犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条及制备方法。该检测试纸包括样品吸收区、金标探针区、固相化抗体区、吸水区和底板，样品吸收区、金标探针区、固相化抗体区和吸水区依次铺设在底板上并相互部分重叠；金标探针区包被有胶体金标记的抗犬细小病毒单克隆抗体F1；固相化抗体区依次有检测线和对照线，检测线包被有抗犬细小病毒单克隆抗体B6；对照线包被有羊抗小鼠IgG。通过将玻璃纤维膜、包被有抗犬细小病毒单克隆抗体F1的聚酯膜、包被有检测线和对照线的硝酸纤维素膜、和吸水滤纸组装到聚乙烯板上得到犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条。本发明的试纸检测快速，准确率高，特异性强，携带、操作简便。
【专利说明】犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测试纸条及制备方法，具体涉及一种犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条及制备方法。
【背景技术】
[0002]犬细小病毒(Canine Parvovirus, CPV)是细小病毒属成员，单链小DNA病毒。病毒粒子为等轴对称的二十面体，外观呈圆形或六边形，无囊膜，病毒颗粒直径为21nm?24nm，沉降系数为23S?27S。在1977年，首次从患有肠炎的病犬体内分离获得CPV，病犬以呕吐、出血性肠炎、白细胞减少为主要特征，幼犬的易感性高，可引起幼犬的心肌炎；为了与犬极小病毒(MCV)相区别而命名为CPV-2，随后在许多国家和地区的犬科动物中相继被发现，发病率为50%?100%，死亡率为0%?50%，对养犬业和经济动物养殖业危害极大，并且也影响到了野生动物的生存，因此要建立快速有效的检测方法，并针对该病进行有效治疗。
[0003]我国已建立的用于检测CPV抗体的血清学方法有血凝试验、血凝抑制试验、琼脂扩散试验等，但是由于CPV与猫泛白细胞减少症病毒、水貂肠炎病毒三者之间能发生交叉血清学反应，因此在实际应用中这些方法常受到限制。酶联免疫吸附试验(ELISA)可检测CPV抗原，也可检测CPV抗体；PCR检测敏感性高，特异性强，可分辨野毒感染和疫苗免疫，但这两种技术都需要特殊的仪器设备。利用胶体金标记单克隆CPV表面抗体，制成检测CPV抗原的胶体金检测试纸条敏感性高，特异性强，稳定性好，操作简便快速，结果易于分析判定。王中力等，在中国预防兽医学报上发表的文章《犬细小病毒免疫胶体金诊断技术的研究》中提到的方法是标记抗犬细小病毒单克隆抗体，包被抗犬细小病毒兔多抗。
【发明内容】
[0004]本发明的首要目的在于提供一种犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条，为快速检测犬细小病毒，为临床诊断提供可靠依据。该检测试纸条采用胶体金标记的抗犬细小病毒单克隆抗体Fl做探针，包被抗犬细小病毒单克隆抗体B6和羊抗小鼠IgG的双抗体夹心法检测犬细小病毒，可供犬科动物及犬细小病毒易感动物的犬细小病毒检测。
[0005]本发明的另一目的在于提供上述犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条的制备方法。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0007]—种犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条，包括样品吸收区、金标探针区、固相化抗体区、吸水区和底板，样品吸收区、金标探针区、固相化抗体区和吸水区依次铺设在底板上并相互部分重叠；金标探针区包被有胶体金标记的抗犬细小病毒单克隆抗体F1，其标记量优选为I?10 μ g/mL (每mL胶体金标记I?10 μ g抗犬细小病毒单克隆抗体Fl);固相化抗体区(自金标探针区至吸水区方向)依次有检测线和对照线，检测线包被有抗犬细小病毒单克隆抗体B6，包被量优选为0.1?10 μ g/cm ;对照线包被有羊抗小鼠IgG，包被量优选为0.1?10 μ g/cm。所述的抗犬细小病毒单克隆抗体Fl和B6由抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株Fl和B6产生；(刘洁等，分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立，中国兽药杂志，2013，47 (7):9-12)，其中，抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株Fl保藏编号为CCTCC NO:C2013175，抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株B6保藏编号为:CCTCC NO:C2013176o
