用于时间分辨荧光免疫测定检验的方法和装置制造方法
【专利摘要】用于检测测试样品中分析物的存在或量的测定方法和装置，包括：形成第一测试样品和限定量的纳米球探针的自由水性混合物，所述纳米球探针为分析物捕获部分和长时间发射荧光标记的缀合物；将测试条的接触带与水性混合物接触，测试区域上结合了测试结合部分，对于竞争性测试，测试结合部分能与分析物捕获部分竞争性结合任何样品，或对于夹心测定，测试结合部分与分析物捕获部分非竞争性地结合任何样品分析物，对照区域上结合了纳米球探针的对照结合部分；选择性地测量测试区域和对照区域的长时间发射荧光，以及对于给定的测试条，确定用所述测试区域信号和对照区域信号的总和标准化的测试带值。
【专利说明】用于时间分辨荧光免疫测定检验的方法和装置
[0001]本发明涉及在测试样品中检测分析物的存在或量的方法、测定试剂盒和用于测定的纳米球探针。
[0002]时间分辨荧光测定(时间分辨荧光免疫测定[sic]，TRFIA)是相对较新类型的检测手段。TRFIA采用稀土离子作为用于标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞的示踪剂。所述稀土离子与能结合该离子的螯合剂和增强溶液(在某些情况下不需要)一起被用于所需的反应体系中(例如，抗原-抗体免疫反应、生物素-亲和素反应、核酸探针杂交、靶标-效应细胞杀伤应答等)。反应后，通过时间分辨荧光测量最终产物中的荧光强度，从荧光强度(可针对对照读数标准化)可以推断反应体系中分析物的浓度。例如，参见美国专利第7，632，653号。与化学发光法和电化学发光免疫分析技术一样，TRFIA已被称为前三名高灵敏度的检测技术之一，并在食品检测、临床医学检验、生物研究测试和环境测试中被广泛应用。
[0003]由于稀土复合物都具有低荧光强度，因此还需要利用荧光增强技术来提高检测灵敏度。当前公认的有三类TRFIA，通过不同的信号增强技术将它们区分开:(I)解离增强技术(解离增强镧系元素荧光免疫分析；DELFIA) ； (2) CyberFluor系统；和(3)基于纳米球的TRFIA (纳米TRFIA)。其中，纳米TRFIA是全新的时间分辨荧光测试手段，其结合了稀土元素荧光的长时间性与纳米球的信号放大效应。稀土元素和其配位复合物被一起施加到纳米球和微球上。表面活化后，例如用这类标志物标记的抗体能形成复合物，当该复合物被用于免疫测定时，能够大大提高灵敏度并获得更宽的线性范围。在实践中，实际性能至少与DELFIA技术的性能相当。
[0004]CN02144517公开了强荧光稀土纳米颗粒(镧系元素荧光纳米颗粒，缩写为LFNP)的制备及在生物检测技术中应用该纳米颗粒的方法。这些颗粒是基于强荧光性稀土复合物的发光中心，米用娃胶化学包被制备而成。
[0005]CN03133857公开了 β - 二酮-三价铕复合物纳米荧光探针及其制备和应用。该发明涉及从能与硅酸酯共聚合的单体制成的功能性稀土荧光纳米颗粒，其中所述单体与三价铕-β - 二酮类荧光复合物于有机溶剂中发生共价键合反应，然后再与硅酸酯进行共聚。三价铕离子、二酮有机配体、可共聚合的单体和硅酸酯的摩尔比例是1:2-3:10-100:350-450 ο
[0006]然而，现有的稀土荧光探针仍然受到诸如低荧光强度、低分析灵敏度、易于被光漂白等缺陷的限制。此外，需要改进TRFIA方法以提供进行即时分析所需的快速性、易用性和便捷性。
[0007]此外，还需要更准确、更灵敏和耐保存的装置，以及实施时间分辨荧光免疫分析测试的方法。相比于分析物捕获部分和荧光标记的缀合物被设置在测试条上的检测，本发明的测定和测定试剂盒提供了意想不到的更好的稳定性并产生了更高的灵敏度。
[0008]发明概述
