气相色谱-质谱检测细胞内糖的方法
【专利摘要】本发明涉及一种气相色谱-质谱检测细胞内糖的方法，属于生物化学检验测定【技术领域】。本发明检测方法步骤包括：（1）取发酵液，高速离心，分别收集细胞和细胞外液；（2）细胞内代谢物样品制备，将收集的菌体用生理盐水清洗，冷甲醇溶解后超声破碎，低温萃取，离心收集萃取上清液，加入内标物，低温真空烘干；（3）样品衍生，加入糖衍生剂、氨基酸衍生剂；（4）气相色谱-质谱分析和数据采集。本发明具有样品处理简单，操作简便，检测糖时间短，灵敏度高，检测结果重复性高，可实现多个样品制备等优点。
【专利说明】气相色谱-质谱检测细胞内糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化学检验测定【技术领域】，特别是涉及一种气相色谱-质谱检测细胞内糖的方法。
【背景技术】
[0002]在利用气相色谱-质谱检测糖代谢物方面，目前已有相关技术报道，如专利201210046953.2，公布了一种气相色谱一质谱检测尿糖的方法，包括如下步骤:(I)对待检尿液样本完成尿酶处理；(2)加入内标品，采用冷冻乙醇进行沉淀蛋白的处理，将样本吹干；(3)对上述样本进行甲基硅烷化衍生处理；(4)采用上述1-3的步骤处理标准糖，得到标准糖样本；(5)采用气相色谱一质谱联用仪对标准糖样本和待检尿液样本进行检测；(6)以标准糖样本的检测结果作为参比曲线，用常规算法对待检尿液样本的糖进行定量。该专利发明主要应用领域为尿样检测，且该检测方法仅局限于糖代谢物的检测。
[0003]对于微生物胞内、胞外代谢物的检测研究，可以揭示微生物在发酵条件下的代谢规律，尤其是发酵条件对于微生物目标产物的影响规律。掌握微生物的代谢规律可以不仅有利的促进目标产物的产量提升，而且可确定菌体内的代谢通量分布，进而利用基因工程手段实现菌体内代谢途径的优化与重构，实现目标产物高效生物合成。
[0004]目前对于细胞内的代谢物分析检测方法局限用于特定某类物质，不可实现多类代谢物同时检测。由于细胞内各成分含量复杂多样，对于样品的处理方法很关键，目前还没有相关细胞内、细胞外代谢物的系统处理检测方法，使得开发一种更为灵敏的、广谱的、通用的发酵代谢物检测方法，鉴定各种谱峰对映的化合物结构，以及与其它虚拟模型的整合，成为微生物代谢组研究的热点。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种气相色谱-质谱检测细胞内糖的方法，弥补目前在微生物发酵中对代谢物系统检测方法的空白，克服现有检测技术干扰因素很多、操作繁琐、测试成本高、灵敏度低、检测范围窄等缺点。
[0006]本发明的方案是通过这样实现的:一种气相色谱-质谱检测细胞内糖的方法，检测方法步骤包括:
(1)取发酵液，高速离心，分别收集菌体和上清液I;
(2)细胞内代谢物样品制备:取步骤I)得到的菌体，用生理盐水清洗2?3次，冷甲醇溶解后超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，离心收集5(T200ul萃取后裂解上清液II，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液II体积与内标物核糖醇重量比例为5(T200ul:20u g,室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品I ;
(3)样品衍生:在步骤2)得到的样品I中，分别加入5(Tl50ul糖衍生剂，恒温放置
1.5?4h，再分别加入5(Tl50ul糖衍生剂，恒温放置过夜，衍生完毕，离心衍生后的样品I，收集上清得到待测胞内样品I;(4)利用气相色谱-质谱对步骤3)得到的待测胞内样品I，进行分析和数据采集。
[0007]作为本发明的进一步限定，所述菌体其取样量为用冷甲醇溶解后生物量干重达
0.2^1.0g/ml ;所述的冷甲醇为经过冷浴槽预冷至-40°C;所述低温萃取为_40°C至_50°C下萃取2~7h。
[0008]作为本发明的进一步改进，所述糖衍生剂为0.r0.3mg甲氧胺盐酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得；所述氨基酸衍生剂为5(T200ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中。
[0009]作为本发明的进一步改进，所述气相色谱-质谱其仪器分析条件为:气相色谱:色谱柱为30 mX0.25 mm的HP-5MS或者DB-5MS毛细管柱，进样口温度300°C，检测器温度250°C，柱箱升温程序平衡时间3 min — 80°C维持Imin — 2V /min升温至100°C— 15°C /min升温至220°C— 30°C /min升温至300°C— 300°C维持3 min,进样体积I y L ;质谱:离子源EI，检测器为四级杆，电离能70 eV，离子源表面温度280°C。
