结核菌群的免疫学检测方法和试剂盒的制作方法

结核菌群的免疫学检测方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】由于用于检测结核菌群的常规方法需要时间长且还需要大量劳力和费用，因此，还不能进行结核病的确定诊断和早期治疗开始。已存在对快速检测方法的需求。即使对于从生物样品直接检测，如果生物样品中不存在MPT64或仅存在非常少量的MPT64，也不能进行检测。结果，已产生结核菌群感染被忽略的风险，并且更可靠的检测方法十分必要。提供一种方法和试剂盒，其中加热处理施加至含有结核菌群的生物样品，从而使结核菌群特异的分泌蛋白质，特别是MPB64，分泌到细菌细胞外，并将得到的处理样品进行免疫学测定，从而在不培养生物样品的情况下以更迅速且简便的方式检测结核菌群。
【专利说明】结核菌群的免疫学检测方法和试剂盒

【技术领域】
[0001] 本发明涉及高度安全的结核菌群（Mycobacterium tuberculosis complex)的免 疫学检测方法和试剂盒，其通过在预定的温度下加热处理生物样品并免疫学检测由此被细 胞外分泌（extracellularly secreted)的结核菌群特异的分泌蛋白质，可在不进行培养操 作的情况下由含有结核菌群的生物样品直接简便且迅速地进行。

【背景技术】
[0002] 结核（Tuberculosis)为目前高度重要的传染病，据称每年日本国内有数千人、世 界各地有数百万人死于该疾病，根据传染病法（Infectious Disease Law)疑似结核感染的 患者必须入院。当诊断患者患有结核时医师必须立即报告给当局，因而需要及时的响应。
[0003] 属于结核菌群的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,人型结核菌）、 牛结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis，牛型结核菌）、鼠结核分枝杆菌（Mycobacterium microti，鼠型结核菌）和非洲结核分枝杆菌（Mycobacterium africanum，非洲型 结核菌）已知为对人类致病的抗酸菌（acid-fast bacteria)。鸟结核分枝杆菌 (Mycobacterium avium)、堪萨斯结核分枝杆菌（Mycobacterium kansasii)和海鱼结 核分枝杆菌（Mycobacterium marinum)等已知为非结核性分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria)〇
[0004] 感染有结核菌群的人类主要由结核分枝杆菌引起,在某些罕见病例中，由牛结核 分枝杆菌引起。近年来，非结核性分枝杆菌种中，感染有鸟结核分枝杆菌的病例增加。由于 这两类感染存在类似的临床症状，病因细菌的鉴定对于确定治疗方针也是重要的。
[0005] 因此，结核感染或非结核性分枝杆菌感染的区别检测对于减轻患者负担和适当地 进行早期治疗同样是重要的。在另一方面，从公共卫生的角度，区别检测对于防止第三人继 发感染的目的也是重要的。
[0006] 迄今为止，作为检测结核菌群的方法，已实施了基于培养的检测方法。此类培养方 法通过将待试验的生物样品接种至液体培养基或固体培养基并检测生长的细菌细胞来进 行。尽管使用液体培养基的方法可缩短待试验的生物样品的培养期，但该方法在操作期间 具有继发感染的高风险，因而需要高度安全的设备和装置。使用固体培养基的方法需要长 达大约2个月的时间才能获得检测结果。结核菌群必须使用高度安全的装置在高度安全的 环境中特别小心地培养以防止继发感染。
[0007] 作为用于从上述培养的生物样品的培养基中鉴定结核菌群的方法，已知涉及免疫 学测定分泌至培养基中的结核菌群特异的蛋白质的简便检测方法。
[0008] 日本专利特开平11-108931号公报公开了用于检测结核菌群存在的方法，该方法 包括：将从结核病患者收集的生物样品接种至固体培养基或液体培养基，培养结核菌群数 日至数周；然后免疫学检测分泌至培养基中的结核菌群特异的分泌蛋白质MPB64。根据该 文献，该方法与常规方法相比允许在培养后立即鉴定和检测结核菌群并减少操作期间继发 感染的风险。
[0009] 然而，该方法涉及培养包含在生物样品中的结核菌群，并使用得到的培养物作为 样品。因此，该方法需要与直至结核菌群被检测和鉴定的培养期几乎相同的时间，因而需要 大量劳力和费用。
[0010] 如日本专利特开平11-108931号公报所述，MPB64为牛结核分枝杆菌BCG(M. bovis BCG)产生并被细胞外分泌的结核菌群特异的分泌蛋白质。MPT64为结核分枝杆菌产生并被 细胞外分泌的结核菌群特异的分泌蛋白质。MPB64和MPT64已知为相同的物质。
[0011]日本专利特开2002-62299号公报指出，结核菌群特异的分泌蛋白质MPT64可在不 培养包含在生物样品中的结核菌群的情况下通过免疫学测定来检测。该方法涉及处理生物 样品如痰并检测包含在生物样品中的MPT64,从而检测结核菌群的存在。
[0012] 然而，即使结核菌群存在于生物样品中，除非MPB64由结核菌群被细胞外分泌并 包含在生物样品中，否则该方法也不能检测出结核菌群。另外，丰度小的MPT64,即使分泌也 需要大量的生物样品并使操作复杂化。该操作增加了试验对象和负责试验人员的负担。同 时，可能会忽略结核菌群的感染，导致公共卫生问题。
[0013] 国际公开W02009/084481号公开了一种更快速、更安全且比以往更精确地诊断结 核菌感染的方法，该方法包括使用抗MPB64中特定表位的抗体特异地检测生物样品中的 MPB64。根据该方法，可应用的样品可为通过使用少量液体培养基仅在结核菌群的细菌细胞 实质上开始生长之前的一段时间内培养生物样品获得的培养物。
[0014] 然而，该方法仍需要促进MPB64从生长前的细菌细胞分泌以使大量MPB64在培养 基中累积的方法。
[0015] 现有抟术f献
[0016] 专利f献
[0017] 专利文献1 :日本专利申请特开平11-108931号公报
[0018] 专利文献2 :日本专利申请特开2002-62299号公报
[0019] 专利文献3 :国际公开W02009/084481号