[0008]所述的底板的材料优选为聚乙烯板(PVC板)；所述的样品吸收区的材料优选为玻璃纤维膜；所述的金标探针区的材料优选为聚酯膜；所述的固相化抗体区的材料优选为硝酸纤维素膜；所述的吸水区的材料优选为吸水滤纸。
[0009]上述犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条的制备方法，包括如下步骤:将胶体金标记的抗犬细小病毒单克隆抗体Fl喷涂于聚酯膜上；在硝酸纤维素膜上依次包被检测线(包被有抗犬细小病毒单克隆抗体B6)和对照线(包被羊抗小鼠IgG);将玻璃纤维膜、包被有抗犬细小病毒单克隆抗体Fl的聚酯膜、包被有检测线和对照线的硝酸纤维素膜、和吸水滤纸组装到聚乙烯板上得到犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条。
[0010]优选的，所述的犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条的制备方法，包括如下步骤:
[0011](I)抗犬细小病毒单克隆抗体的制备:选8?10周龄体重20g以上的雌性BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降植烷，7天后腹腔分别注射抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株Fl和B6，接种量为2 X IO6?4 X IO6细胞/0.5mL/只，约经过一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，5000rpm离心15min，取上清备用；将腹水用50%饱和度的硫酸铵盐析2次，透析除盐即得纯化的抗犬细小病毒单克隆抗体Fl和抗犬细小病毒单克隆抗体B6。
[0012](2)胶体金标记抗犬细小病毒单克隆抗体Fl的方法:分别取半径为5?40nm的胶体金20mL及抗犬细小病毒单克隆抗体F150?200 μ g，在ρΗ8.0?9.0的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加PEG-20000作为稳定剂，且使得PEG-20000最终质量浓度为10?20%，采用离心法除去未结合的抗犬细小病毒单克隆抗体Fl和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金-Fl复合物(胶体金标记的犬细小病毒单克隆抗体Fl )。
[0013](3)将胶体金-Fl复合物喷涂于聚酯膜上:用20mL聚乙二醇洗涤胶体金-Fl复合物，离心除去上清液，得到深红色沉淀，纯化后的沉淀用2mL浓度为2mmol/L、pH6.0?8.0的硼酸缓冲液溶解，用喷涂设备涂于聚酯膜上15μ L/cm，冻干。
[0014](4)硝酸纤维素膜的包被:检测线包被的是抗犬细小病毒单克隆抗体B6，包被量为0.1?10 μ g/cm,对照线包被的是羊抗小鼠IgG,包被量为0.1?10 μ g/cm,每条线宽2?5mm ο
[0015](5)试纸条制备:将玻璃纤维膜、包被胶体金-Fl复合物的聚酯膜、包被检测线和对照线的硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次粘附于聚乙烯板上，将组装好的试纸条纵向切成4mm的条状即为犬细小病毒胶体金免疫层析试纸条。
[0016]本发明相对于现有技术具有如下优点和效果:
[0017]检测时，用无菌棉签沾取待检动物的粪便样品，在ImL PBS缓冲液(pH7.2?7.4)中混匀，待大颗粒沉于管底后，取上清滴在该试纸条样品吸收区，5?10分钟后判读结果，对比检测线和对照线的颜色，即可判定被检动物体内是否带有犬细小病毒或感染犬细小病毒。[0018](I)检测快速:检测时间只需5?10分钟，能够满足现场检测的需要。
[0019](2)检测准确率高、特异性好:本发明试纸条与其他犬易感病原没有交叉反应，检测灵敏度高于血凝试验，与同类试纸条相比，符合率高达98%。
[0020](3)携带方便，操作简便:本发明不需要借助其它仪器设备，适合各级兽医院、动物诊所和个人使用。
