一种生物结皮中荒漠藻生物量的测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物结皮中荒漠藻生物量的测定方法，涉及藻类生物学领域。该方法包括采样、过筛、研磨、浸提和荒漠藻生物量测定步骤。其中浸提步骤中，采用超声波萃取或微波萃取或超声-微波协同萃取。本发明采用超声波或微波辅助测定生物结皮中荒漠藻生物量的方法不仅大大缩短了测定的时间，而且叶绿素的得率较高，并减少了浸提过程中叶绿素的氧化分解，能更加准确、客观的反映荒漠藻的生物量。
【专利说明】一种生物结皮中荒漠藻生物量的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及藻类生物学领域，尤其涉及的是一种生物结皮中荒漠藻生物量的测定方法。
【背景技术】
[0002]荒漠藻也称单细胞藻类，是指那些形态微小，在显微镜下才能辨别其结构的微小藻类的总称。它不是一个分类学的名词，而是一类能进行光合作用的微生物，其中还包括蓝细菌(Cranobacteria)。它们在自然界的分布广泛,无论是在干燥的陆地,还是淡水湖泊和海洋等水域，都能发现荒漠藻的存在。它们生长周期短、繁殖快、易培养，营养全面，富含多种色素及其他高附加值生物活性物质，已经广泛应用于食品、医药及保健品等行业。此外，荒漠藻还是干旱、半干旱生态系统的先锋植物和开拓者，许多藻类可以分泌胞外多糖，并与丝状藻绞结在一起，粘结沙粒，形成藻结皮，保持土壤水分，增加土壤养分，起到重要的生态作用。但是，因为其形态微小，且胁迫条件下的生物量较低，不易测定，所以，急需一种测定结果稳定，且测定方法简单易行的藻类生物量测定方法。
[0003]藻类生物量可以直接用藻类叶绿素a含量来反映，超声波或微波辅助提取叶绿素a就是一个很好的方法。
[0004]超声波辅助提取法已经广泛应用于植物活性物质的提取，其主要是利用超声波的空化效应，使溶剂能够快速渗透到细胞内部，溶解其中的化学成分；同时，超声波的机械振动也促进了细胞内物质的扩散，加速了其溶解速度，且此过程是一个物理过程，全过程中无化学反应，所以浸提物的化学结构并不会发生变化。超声波提取能有效缩短浸提时间，提高浸提得率，为叶绿素的提取提供了一种快速、有效的新方法。
[0005]微波萃取法是根据不同物质对微波吸收能力的不同，将物质选择性的加热，降低了物质的介电常数，使得被萃取的物质向介电常数较小的萃取剂中扩散，从而使萃取得率提高。微波辅助萃取技术具有使用设备简单、快速高效、污染较小的特点。
[0006]虽然有机溶剂浸提法可以提取叶绿素a，但是需要过夜浸提，耗时较长，且提取的效率不高，并不能客观的反映荒漠藻生物量。采用超声波或微波辅助提取叶绿素a，大大缩短了提取时间，提高了叶绿素a得率，能更加准确、客观的反映荒漠藻的生物量。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在测定荒漠藻中存在的不足，提供了一种生物结皮中荒漠藻生物量的测定方法。
[0008]本发明的技术方案如下:
[0009]一种生物结皮中荒漠藻生物量的测定方法，其步骤如下:
[0010](I)采样:针对半干旱、干旱地区的沙地生态系统，选取生物结皮良好的典型沙丘，用经酒精消毒的环刀取样，封口塑料袋收集样品，并迅速运至实验室；
[0011](2)过筛:对采集的样品过1_筛，除去枯枝落叶及苔藓类植物；[0012](3)研磨:取过筛后的样品于研钵中充分研磨，使藻细胞破碎，利于叶绿素浸提；
[0013](4)浸提:在研磨后的样品中加入N-N-二甲基甲酰胺，充分振荡，然后超声波萃取或微波萃取或超声_微波协同萃取；
[0014](5)荒漠藻生物量测定:将浸提处理后的样品于5000r/min离心lOmin，取上清液，于分光光度计664nm、647nm、625nm和603nm下测定吸光度，根据公式ug/g = (12.92 X A664-2.16ΧΑ647+1.44ΧΑ625-4.91 XA603) X 5ml/g 计算叶绿素含量。
[0015]所述的测定方法，过筛后的样品和加入的N-N-甲基甲酰胺的比为1: 5g/ml。