[0009]本发明的实施方案大体涉及用于改进时间分辨免疫测定中的荧光和检测的方法和装置，其在至少一幅附图中示出和/或结合附图进行了描述，并在权利要求中更完整地说明。
[0010]在参阅本文的以下详细描述以及附图后能够理解本文的这些和其他特征和优势，在附图中，类似的参考编号指代类似的部件。
[0011]附图简要描述
[0012]为了能详细理解本发明的上述特征，参考以下实施方案(其中一些在附图中示出)可以了解上文概述的本发明的更具体的描述。然而应当理解，附图仅示出了本发明的典型实施方案，因此不能认为是限制本发明的范围，因为本发明可涵盖其他等同的有效实施方案。
[0013]图1A至IC是本发明的实施方案的方法中使用的组件的示意图。
[0014]图2是方法的图，是本发明的实施方案的方法中使用的分子组件的示意图。
[0015]图3是实施本发明的实施方案的示例性方法的流程图。
[0016]尽管在本文中利用多个实施方案和示例性的附图通过举例说明的方式描述了本发明，本领域技术人员应当认识到，本发明不限于描述的附图实施方案或附图。应当理解，附图及对其的详细描述不意欲将本发明限制为公开的具体形式，相反，本发明覆盖落入由所附权利要求所限定的本发明的实质和范围中的所有变体、等同方案和替换方案。本文所用的标题仅为行文结构之用，并不意欲用于限制说明书或权利要求的范围。在本申请全文中使用的术语“可以”以容许的含义(即，表示有可能)使用，而不是强制的含义(即，表示必须)。类似地，术语“包括”(include), “包括(including)”和“包括(includes)”表示包括但不限于。
[0017]“自由”水性混合物是指不在聚合物基质背景下的水性混合物。例如，该混合物不是使样品施加通过测试条的工作区而形成的混合物。此外，本文的实施方案预计能用于用于即时检测环境以及实验室管控环境。
[0018]发明详述
[0019]图1A示意性地显示了具有两个测试孔112的托盘110 (例如，加热块，测试板等)。容器150 (任选的)位于测试孔112中。容器(例如小瓶、瓶、试管等)中容纳了限定量的稳定形式的纳米球探针NsP (例如，冻干品)。
[0020]图1B示出了纳米球探针Nsp已经与样品混合之后的具有容器的托盘，纳米球探针Nsp与样品混合形成水性混合物130。测试条140与水性混合物在样品带SZ接触。水性流体从样品带SZ流至测试带TZ。任选的芯吸带WZ可辅助提供从水性带的更大、但规律的流动。测试区域T已经结合了检测结合部分。对照区域C已经结合了对照结合部分。图1C是测试条140的放大图。样品带(样品板)、测试带(膜)和芯吸带(芯吸板)的示例性材料描述于美国专利第7，632，653号，将其中关于测试条和使用测试条的方法的描述整体并入本文。
[0021]图2示意性地显示了纳米球探针NsP和分析物An。纳米球探针NsP具有稀土复合物(用示例性的稀土盐Eu3+和Tb3+表示)和分析物捕获部分(“ACM”，吃豆人样的图形)。示出了示意性的分析物An。示例的分析物An示出较小，从而不能提供与分子(或分子复合物)的两个分别的区域的有效结合。因此，示例的分析物适用于竞争性测定，从而较大量的分析物的信号与较弱的长期荧光在测试区域T相关联。较大的分析物(例如蛋白或蛋白复合物)也可以用夹心测定检测，其中ACM结合一个结构域，检测结合部分结合另一个结构域。示例性的图不表示结合部分与纳米球的比例，也不表示稀土与纳米球的比例。
[0022]在夹心测定中，通常，分析物捕获部分(AMC)是能结合分析物的抗体(其可以是生物系统的产物的化学衍生物，或这类产物的遗传或化学模拟物，例如嵌合抗体)。检测结合部分是也能结合分析物的另外的抗体。在测定中产生的荧光信号与分析物浓度成比例。对照结合部分可以是能结合ACM的抗体的抗体，或可以是能结合抵达对照区域C的所有蛋白(例如ACM的抗体)的组分。