[0021](4)检测试纸条在常温下即可保存，保存期可达I年，且检测重复性好。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条的结构示意图；其中，I为样品吸收区，2为金标探针区，3为固相化抗体区，31为检测线，32为对照线，4为吸水区，5为底板。
[0023]图2是试纸条敏感性试验结果图；其中，1:阴性对照；2?15:犬细小病毒阳性样品从1:22开始倍比稀释至1:215。
[0024]图3是血凝试验结果图；其中，A、B:阳性参考样品从左至右21?212倍比稀释；C:阴性对照。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0026]实施例1
[0027]犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条的结构示意图如图1所示，试纸条水平面从右到左依次为样品吸收区1、金标探针区2、固相化抗体区3和吸水区4铺设在底板5上并相互部分重叠；样品吸收区1、金标探针区2、固相化抗体区3、吸水区4和底板5的材料分别为玻璃纤维膜、聚酯膜、硝酸纤维素膜、吸水滤纸和聚乙烯板。金标探针区2包被有胶体金标记的抗犬细小病毒单克隆抗体Fl,其标记量为4 μ g/mL ;固相化抗体区3 (自金标探针区至吸水区方向)依次有检测线31和对照线32，检测线包被有抗犬细小病毒单克隆抗体B6，包被量为0.6 μ g/cm ;对照线32包被有羊抗小鼠IgG，包被量为0.6 μ g/cm。
[0028]上述犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条制备方法如下:
[0029](I)抗犬细小病毒单克隆抗体的制备:选8?10周龄体重20g以上的雌性BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降植烷，7天后腹腔分别注射抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株Fl和B6，接种量为2 X IO6?4 X IO6细胞/0.5mL/只，约经过一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，5000rpm离心15min，取上清备用。将腹水用50%饱和度的硫酸铵盐析2次，透析除盐即得纯化的抗犬细小病毒单克隆抗体Fl和抗犬细小病毒单克隆抗体B6(刘洁等，分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立，中国兽药杂志，2013，47 (7):9-12)。其中，抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株Fl和B6均于2013年11月I日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国.武汉.武汉大学)，保藏编号分别为CCTCC NO:C2013175和CCTCCNO:C2013176o
[0030](2)胶体金标记抗犬细小病毒单克隆抗体Fl的方法:分别取半径为25nm的胶体金20mL及抗犬细小病毒单克隆抗体F180 μ g，在ρΗ9.0的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加PEG-20000作为稳定剂，且使得PEG-20000最终质量浓度为20%，采用离心法除去未结合Fl和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金-Fl复合物。
[0031](3)将胶体金-Fl复合物喷涂于聚酯膜上:用20mL聚乙二醇洗涤胶体金-Fl复合物，离心除去上清液，得到深红色沉淀，纯化后的沉淀用2mL浓度为2mmol/L、pH6.0的硼酸缓冲液溶解，用喷涂设备涂于聚酯膜上15μ L/cm，冻干。
[0032](4)硝酸纤维素膜的包被:检测线包被的是抗犬细小病毒单克隆抗体B6，对照线包被的是羊抗小鼠IgG，每条线宽2mm。
[0033](5)试纸条制备:将玻璃纤维膜、包被胶体金-Fl复合物的聚酯膜、包被检测线和对照线的硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次粘附于聚乙烯板上，将组装好的试纸条纵向切成4mm的条状即为犬细小病毒胶体金免疫层析试纸条。
[0034]实施例2