[0016]所述的超声波萃取条件为100?500W,处理20?IOOmin ;微波萃取条件为100?700W,处理I?IOmin ;超声-微波协同萃取条件为超声波100?500W，处理10?40min，然后再微波100?700W，处理I?5min。
[0017]本发明的有益效果为:(I)采用超声波或微波辅助测定生物结皮中荒漠藻生物量的方法大大缩短了测定的时间。传统的有机溶剂浸提法往往需要相当长的浸提时间，甚至需过夜浸提，而此方法节省时间，仅需一小时左右甚至几分钟即可完成测定。(2)叶绿素的得率较高，且减少了浸提过程中叶绿素的氧化分解。传统的有机溶剂浸提叶绿素的得率不高，且浸提的时间较长，叶绿素的氧化分解严重，而超声波或微波辅助测定生物结皮中荒漠藻生物量的方法，提取的时间短，叶绿素得率高，有效的减少了叶绿素的氧化分解，使得生物量的测定更加准确、客观。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为不同测定方法对藻类生物量的影响。
【具体实施方式】
[0019]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0020]实施例1
[0021](I)采样:针对半干旱、干旱地区的沙地生态系统，选取生物结皮良好的典型沙丘，用经酒精消毒的环刀取样，封口塑料袋收集样品，并迅速运至实验室。
[0022](2)样品处理:将采集的样品过1_筛，除去枯枝落叶及苔藓类植物,避免其中的叶绿素对后续实验产生影响。取过筛后的2.0Og样品于研钵中进行充分研磨，使藻细胞破碎，利于叶绿素的浸提。
[0023](3)浸提:取IOml N_N_ 二甲基甲酰胺(DMF)，加入研磨后的样品中，充分振荡，利用超声波辅助萃取，400W，处理60min。
[0024](4)荒漠藻生物量测定:将浸提后的样品于5000r/min离心lOmin，取上清液，于分光光度计664nm、647nm、625nm和603nm下测定吸光度,根据公式ug/g=(12.92XΑ664_2.16XA647+1.44ΧΑ625-4.91 XA603) X 5m/g 计算叶绿素 a 含量。
[0025]实施例2
[0026](I)采样:针对半干旱、干旱地区的沙地生态系统，选取生物结皮良好的典型沙丘，用经酒精消毒的环刀取样，封口塑料袋收集样品，并迅速运至实验室。
[0027](2)样品处理:将采集的样品过Imm筛，除去枯枝落叶及苔藓类植物，避免其中的叶绿素对后续实验产生影响。取过筛后的2.0Og样品于研钵中进行充分研磨，使藻细胞破碎，利于叶绿素的浸提。
[0028](3)浸提:取IOml N_N_二甲基甲酰胺((DMF)，加入研磨后的样品中，充分振荡，利用微波萃取，300W,处理5min。
[0029](4)荒漠藻生物量测定:将浸提后的样品于5000r/min离心lOmin，取上清液，于分光光度计664nm、647nm、625nm和603nm下测定吸光度,根据公式ug/g=(12.92XΑ664_2.16XA647+1.44ΧΑ625-4.91 XA603) X 5ml/g 计算叶绿素 a 含量。
[0030]实施例3
[0031](I)采样:针对半干旱、干旱地区的沙地生态系统，选取生物结皮良好的典型沙丘，用经酒精消毒的环刀取样，封口塑料袋收集样品，并迅速运至实验室。
[0032](2)样品处理:将采集的样品过1_筛，除去枯枝落叶及苔藓类植物,避免其中的叶绿素对后续实验产生影响。取过筛后的2.0Og样品于研钵中进行充分研磨，使藻细胞破碎，利于叶绿素的浸提。
[0033](3)浸提:取IOmlN-N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入研磨后的样品中，充分振荡，利用超声波萃取，400W，处理30min，取出样品，继续微波辅助萃取，300W,处理4min。
[0034](4)荒漠藻生物量测定:将浸提后的样品于5000r/min离心lOmin，取上清液，于分光光度计664nm、647nm、625nm和603nm下测定吸光度,根据公式ug/g=(12.92XΑ664_2.16XA647+1.44ΧΑ625-4.91 XA603) X 5ml/g 计算叶绿素 a 含量。