[0023]对于竞争性测定，检测结合部分可以是例如一份固定的分析物或其模拟物。例如，对于三聚氰胺测定，ACM可以是抗体，检测结合部分可以是与卵清蛋白或牛血清白蛋白(化学)缀合的三聚氰胺，对照结合部分可以是能结合ACM的抗体的抗体。竞争性测定中产生的荧光信号与分析物浓度成相反比例。
[0024]抗体可以是多克隆的或单克隆的。通过免疫诸如兔、山羊、绵羊等动物可以产生多克隆抗体。产生的抗体存在于动物血液中。这些抗体可以以血清或血浆的形式用于TRFIA反应中。或者，在使用前可以通过蛋白A、蛋白G或亲和方法纯化这些多克隆抗体。
[0025]通常，通过使用所需的免疫原免疫诸如小鼠的动物可获得单克隆抗体。将小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。然后，选择能产生所需抗体的细胞并将其克隆，从而不断产生相同的抗体。如何制备单克隆抗体的详细描述已经描述于Koehler and Milstein0(Koehler, G.;Milstein, C.(1975) “Continuous of cultures of fused cells secretingantibodies of predefined specificity，，，Nature256 (5517): 495—497)。
[0026]为了产生针对诸如蛋白质的大分子的抗体，通常将免疫原与油性化合物(例如弗氏完全佐剂或不完全佐剂)混合之后直接注射入动物中。为了产生针对半抗原(小分子量免疫原)的抗体，将半抗原与载体蛋白(例如匙孔血蓝蛋白(KLH)，牛血清白蛋白或卵清蛋白)化学缀合后，再注射入动物中。
[0027]可以使用夹心测定来检测通常包含多个表位(抗体结合位点)的大分子。因此，至少两个抗体可以与同一个大分子同时结合。在检测半抗原时，通常使用竞争性测定，这是因为每种半抗原通常仅包含一个表位，使得两个抗体同时结合半抗原在空间上很困难以或不可能。
[0028]所公开的TRFIA预期能适用于通过夹心形式检测大量蛋白。这些蛋白包括但不限于:前列腺特异性抗原(PSA)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、牛妊娠特异性糖蛋白。
[0029]公开的TRFIA还预期能适用于通过竞争性形式检测大量半抗原。这些半抗原包括但不限于:抗生素，例如内酰胺类、氯霉素、四环素、磺酰胺类，以及其他药物，例如喹诺酮类、克伦特罗、莱克多巴胺。
[0030]“长时间发射荧光标记”是发射时间大于I微秒的标记。选择性地测量长时间发射荧光的方法描述于，例如美国专利第7，632，653号，将其中关于这类测量的描述整体并入本文。
[0031]纳米球探针能充分地连接到其组分部分，使得该部分能与流过测试条的流体保持连接，并且能充分地结合测试区域或对照区域，从而保持测定的功能。测试结合部分和对照结合部分“结合”到测试条，其中它们能充分地保持定位和功能，从而保持测定的功能。通常，它们吸附在测试区域或对照区域(例如，通过范德华力)，但它们也可以共价连接到测试条。
[0032]在进行测定时，测试样品可以冷藏或冻藏。因此，在插入测试条之前，孵育准备用于测定的孔是有用的。例如，可以在37°C下将孔孵育3分钟。
[0033]在某些实施方案中，纳米球探针包括Eu3+和另一镧系元素，另一镧系元素在镧系元素中的摩尔百分比为0.1%至10%。在某些实施方案中，另一镧系元素为Sm3+、Tb3+、Nd3+、Dy3+或以上的混合物。
[0034]在某些实施方案中，纳米球具有10至400nm的颗粒直径。在某些实施方案中，纳米球具有170至200 μ eq/g的表面电荷。在某些实施方案中，纳米球具有25至35.7 A2/grp(占据面积)的羧基密度。