[0035]除检测线31包被抗犬细小病毒单克隆抗体B6的量为1.5 μ g/cm ;对照线32包被羊抗小鼠IgG的量为1.5 μ g/cm ;金标探针区2包被的胶体金标记的抗犬细小病毒单克隆抗体Fl的标记量为4 μ g/mL,胶体金标记抗犬细小病毒单克隆抗体Fl方法:分别取半径为25nm胶体金溶液20mL及抗犬细小病毒单克隆抗体F180y g，在pH9.0的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加PEG-20000作为稳定剂，且使得PEG-20000最终质量浓度为20%，采用离心法除去未结合抗犬细小病毒单克隆抗体Fl和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金-Fl复合物外，其余与实施例1相同。
[0036]实施例3
[0037]除检测线31包被抗犬细小病毒单克隆抗体B6的量为4.8 μ g/cm ;对照线32包被羊抗小鼠IgG的量为4.8 μ g/cm ;金标探针区2包被的胶体金标记的抗犬细小病毒单克隆抗体Fl的标记量为10 μ g/mL,胶体金标记抗犬细小病毒单克隆抗体Fl方法:分别取半径为40nm胶体金溶液20mL及抗犬细小病毒单克隆抗体F1200 μ g，在pH9.0的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加PEG-20000作为稳定剂，且使得PEG-20000最终质量浓度为10%，采用离心法除去未结合抗犬细小病毒单克隆抗体Fl和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金-Fl复合物外，其余与实施例1相同。
[0038]实施例4
[0039]犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条的使用方法:
[0040]检测时，用无菌棉签沾取待检动物的粪便样品，在ImL PBS缓冲液(pH7.2，
0.01mol/L)中混匀，待大颗粒沉于管底后，取上清滴在该试纸条上，5?10分钟后判读结果，对比检测线和对照线的颜色，即可判定被检动物体内是否带有犬细小病毒或感染犬细小病毒。如检测线出现红色为阳性反应，应及时治疗或密切观察；如检测线无此反应，即为阴性，表明样品中没有犬细小病毒或犬细小病毒量太低。对照线不管样品中有没有犬细小病毒均出现红色的阳性反应，表明试纸条有效，如果对照线无反应，说明试纸条失效。
[0041]实施例5
[0042]将犬细小病毒F81细胞培养上清做22?215倍比稀释，用实施例1中制备好的犬细小病毒抗原检测试纸条进行检测；同时将同一样品做21?212倍比稀释，做病毒血凝试验(HA)作为对照，评价试纸条的敏感性。结果如图2和图3所示，试纸条检测阳性参考样品最低稀释度为211，而血凝试验检测到阳性参考样品的血凝价为21(1，两种检测结果表明犬细小病毒检测试纸条比血凝试验敏感性高一倍，可以检测到血凝试验检测不到的犬细小病毒阳性样品。
[0043]实施例6
[0044]用实施例1中制备好的犬细小病毒抗原检测试纸检测10份健康犬粪便样品、犬瘟热病毒细胞毒样品、狂犬病毒灭活疫苗样品、犬腺病毒细胞毒样品、犬冠状病毒细胞毒样品、犬副流感病毒细胞毒样品各1份，检测结果均为阴性。
[0045]实施例7
[0046]分别用实施例1制备的犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条与韩国进口犬细小病毒检测试纸条(韩国安捷公司)对临床60份样品进行检测，同时对比临床症状。
[0047]结果表明(表1)，两试纸条对待检样品的阳性符合率为100%，阴性符合率为97.5%，总符合率为98%，不符合的一例经对比临床症状进行进一步验证为犬细小病毒阳性，因此本发明试纸条优于其它商品试纸条。
[0048]表1两种试纸条检测样品对比结果
[0049]
【权利要求】
1.一种犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于:包括样品吸收区、金标探针区、固相化抗体区、吸水区和底板，样品吸收区、金标探针区、固相化抗体区和吸水区依次铺设在底板上并相互部分重叠；金标探针区包被有胶体金标记的抗犬细小病毒单克隆抗体Fl ;固相化抗体区依次有检测线和对照线，检测线包被有抗犬细小病毒单克隆抗体B6 ；对照线包被有羊抗小鼠IgG ;所述的抗犬细小病毒单克隆抗体Fl和B6由抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株Fl和B6产生，抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株Fl和B6保藏编号分别为 CCTCC NO:C2013175 和 CCTCC NO:C2013176。