[0035]实施例4
[0036](I)采样:针对半干旱、干旱地区的沙地生态系统，选取生物结皮良好的典型沙丘，用经酒精消毒的环刀取样，封口塑料袋收集样品，并迅速运至实验室。
[0037](2)样品处理:将采集的样品过Imm筛，除去枯枝落叶及苔藓类植物，避免其中的叶绿素对后续实验产生影响。取过筛后的2.0Og样品于研钵中进行充分研磨，使藻细胞破碎，利于叶绿素的浸提。
[0038](3)浸提:取IOmlN-N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入研磨后的样品中，充分振荡，将振荡后的样品置于暗室中，过夜浸提(14?16h)。
[0039](4)荒漠藻生物量测定:将浸提后的样品于5000r/min离心lOmin，取上清液，于分光光度计664nm、647nm、625nm和603nm下测定吸光度,根据公式ug/g=(12.92XΑ664_2.16XA647+1.44ΧΑ625-4.91 XA603) X 5ml/g 计算叶绿素 a 含量。
[0040]实施例5
[0041]利用超声波或微波辅助对生物结皮中荒漠藻的生物量进行测定，实施例1?3荒漠藻生物量测定结果如图1所示。
[0042]由图1可知，对于同一样品，采用不同的叶绿素萃取方法对其藻类生物量进行测定，得到不同的结果，冷浸法的耗时最长，需隔夜浸提，但藻类生物量仍为最低，为19.68 μ g/g,超声-微波协同萃取法耗时最短，约30min,但藻类的生物量却最高，为24.05yg/g，最接近此样品中的藻类真实生物量。
[0043]传统有机溶剂浸提测定生物结皮中荒漠藻的生物量的方法，叶绿素得率不高，且耗时较长，甚至需要过夜浸提，长时间的室温浸提使叶绿素的氧化分解增加，不能准确、客观的反映荒漠藻生物量。而采用超声波或微波辅助对生物结皮中荒漠藻的生物量进行测定，可以大大的缩短叶绿素浸提时间，提高得率，且超声波或微波辅助浸提，设备简单，适用范围广，不会破坏叶绿素的结构，也不会加速叶绿素的氧化分解，使其能更加准确、客观的反映荒漠藻生物量。
[0044]应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【权利要求】
1.一种生物结皮中荒漠藻生物量的测定方法，其特征是，其步骤如下: (1)采样:针对半干旱、干旱地区的沙地生态系统，选取生物结皮良好的典型沙丘，用经酒精消毒的环刀取样，封口塑料袋收集样品，并迅速运至实验室； (2)过筛:对采集的样品过Imm筛，除去枯枝落叶及苔藓类植物； (3)研磨:取过筛后的样品于研钵中充分研磨，使藻细胞破碎，利于叶绿素浸提； (4)浸提:在研磨后的样品中加入N-N-二甲基甲酰胺，充分振荡，然后超声波萃取或微波萃取或超声-微波协同萃取； (5)荒漠藻生物量测定:将浸提处理后的样品于5000r/min离心lOmin，取上清液，于分光光度计664nm、647nm、625nm和603nm下测定吸光度,根据公式ug/g=(12.92XΑ664_2.16XA647+1.44ΧΑ625-4.91 XA603) X 5ml/g 计算叶绿素含量。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征是，过筛后的样品和加入的N-N-二甲基甲酰胺的比为1: 5g/ml。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征是，所述超声波萃取条件为100?500W，处理20?IOOmin ;微波萃取条件为100?700W,处理I?IOmin ;超声-微波协同萃取条件为超声波100?500W，处理10?40min，然后再微波100?700W，处理I?5min。
【文档编号】G01N21/31GK103837486SQ201410084285
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月10日 优先权日:2014年3月10日
【发明者】王晓江, 季祥, 张文军, 苗小丽, 武永智, 王少昆, 李爱平, 洪光宇 申请人:内蒙古自治区林业科学研究院