDS和50 y L CHCl3,混合液超声混合，超声功率为400W，开关间 隔5s:3s,共计50次,再在5000rpm条件下离心2min ;用用微量进样针取离心管底的小液滴 35 y L，采用优化的高效液相色谱条件定量检测酚类环境雌激素的含量，流动相为乙腈和去 离子水，梯度洗脱条件为:0?6min,乙腈:水=45:55 ；6?20min,乙腈:水=70:30 ;柱温 为25V ’紫外波长为270nm，流速为0.8mL/min,进样量为20 u L。
[0042]试验例
[0043]1、超声辅助表面活性剂乳化微萃取条件的优化
[0044](I)不同萃取剂对酚类环境雌激素提取效率的影响
[0045]试验方法:采用相同的待测样品，萃取剂分别采用氯苯(C6H5C1)、四氯甲烷(CCl4) 和三氯甲烷(CHCl3),体积为50 iiL，表面活性剂采用500 ii L SDS，超声混匀的功率为 400W，开关间隔5s:3s，共计50次，采用高效液相色谱检测双酚A (BPA)、17 a -雌二醇 (17 a -Estradiol),4-叔丁基酚(4_BP)、4 溴双酚 A (4-Br-BPA)和 4-叔辛基酚(4_t_0P) 的含量，测定结果如图1所示。
[0046]从图1可以看出，萃取剂为三氯甲烷时微萃取效果最佳。
[0047](2)不同萃取剂体积对酚类环境雌激素提取效率的影响
[0048]试验方法:采用相同的待测样品，萃取剂采用三氯甲烷，体积分别为20UL、 30 u L、40 u L、50 y和60 y L，表面活性剂采用500 u L SDS，超声混匀的功率为400W,开关间 隔5s:3s，共计50次，采用高效液相色谱检测5种酚类环境雌激素的含量，测定结果如图2 所示。
[0049]从图2可以看出，萃取剂体积为50li L时微萃取效果最佳。
[0050](3)不同表面活性剂对酚类环境雌激素提取效率的影响
[0051]试验方法:表面活性剂分别采用十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)和吐温20 (Tween-20)，其他试验条件同上述。5种酚类环境雌激素的含量，测定结 果如图3所示。
[0052]从图3可以看出，表面活性剂为SDS时萃取效果最佳。
[0053](4)超声萃取时间对酚类环境雌激素提取效率的影响
[0054]试验方法:米用相同的待测样品，超声萃取时间如图4横坐标所不，萃取剂米用二 氯甲烷(CHCl3),体积为50 ii L，表面活性剂采用500 ii L SDS，超声混匀的功率为400W，开关 间隔5s:3s，共计50次，采用高效液相色谱检测5种酚类环境雌激素的含量，测定结果如图 4所示。
[0055](5) pH值对酚类环境雌激素提取效率的影响
[0056]试验方法:采用相同的待测样品，pH值分别为2、3、4、5、6、7，萃取剂采用三氯甲烷(CHCl3),体积为50 ii L，表面活性剂采用500 ii L SDS，超声混匀的功率为400W，开关间隔 5s:3s，共计50次，采用高效液相色谱检测5种酚类环境雌激素的含量，测定结果如图5所
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[0057](6)不同样品中酚类环境雌激素的色谱图
[0058]试验方法:分别取去离子水、温瑞塘水样以及螺旋藻-350、螺旋藻-793、螺旋藻-834水样，前处理后采用超声辅助表面活性剂乳化微萃取技术提取样品中的酚类环境雌激素，萃取剂采用三氯甲烷(CHCl3),体积为50 ii L，表面活性剂采用500 ii L SDS，超声混匀的功率为400W，开关间隔5s:3s，共计50次，采用高效液相色谱法检测，色谱图如图6所
示
[0059]2、超声辅助表面活性剂乳化微萃取的分析技术参数的测定
[0060]试验条件:试验样品为螺旋藻-834，体积IOmL ;浓硫酸用量0.3mL ；50 u L 01(:13萃取剂；500 ii L SDS表面活性剂；超声功率为400W，开关间隔5s:3s，共计50次。分析技术参数结果如下表1所示。
[0061]表1分析技术参数结果
【权利要求】
1.一种检测痕量酚类环境雌激素的方法，其特征在于:主要包括提取和检测两个步骤，所述的提取包括以下步骤:调节待测溶液的PH值为2.5~3.5，加入表面活性剂和萃取剂，超声混匀，再低温离心，弃去上层即可。
2.根据权利要求1所述的检测痕量酚类环境雌激素的方法，其特征在于:所述的酚类环境雌激素为双酚A、17 a -雌二醇、4-叔丁基酚、4溴双酚A和/或4-叔辛基酚。
3.根据权利要求1所述的检测痕量酚类环境雌激素的方法，其特征在于:所述的表面活性剂为十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵或吐温。
4.根据权利要求1所述的检测痕量酚类环境雌激素的方法，其特征在于:所述的表面活性剂为十二烷基硫酸纳。
5.根据权利要求1所述的检测痕量酚类环境雌激素的方法，其特征在于:所述的萃取剂为氯苯、四氯甲烷或三氯甲烷。
6.根据权利要求1所述的检测痕量酚类环境雌激素的方法，其特征在于:所述的萃取剂为三氯甲烷。
7.根据权利要求1所述的检测痕量酚类环境雌激素的方法，其特征在于:所述超声的功率为350~450W，开关间隔为5s:3s，共计40~60次。
8.根据权利要求1所述的检测痕量酚类环境雌激素的方法，其特征在于:所述的检测包括如下步骤:将提取得到的溶液用高效液相色谱仪进行定量检测，流动相为乙腈和去离子水，梯度洗脱条件为:0~6min,乙腈:水=45:55 ；6~20min,乙腈:水=70:30 ;柱温为 25 0C，紫外波长为270nm，流速为0.8mL/min,进样量为20 u L。
9.根据权利要求1所述的检测痕量酚类环境雌激素的方法，其特征在于:当检测对象为生物样品中酚类环境雌激素残留时，所述的待测溶液主要由以下步骤制备得到:(I)清洗生物样品，超声破碎；(2)在超声破碎后的样品中加入浓硫Ife，静直，尚心，取上清液即得。
10.根据权利要求1所述的检测痕量酚类环境雌激素的方法，其特征在于:当检测对象为食品或药品中酚类环境雌激素残留时，所述的待测溶液主要由以下步骤制备得到:将食品或药品研碎，加入HNO3-HClO4的混合酸进行消化，消化完全后加水离心或直接离心，在上清液中加入过量的浓硫酸，静置，离心，取上清液即得。
【文档编号】G01N30/02GK103558305SQ201310522774
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】王慧利, 王学东, 王永魁 申请人:温州医科大学