【发明内容】

[0020] 发明要解决的问是页
[0021] 如上所述，常规方法需要长时间检测结核菌群还需要大量劳力和费用。出于这些 原因，结核的确定诊断和早期治疗开始不能进行。因此，已存在对快速检测方法的需求。另 夕卜，如果生物样品不含有MPT64或含非常少量的MPT64,也不能进行生物样品的直接检测。 结果，结核菌群感染可能被忽略。因此，需要更可靠的检测方法。本发明的目的为通过提供 简便、快速且更可靠的结核菌群检测方法来解决这些问题。
[0022] 用于解决问题的方案
[0023] 本发明人已进行了孜孜不倦的研究来解决上述问题，因此发现该问题可通过加热 处理含有结核菌群的生物样品以便细胞外分泌结核菌群特异的分泌蛋白质如MPB64并检 测由此分泌的蛋白质来解决，结果，已完成了本发明。
[0024] 根据一个方面，本发明提供一种结核菌群的检测方法，其包括使结核菌群特异的 蛋白质进行免疫学测定，其中所述蛋白质通过使含有结核菌群的生物样品进行加热处理而 被细胞外分泌。根据另一方面，本发明还提供一种结核菌群检测用试剂盒，作为出于进行上 述方法的目的的结核菌群检测用试剂盒，其至少包括使含有结核菌群的生物样品进行加热 处理的处理容器，和用于检测通过加热处理分泌的结核菌群特异的分泌蛋白质的免疫学测 定装置。该试剂盒可进一步包括样品处理剂和/或溶剂。本发明的检测方法和试剂盒能够 快速且简便地检测结核菌群。根据另外的方面，本发明还提供用于细胞外分泌结核菌群特 异的蛋白质的方法，其包括使含有结核菌群的生物样品进行加热处理。

【专利附图】

【附图说明】
[0025] 图1为示出当使用M. bovis BCG东京菌株的细菌细胞时加热处理温度与促进细胞 外MPB64分泌的效果之间关系的图。
[0026] 图2为示出当使用M.b〇vis BCG东京菌株的细菌细胞时加热处理时间与促进细胞 外MPB64分泌的效果之间关系的图。