[0010]作为本发明的进一步改进，该方法应用于检测酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物发酵过程中的细胞内的糖。
[0011]作为本发明的进一步改进，其特征在于，所述糖为葡萄糖、果糖、木糖。
[0012]本发明的实质性特点和显著进步是:(1)该方法可以检测细胞内细胞内中糖类物质的检测，不需要对发酵液进行多次复杂处理，节约时间和简化操作步骤，及时得到发酵过程中微生物代谢规律，分析胞内代谢流量。(2)该方法采用冷甲醇萃取细胞内代谢物法，其萃取效果优良，获得细胞内较多代谢物种类，有利于代谢规律的分析。(3)样品分析得到的色谱峰分析效果良好，可对葡萄 糖、果糖、木糖等糖实现检测。
【具体实施方式】
[0013]下面将通过实施例对本发明方法进一步的描述，这些描述并不是对本
【发明内容】
作进一步的限定。
[0014]以下实施例中离心条件为:_4°C下10000 rpm离心10 min。
[0015]以下实施例中气相色谱-质谱其仪器分析条件为:气相色谱:色谱柱为30mX0.25 mm的HP-5MS或者DB-5MS毛细管柱，进样口温度300°C，检测器温度250°C，柱箱升温程序平衡时间3 min — 80°C维持Imin — 2V /min升温至100°C— 15°C /min升温至2200C- 30°C /min升温至300°C— 300°C维持3 min，进样体积I y L ;质谱:离子源EI，检测器为四级杆，电离能70 eV，离子源表面温度280°C。
[0016]以下实施例皆可实现对葡萄糖、果糖、木糖等糖进行检测。
[0017]实施例1 取酵母菌发酵液。
[0018](I)细胞内代谢物样品制备:取5ml发酵液，离心得到菌体，用生理盐水清洗菌体2次，-40°C冷甲醇溶解后生物量干重达0.2g/ml，超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，低温条件为:-40°C至-50°C下萃取4h，离心收集150ul萃取后裂解上清液I，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液I体积与内标物核糖醇重量比例为150ul:20ii g，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品I。
[0019](2)细胞外液样品制备:取发酵液，离心得到上清液II，取300ul上清液II，在清液
II中加入乙腈除去蛋白，上清液II与乙腈体积比为1: 1.2，涡旋振荡，再离心收集得上清液III，加入内标物核糖醇溶液，上清液III体积与内标物核糖醇重量比例为IOOul:20i!g，室温真空烘干，得到细胞外液样品II。
[0020](3)样品衍生:在步骤I)和步骤2)得到的样品I和样品II中，分别加入IOOul糖衍生剂(糖衍生剂为0.1mg甲氧胺盐酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得)，恒温放置1.5h，再分别加入IOOul氨基酸衍生剂(氨基酸衍生剂为IOOul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中配制而得)，恒温放置过夜，衍生完毕，分别离心衍生后的样品I和样品II，对应收集各自上清得到待测胞内样品I和待测胞外样品II。
[0021](4)按照气相色谱-质谱其仪器分析条件，对待测胞内样品I和待测胞外样品II进行分析和数据采集。
[0022]实施例2 取酵母菌发酵液。
[0023](I)细胞内代谢物样品制备:取5ml发酵液，离心得到菌体，用生理盐水清洗菌体3次，-40°C冷甲醇溶解后生物量干重达1.0g/ml，超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，低温条件为:-40°C至-50°C下萃取5h，离心收集IOOul萃取后裂解上清液I，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液I体积与内标物核糖醇重量比例为IOOul: 20 ii g，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品I。
[0024](2)细胞外液样品制备:取发酵液，离心得到上清液II，取350ul上清液II，在清液II中加入乙腈除去蛋白，上清液II与乙腈体积比为1:0.7，涡旋振荡，再离心收集得上清液III，加入内标物核糖醇溶液，上清液III体积与内标物核糖醇重量比例为200ul:20i! g，室温真空烘干，得到细胞外液样品II。