2.根据权利要求1所述的犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于:所述的胶体金标记的抗犬细小病毒单克隆抗体Fl的标记量为I~10 μ g/mL ;所述的抗犬细小病毒单克隆抗体B6的包被量为0.1~10 μ g/cm ;所述的羊抗小鼠IgG的为0.1~10 μ g/cm。
3.根据权利要求1所述的犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于:所述的底板的材料为聚乙烯板；所述的样品吸收区的材料为玻璃纤维膜；所述的金标探针区的材料为聚酯膜；所述的固相化抗体区的材料为硝酸纤维素膜；所述的吸水区的材料为吸水滤纸。
4.权利要求1-3任一项所述的犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于包括如下步骤:将胶体金标记的抗犬细小病毒单克隆抗体Fl喷涂于聚酯膜上；在硝酸纤维素膜上依次包被检测线和对照线；将玻璃纤维膜、包被有抗犬细小病毒单克隆抗体Fl的聚酯膜、包被有检测线和对照线的硝酸纤维素膜、和吸水滤纸组装到聚乙烯板上得到犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条。
5.根据权利要求4所述的犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)抗犬细小病毒单克隆抗体的制备:选8~10周龄体重20g以上的雌性BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降植烷，7天后腹腔分别注射抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株Fl和B6，接种量为2 X IO6~4 X IO6细胞/0.5mL/只，经过一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，5000rpm离心15min，取上清备用；将腹水用50%饱和度的硫酸铵盐析2次，透析除盐即得纯化的抗犬细小病毒单克隆抗体Fl和抗犬细小病毒单克隆抗体B6 ； (2)胶体金标记抗犬细小病毒单克隆抗体Fl的方法:分别取半径为5~40nm的胶体金20mL及抗犬细小病毒单克隆抗体Fl 50~200 μ g，在pH 8.0~9.0的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加PEG-20000作为稳定剂，且使得PEG-20000最终质量浓度为10~20%，采用离心法除去未结合的抗犬细小病毒单克隆抗体Fl和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金-Fl复合物； (3)将胶体金-Fl复合物喷涂于聚酯膜上:用20mL聚乙二醇洗涤胶体金-Fl复合物，离心除去上清液，得到深红色沉淀，纯化后的沉淀用2mL浓度为2mmol/L、pH 6.0~8.0的硼酸缓冲液溶解，用喷涂设备涂于聚酯膜上15μ L/cm，冻干； (4)硝酸纤维素膜的包被:检测线包被的是抗犬细小病毒单克隆抗体B6，包被量为.0.1~10 μ g/cm,对照线包被的是羊抗小鼠IgG,包被量为0.1~10 μ g/cm,每条线宽2~.5mm ； (5)试纸条制备:将玻璃纤维膜、包被胶体金-Fl复合物的聚酯膜、包被检测线和对照线的硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次粘附于聚乙烯板上，将组装好的试纸条纵向切成4mm的条状即为犬细小病毒胶体金免疫层析试纸条。
6.权利要求1-3任一项所述的犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条的使用方法，其特征在于包括如下步骤:检测时，用无菌棉签沾取待检动物的粪便样品，在PBS缓冲液中混匀，待大颗粒沉于管底后，取上清滴在该试纸条样品吸收区，5~10分钟后判读结果，对比检测线和对照线的颜色，即可 判定被检动物体内是否带有犬细小病毒或感染犬细小病毒。
【文档编号】G01N33/577GK103604924SQ201310600672
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】刘洁, 牟林琳, 廖园园, 何文辉, 王威, 漆世华, 朱薇, 温文生, 谢红玲, 冯钊 申请人:武汉中博生物股份有限公司