【具体实施方式】
[0027] 用于本发明的生物样品不特别限定，只要生物样品可含有结核菌群即可。生物样 品的实例包括痰、胸膜积液、支气管分泌物、胃液、血液、脊髓液、尿液和排泄物。优选地，使 用痰是因为其细菌浓度高。可选地，呼吸检查期间收集的支气管灌洗液或收集自支气管或 肺的组织等可用作生物样品。这些生物样品可各自单独使用或可作为其两种以上的混合物 而使用。
[0028] 生物样品的加热处理优选通过将生物样品置于气闭密封的容器中，然后将该容器 作为整体进行加热处理来进行，这是因为待处理的生物样品含有高感染性结核菌群。从确 保操作者安全的观点，加热处理操作优选在安全橱内进行。加热处理中使用的容器不特别 限定，只要该容器可保持其气闭密封的状态并可抵抗预定的加热温度即可。容器可根据待 试验的生物样品适当地选择。容器可在其开口部安装有带滤器的滴嘴（dropper nozzle) 以便促进由此处理的生物样品从容器排出，以用于免疫学测定。优选使用带滤器的滴嘴，是 因为带滤器的滴嘴可除去包含在处理的生物样品中的固体物质如变性组分，并进一步可简 便地将得到的生物样品置于免疫学测定装置。
[0029] 生物样品可根据其加热处理前的性质利用样品处理剂进行处理如溶解。例如，当 痰用作样品时，可用减少痰的粘度的碱性物质、还原物质、蛋白酶、糖、表面活性剂或蛋白质 变性剂等溶解，从而改进加热处理的效力。特别地，使用氢氧化钠作为碱性物质和N-乙酰 基-L-半胱氨酸作为还原物质的组合处理是简便的且优选使用。
[0030] 根据另一实施方案，生物样品可分散或溶于溶剂，接着进行加热处理。溶剂可为， 例如可保持包含在生物样品中的结核菌群活着的任何溶剂。可使用缓冲液如磷酸盐缓冲盐 水或在抗酸菌分离培养中使用的液体培养基如Middlebr 〇〇k7H9。特别地，优选使用液体培 养基，因为需要通过加热处理来细胞外分泌蛋白质而不影响结核菌群的活性，还因为由此 处理的样品可直接进行免疫学测定。可选地，用样品处理剂溶解的生物样品可再分散于溶 剂中。
[0031] 生物样品的处理温度可为蛋白质可被结核菌群细胞外分泌至生物样品或溶剂中 的任何温度，并优选在40°C至60°C的范围内，更优选在40°C至55°C的范围内。特别地，有 效促进分泌的温度在45°C至50°C的范围内。
[0032] 生物样品的处理时间可为当处理温度保持在上述范围内时，足以细胞外分泌可检 测量的结核菌群特异的分泌蛋白质的时间。处理时间优选15分钟以上，更优选15分钟以 上且2. 5小时以下，进一步优选15分钟以上且1. 5小时以下，最优选30分钟以上且1小时 以下。
[0033] 由此加热处理的样品可仅通过升高加热温度进行结核菌群失活处理。结核菌群的 失活处理温度不特别限定但优选l〇〇°C。包含在样品中的结核菌群的失活使免疫学测定安 全进行而无继发感染的风险。
[0034] 加热处理用加热设备不特别限定，只要该设备能够保持温度恒定即可。可使用恒 温器浴、加热器块（heater block)或培养器等。特别优选小型加热设备，因为所有检测结 核菌群的步骤可在安全橱中完成。
[0035] 根据本发明，结核菌群特异的蛋白质可通过加热处理生物样品来细胞外分泌。因 此使用由此处理的生物样品通过免疫学测定等可容易地检测结核菌群的存在。
[0036] 本发明中，被细胞外分泌的结核菌群特异的蛋白质不特别限定，只要蛋白质被细 胞外分泌即可。
[0037] 由结核菌群细胞外分泌的蛋白质的实例包括许多蛋白质如MPT64、MPB64、MPB70、 ESAT-6和CFP-10。这些蛋白质中，在短时间内被大量细胞外分泌的蛋白质优选作为用作本 发明中使用的指示免疫学测定中结核菌群存在的指标的蛋白质。例如，MPB64,即MPT64,通 过根据本发明的加热处理生物样品，在无培养的情况下，即在细菌细胞开始增殖之前，被大 量细胞外分泌或释放。由此观点，MPB64,即MPT64优选用作检测结核菌群存在的靶标。被 细胞外分泌的MPB64,即MPT64可被免疫学测定，从而确定结核菌群存在与否。
[0038] 在本发明的检测方法中，免疫学测定不特别限定，且优选使用抗结核菌群特异的 分泌蛋白质的第一抗体和第二抗体的夹心免疫学测定（sandwich immunoassay)，特别是酶 联免疫吸附测定（ELISA)或免疫层析测定。第一抗体和第二抗体可相同或可彼此互不相 同，只要它们允许结核菌群特异的分泌蛋白质检测即可。
[0039] 该免疫学测定可为能够免疫检测通过生物样品的加热处理而被细胞外分泌的 MPB64的任何方法，且优选免疫层析测定，特别优选使用抗-MPB64单克隆抗体的免疫层析 测定。MPB64检测用免疫层析测定可根据日本专利特开平11-108 931号公报记载的方法 容易地进行。另外，可使用商购可得的MPB64,即MPT64检测用免疫层析测定装置Capiliaui TB (由 TAUNS Laboratories, Inc.制造）。
[0040] 实施例
[0041] 本发明将借助下述实施例进一步详细描述。然而，本发明不意欲受这些实施例的 限制。