[0025](3)样品衍生:在步骤I)和步骤2)得到的样品I和样品II中，分别加入50ul糖衍生剂(糖衍生剂为0.3mg甲氧胺盐酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得)，恒温放置2.0h，再分别加入150ul氨基酸衍生剂(氨基酸衍生剂为150ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中配制而得)，恒温放置过夜，衍生完毕，分别离心衍生后的样品I和样品II，对应收集各自上清得到待测胞内样品I和待测胞外样品II。
[0026](4)按照气相色谱-质谱其仪器分析条件，对待测胞内样品I和待测胞外样品II进行分析和数据采集。
[0027]实施例3 取乳酸菌发酵液。
[0028](I)细胞内代谢物样品制备:取5ml发酵液，离心得到菌体，用生理盐水清洗菌体3次，-40°C冷甲醇溶解后生物量干重达0.6g/ml，超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，低温条件为:-40°C至-50°C下萃取3h，离心收集200ul萃取后裂解上清液I，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液I体积与内标物核糖醇重量比例为200ul:20ii g，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品I。
[0029](2)细胞外液样品制备:取发酵液，离心得到上清液II，取60ul上清液II，在清液II中加入乙腈除去蛋白，上清液II与乙腈体积比为1:1.5，涡旋振荡，再离心收集得上清液III，加入内标物核糖醇溶液，上清液III体积与内标物核糖醇重量比例为50ul:20i! g，室温真空烘干，得到细胞外液样品II。
[0030](3)样品衍生:在步骤I)和步骤2)得到的样品I和样品II中，分别加入150ul糖衍生剂(糖衍生剂为0.15mg甲氧胺盐酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得)，恒温放置2.5h，再分别加入50ul氨基酸衍生剂(氨基酸衍生剂为200ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中配制而得)，恒温放置过夜，衍生完毕，分别离心衍生后的样品I和样品II，对应收集各自上清得到待测胞内样品I和待测胞外样品II。
[0031](4)按照气相色谱-质谱其仪器分析条件，对待测胞内样品I和待测胞外样品II进行分析和数据采集。
[0032]实施例4 取霉菌发酵液。
[0033](I)细胞内代谢物样品制备:取5ml发酵液，离心得到菌体，用生理盐水清洗菌体2次，-40°C冷甲醇溶解后生物量干重达0.8g/ml，超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，低温条件为:-40°C至-50°C下萃取2h，离心收集50ul萃取后裂解上清液I，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液I体积与内标物核糖醇重量比例为50ul:20ii g，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品I。
[0034](2)细胞外液样品制备:取发酵液，离心得到上清液II，取200ul上清液II，在清液II中加入乙腈除去蛋白，上清液II与乙腈体积比为1: 1.0，涡旋振荡，再离心收集得上清液III，加入内标物核糖醇溶液，上清液III体积与内标物核糖醇重量比例为150ul:20i!g，室温真空烘干，得到细胞外液样品II。
[0035](3)样品衍生:在步骤I)和步骤2)得到的样品I和样品II中，分别加入120ul糖衍生剂(糖衍生剂为0.2mg甲氧胺盐酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得)，恒温放置3.0h，再分别加入80ul氨基酸衍生剂(氨基酸衍生剂为50ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中配制而得)，恒温放置过夜，衍生完毕，分别离心衍生后的样品I和样品II，对应收集各自上清得到待测胞内样品I和待测胞外样品II。
[0036](4)按照气相色谱-质谱其仪器分析条件，对待测胞内样品I和待测胞外样品II进行分析和数据采集。
[0037]实施例5 取梭菌发酵液。