[0035]在某些实施方案中，纳米颗粒包含稀土离子、二酮螯合剂。在某些实施方案中，稀土离子(除反离子之外)相对于稀土离子和β - 二酮的总含量的摩尔百分比为10至30%。
[0036]在某些实施方案中，纳米颗粒包含稀土离子、荧光增强剂。在某些实施方案中，荧光增强剂与稀土离子和荧光增强剂的总含量的摩尔百分比为70至90%。在某些实施方案中，纳米颗粒包含稀土离子、β_ 二酮螯合剂和荧光增强剂，它们的摩尔比为1:4:5。
[0037]在某些实施方案中，荧光增强剂为三辛基氧化膦和/或菲咯啉。荧光增强剂是能增加来自稀土荧光团的荧光信号的化合物。在某些实施方案中，本发明的测定方法可以在测试样品准备好后的10或15分钟内进行。当测试样品是血液时，测试条可以调整为能保留红细胞，使得它们的颜色不会在测试区域或对照区域造成干扰。在某些实施方案中，可以将血液分开(例如，通过离心)以提供血浆作为测试样品。
[0038]容器中的纳米球探针被干燥为贮藏稳定的形式，当用合适的水性样品润湿时，能快速恢复至功能形式。本领域技术人员根据纳米球探针的分子形式能够理解合适的水性样品(例如，在pH值、盐浓度等方面)。
[0039]本文列举的所有范围包括其之间的范围，并可以包括或排除端点。可选的包括的范围来自在列举的量级或次一级量级上的范围之间的整数值(或包括一个原始端点)。例如，如果较低范围值为0.2，可选的包括的端点可以是0.3,0.4……1.1,1.2等，以及1、2、3等；如果较闻的范围为8,可选的包括的端点可以是7、6等，以及7.9、7.8等。单边范围，例如3或更多，类似地包括从列举的量级或次一级量级上的整数值开始的连续范围。例如，3或更多包括4或更多，或3.1或更多。
[0040]示例步骤1:豫化聚苯乙摇纳米球的制备
[0041]将1mm苯乙烯单体和0.95mm丙烯酸单体溶解于含0.45mm十二烧基磺酸盐的1mL去离子水中，并加入到圆底烧瓶中。用磁搅拌器搅拌均匀之后，使用高纯度氮气排出圆底烧瓶的空气，然后固定烧瓶并加热至70°C。加入0.5mL的0.15_过硫酸钾，并允许在搅拌下、在密封的无氧条件下反应8小时。然后将烧瓶冷却至室温，用Whatman2V滤纸(孔径8μ m)过滤反应液。最后,利用透析袋(截留分子量30，OOODa)在去离子水中透析5天，收集透析袋中的液体，加入0.05%叠氮钠并在4°C下保存。
[0042]制备的羧化聚苯乙烯纳米球的直径经测量为190±10nm。表面电荷为170至200(μ eq/g)，羧基密度为25至35.7 (占据面积，A2Zgrp )。
[0043]示例步骤2:荧光纳米球的制备
[0044]将1mL的去离子水和丙酮的混合物(v/v=l:1)加入少量的在示例步骤I中制备的190nm的聚苯乙烯微球中，使得反应溶液中聚苯乙烯微球的密度为约1X1014。在充分搅拌之后，加入10yL的0.1M三氯化铕、IyL的0.1M三氯化铽、400 μ L的0.ΙΜβ-二酮(β -ΝΤΑ, β -萘基甲酰基三氟丙酮，即，2-萘基甲酰基三氟丙酮)、300 μ L的三辛基氧化膦(TOPO)和100 μ L的菲咯啉。首先将混合物加热至60°C的恒定温度，在搅拌下进行暗反应10小时，然后冷却至室温再反应2小时。最终，通过减压蒸馏去除溶液中的有机溶剂，然后将溶液进行去离子水透析5天，以去除剩下的残余小分子。收集透析袋中的液体，加入0.05%叠氮钠并在4°C下保存。
[0045]通过测试和计算，发现包裹每个荧光纳米球的铕离子螯合剂的平均数量为约180，000 至 200，000。
[0046]示例步骤3:纳米球鉬分