[0042] 参考例1 (供试菌液的制各）
[0043] 将 4. 7g Middlebrook7H9 肉汤培养基（broth base)(由 Difco Laboratories Inc.制造）溶于900ml含0. 5g吐温80的蒸馏水中。将溶液在高压釜中121°C高压灭菌 10分钟。冷却后，IOOrnl的ADC增菌液（ADC Enrichment)(白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶 (albumin-dextrose-catalase))在无菌下加入其中，从而制备Middlebrook7H9液体培养 基。
[0044] M. bovis BCG东京菌株（下文中称作，BCG菌株）接种至上述制备的液体培养基， 并根据标准方法培养。继续培养直至获得对应于马克法兰氏标准1的浊度。离心所得细菌 溶液以回收细菌细胞。回收的细菌细胞通过加入上述Middlebr〇〇k7H9液体培养基而重悬， 接着进一步离心以回收细菌细胞。该操作重复三次。洗涤细菌细胞以除去附着至细菌细胞 的结核菌群分泌蛋白质。洗涤操作之后将100 μ L悬浮液应用于MPB64检测的免疫层析测 定装置Capilia? TB (由TAUNS Laboratories，Inc.制造）。结果，该产物显示阴性，证实分 泌的MPB64不存在悬浮液中。
[0045] 实施例1 (加热处理淵度的最伴备件的研究）
[0046] 将参考例1中制备的具有对应于马克法兰标准1的浊度的菌液的光密度调整至在 530nm的吸光度下为0. D.为0. 1，从而制备试验用菌液（细菌计数：相当于IO7CPU)。试验 用菌液进一步用液体培养基稀释，从而制备10倍稀释菌液（细菌计数：相当于IO 6CFU)和 100倍稀释菌液（细菌计数：相当于IO5CFU)。200 μ 1各制备的菌液分散于各塑料管中（核 酸扩增用管）并使用核酸扩增设备用温度可控加热器块加热处理。加热温度设为从35°C 至75°C以5°C间隔的温度。加热处理进行30分钟。在35°C的普通培养温度下加热处理的 样品用作对照。从由此处理的各试样收集100 μ 1等份，并以与参考例1相同的方式应用于 Capiliak ΤΒ(由 TAUNS Laboratories, Inc.制造），从而检测 ΜΡΒ64 的存在。使用 Immno Chromato-Reader(由 Otsuka Electronics Co. ,Ltd.制造）测量读取部（reading area) 的吸光度。
[0047] 结果示于图 1。图 1 中，纵坐标表示Capiliali TB(由 TAUNS Laboratories, Inc.制 造）中显色强度（color intensity)(吸光度）的测量值，横坐标表示加热温度。吸光度与 处理温度之间的关系由实线、虚线和长虚线表示，其中实线为关于试验用菌液（细菌计数： 相当于IO7CPU)的结果，虚线为关于10倍稀释菌液（细菌计数：相当于IO 6CPU)的结果，长 虚线为关于100倍稀释菌液（细菌计数：相当于IO5CPU)的结果。
[0048] 从结果来看，所有试验样品显示在40°C至60°C下吸光度升高，特别是在45°C至 50°C下显著升高。这表示细菌细胞的热处理促进其细胞外MPB64分泌。在35°C的普通培养 条件下处理的对照不显示吸光度的升高，表明仅在室温下或在与其相当的条件下保持样品 不使MPB64被细胞外分泌。另一方面，在比证实了 MPB64分泌的40°C至60°C温度范围高的 温度范围内证实吸光度不升高。这表明，MPB64在等于或高于60°C的温度范围内不分泌。
[0049] 因此，从这些结果证实细菌样品在40°C至60°C下、特别是在45°C至50°C下的加热 处理显著促进细胞外MPB64分泌并显著增加免疫学测定的检出率。
[0050] 实施例2 (加热处理淵度的最伴备件的研究）
[0051] 将参考例1中制备的具有对应于马克法兰标准1的浊度的菌液的光密度调整至在 530nm的吸光度下为0. D.为0. 1，从而制备试验用菌液（细菌计数：相当于IO7CPU)。200 μ 1 各制备的菌液分散于各塑料管中（核酸扩增用管）并使用核酸扩增设备用温度可控加热器 块加热处理。加热温度设为35°C、从40°C至64°C以2°C间隔的13个温度和作为高温范围 的70°C和80°C的2个温度。加热处理进行60分钟。将在35°C的普通培养温度下加热处 理的样品用作对照。从由此处理的各试样收集100 μ 1等份，并以与参考例1相同的方式应 用于'Capilial( TB(由TAUNS Laboratories, Inc.制造），从而检测MPBM的存在。通过目 视观察标记物质在读取部累积的显色强度进行评价。显色强度目视评价为品红色的程度， 分为5级：-(不着色），± (微弱着色），+(明显着色），++(较明显着色），和+++(显著着 色）。评价结果示于表1。
[0052]表 1