[0038](I)细胞内代谢物样品制备:取5ml发酵液，离心得到菌体，用生理盐水清洗菌体3次，-40°C冷甲醇溶解后生物量干重达0.5g/ml，超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，低温条件为:-40°C至-50°C下萃取3h，离心收集200ul萃取后裂解上清液I，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液I体积与内标物核糖醇重量比例为150ul:20ii g，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品I。
[0039](2)细胞外液样品制备:取发酵液，离心得到上清液II，取300ul上清液II，在清液II中加入乙腈除去蛋白，上清液II与乙腈体积比为1:0.5，涡旋振荡，再离心收集得上清液III，加入内标物核糖醇溶液，上清液III体积与内标物核糖醇重量比例为300ul:20i! g，室温真空烘干，得到细胞外液样品II。
[0040](3)样品衍生:在步骤I)和步骤2)得到的样品I和样品II中，分别加入IOOul糖衍生剂(糖衍生剂为0.2mg甲氧胺盐酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得)，恒温放置4.0h，再分别加入120ul氨基酸衍生剂(氨基酸衍生剂为120ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中配制而得)，恒温放置过夜，衍生完毕，分别离心衍生后的样品I和样品II，对应收集各自上清得到待测胞内样品I和待测胞外样品II。
[0041](4)按照气相色谱-质谱其仪器分析条件，对待测胞内样品I和待测胞外样品II进行分析和数据采集。
【权利要求】
1.一种气相色谱-质谱检测细胞内糖的方法，其特征在于，检测方法步骤包括: (1)取发酵液，高速离心，分别收集菌体和上清液I; (2)细胞内代谢物样品制备:取步骤I)得到的菌体，用生理盐水清洗2~3次，冷甲醇溶解后超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，离心收集5(T200ul萃取后裂解上清液II，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液II体积与内标物核糖醇重量比例为5(T200ul:20u g,室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品I ; (3)样品衍生:在步骤2)得到的样品I中，分别加入5(Tl50ul糖衍生剂，恒温放置1.5~4h，再分别加入5(Tl50ul氨基酸衍生剂，恒温放置过夜，衍生完毕，离心衍生后的样品I，收集上清得到待测胞内样品I ; (4)利用气相色谱-质谱对步骤3)得到的待测胞内样品I，进行分析和数据采集。
2.根据权利要求1所述的一种气相色谱-质谱检测细胞内糖的方法，其特征在于，所述菌体其取样量为用冷甲醇溶解后生物量干重达0.2^1.0g/ml ;所述的冷甲醇为经过冷浴槽预冷至_40°C ;所述低温萃取为_40°C至_50°C下萃取2~7h。
3.根据权利要求1或2所述的一种气相色谱-质谱检测细胞内糖的方法，其特征在于，所述糖衍生剂为0.r0.3mg甲氧胺盐酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得；所述氨基酸衍生剂为5(T200ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中。
4.根据权利要求3所述的一种气相色谱-质谱检测细胞内糖的方法，其特征在于，所述气相色谱-质谱其仪器分析条件为:气相色谱:色谱柱为30 mX0.25 mm的HP-5MS或者DB-5MS毛细管柱，进样口温度300°C，检测器温度250°C，柱箱升温程序平衡时间3min — 80°C维持 Imin — 2°C /min 升温至 100°C— 15°C /min 升温至 22CTC— 30°C /min 升温至300°C— 300°C维持3 min，进样体积I y L ;质谱:离子源EI，检测器为四级杆，电离能70 eV，离子源表面温度280°C。`
5.根据权利要求4所述一种气相色谱-质谱检测细胞内糖的方法,其特征在于,该方法应用于检测酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物发酵过程中的细胞内的糖。
6.根据权利要求广2或4飞任一项所述的一种气相色谱-质谱检测细胞内糖的方法，其特征在于，所述糖为葡萄糖、果糖、木糖。
7.根据权利要求3所述的一种气相色谱-质谱检测细胞内糖的方法，其特征在于，所述糖为葡萄糖、果糖、木糖。
【文档编号】G01N30/06GK103675131SQ201310648742
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】陈东, 梁远雄 申请人:柳州联海科技有限公司