[0047]参照示例步骤2的配制过程，成功制备(a)没有铽离子、(b)具有铽离子而没有菲咯啉和(C)没有铽离子但具有菲咯啉的荧光纳米球，然后比较荧光强度。结果在表1示出。
【权利要求】
1.检测测试样品中分析物的存在或量的测定方法，包括: 形成第一测试样品和限定量的纳米球探针的自由水性混合物，所述纳米球探针为分析物捕获部分和长时间发射荧光标记的缀合物； 将测试条的接触带与所述水性混合物接触，以引起所述水性混合物从所述接触带流过所述测试条的测试带，所述测试带为多孔膜，并包括与所述接触带依次隔开的测试区域和对照区域； 所述测试区域上结合了测试结合部分，(a)对于竞争性测试，所述测试结合部分能与所述分析物捕获部分竞争性结合任何样品，或(b)对于夹心测定，所述测试结合部分与所述分析物捕获部分非竞争性地结合任何样品分析物； 所述对照区域上结合了对照结合部分，所述对照结合部分能结合纳米球探针； 选择性地测量所述测试区域和对照区域的长时间发射荧光；以及 对于给定的测试条，确定用所述测试区域信号和对照区域信号的总和标准化的测试带值。
2.如权利要求1所述的方法，包括对于三聚氰胺的竞争性测定。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述纳米球探针包含Eu3+和另一镧系元素，所述另一镧系元素在镧系元素中的摩尔百分比为0.1%至10%。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述另一镧系元素为Sm3+、Tb3+、Nd3+、Dy3+或它们的混合物。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述方法是竞争性测定。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述方法是夹心测定。
7.如权利要求1所述的方法，包括使用相同限定量的纳米球探针对第二测试样品实施所述方法。
8.测定试剂盒，包括: i)测试条，其包括测试带，所述测试带是多孔膜，并包括与接触带依次隔开的测试带和对照带， 所述测试带上结合了测试结合部分，(a)对于竞争性测试，所述测试结合部分能与分析物捕获部分竞争性结合任何样品，或(b)对于直接测定，所述测试结合部分与分析物捕获部分非竞争性地结合任何样品分析物， 所述对照带上结合了能结合纳米球探针的对照结合部分；和 ii)具有限定量的干燥的稳定化纳米球探针的容器，所述纳米球探针是分析物捕获部分和长时间发射突光标记的缀合物。
9.如权利要求8所述的测定试剂盒，其是用于测试是否存在三聚氰胺的测定试剂盒，其中所述测试结合部分是三聚氰胺和蛋白的缀合物。
10.如权利要求8所述的测定试剂盒，其中所述纳米球探针包含Eu3+和另一镧系元素，所述另一镧系元素在镧系元素中的摩尔百分比为0.1%至10%。
11.如权利要求10所述的测定试剂盒，其中所述另一镧系元素为Sm3+、Tb3+、Nd3+、Dy3+或它们的混合物。
12.如权利要求10所述的测定试剂盒，其中所述试剂盒包括两个或更多个具有相同限定量的纳米球探针的所述容器。
13.如权利要求8所述的测定试剂盒，其中所述测定适合于竞争性测定。
14.如权利要求8所述的测定试剂盒，其中所述测定适合于夹心测定。
15.纳米球探针，其是分析物捕获部分和长时间发射荧光标记的缀合物，其中所述纳米球探针包含Eu3+和另一镧系元素，所述另一镧系元素在镧系元素中的摩尔百分比为0.1%至10%。
【文档编号】G01N21/64GK104169710SQ201380000653
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年3月19日 优先权日:2013年3月19日
【发明者】肖理文 申请人:香港锦程发展有限公司