【权利要求】
1. 一种结核菌群的检测方法，其包括使结核菌群特异的蛋白质进行免疫学测定，其中 所述蛋白质通过使含有所述结核菌群的生物样品进行加热处理而被细胞外分泌。
2. 根据权利要求1所述的结核菌群的检测方法，其中所述生物样品的所述加热处理在 40°C至60°C下进行。
3. 根据权利要求2所述的结核菌群的检测方法，其中所述生物样品的所述加热处理在 40°C至55°C下进行。
4. 根据权利要求1至3任一项所述的结核菌群的检测方法，其中所述生物样品的所述 加热处理进行至少15分钟。
5. 根据权利要求4所述的结核菌群的检测方法，其中所述生物样品的所述加热处理进 行15分钟以上且2. 5小时以下。
6. 根据权利要求1至5任一项所述的结核菌群的检测方法，其中所述生物样品为选自 由痰、支气管分泌物、胸膜积液、胃液、血液、脊髓液、尿液、排泄物、支气管灌洗液和收集自 支气管或肺的组织组成的组的至少一种样品。
7. 根据权利要求6所述的结核菌群的检测方法，其中所述生物样品为痰。
8. 根据权利要求1至7任一项所述的结核菌群的检测方法，其中所述生物样品在进行 所述加热处理之前用样品处理剂溶解。
9. 根据权利要求8所述的结核菌群的检测方法，其中用样品处理剂溶解的所述生物样 品在进行所述加热处理之前分散或溶于溶剂中。
10. 根据权利要求1至9任一项所述的结核菌群的检测方法，其中所述免疫学测定为使 用抗所述结核菌群特异的分泌蛋白质的第一抗体和第二抗体的夹心免疫学测定。
11. 根据权利要求10所述的结核菌群的检测方法，其中所述免疫学测定为免疫层析测 定。
12. 根据权利要求10所述的结核菌群的检测方法，其中所述免疫学测定为ELISA。
13. 根据权利要求10至12任一项所述的结核菌群的检测方法，其中所述结核菌群特异 的分泌蛋白质为MPB64或MPT64。
14. 一种结核菌群检测用试剂盒，其至少包括使含有所述结核菌群的生物样品进行加 热处理的处理容器，和用于检测通过所述加热处理分泌的结核菌群特异的分泌蛋白质的免 疫学测定装置。
15. 根据权利要求14所述的结核菌群检测用试剂盒，其进一步包括样品处理剂和/或 溶剂。
16. 根据权利要求14或15所述的结核菌群检测用试剂盒，其中所述免疫学测定为使用 抗所述结核菌群特异的分泌蛋白质的第一抗体和第二抗体的夹心免疫学测定。
17. 根据权利要求14或15所述的结核菌群检测用试剂盒，其中所述免疫学测定装置为 免疫层析测定装置。
18. 根据权利要求14或15所述的结核菌群检测用试剂盒，其中所述免疫学测定装置为 ELISA测定装置。
19. 根据权利要求14至18任一项所述的结核菌群检测用试剂盒，其中所述结核菌群特 异的分泌蛋白质为MPB64或MPT64。
20. -种用于细胞外分泌结核菌群特异的蛋白质的方法，其包括使含有所述结核菌群 的生物样品进行加热处理。
【文档编号】G01N33/569GK104246505SQ201380018968
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年4月4日 优先权日:2012年4月5日
【发明者】野中浦雄, 北川俊之 申请人:株式会社比尔生命, 有限会社阿诺泰克