一种中华鳖胚胎期性腺的连续石蜡切片制作方法及其在性别判定中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种中华鳖胚胎期性腺的连续石蜡切片制作方法及其在性别判定中的应用，包括①样品固定、②性腺染色、③脱水与透明程序、④透蜡和包埋、⑤切片和展片、⑥染色与封片，其特征在于：在所述步骤②中，对性腺先进行染色；在所述步骤⑤中，采用水浴和高温石蜡进行两次展片，与现有技术相比，本发明的优点在于：性腺在进行包埋处理前先进行染色，多个个体的性腺同时包埋在一个蜡块中，并通过连续组织切片的形式进行判定，保证了结果的准确性，本发明的操作简单，即可以快速准确地对中华鳖胚胎期性别比例进行统计，便于推广应用。
【专利说明】一种中华鳖胚胎期性腺的连续石蜡切片制作方法及其在性
别判定中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种连续石蜡切片的制作方法及其应用，尤其涉及一种中华鳖胚胎期性腺的石蜡切片制作方法以及在胚胎性别判定中的应用。
【背景技术】
[0002]中华鳘(Pelodiscus sinensis),又称甲鱼、王八、水鱼、元鱼、团鱼、脚鱼和老鳘，隶属脊椎动物亚门(Vertebtata)、爬行纲(Reptilia)、龟鳘目(Chelonia)、鳘科(Trionychidae),广泛分布于我国除宁夏、新疆、青海及西藏外的其它各省，以长江流域和华南地区为多见，是我国养殖最广泛的水生爬行动物，具有重要的经济和药用价值；国外分布于日本、朝鲜和越南。而关于爬行动物的胚胎发育，不同孵化条件和激素处理会影响中华鳖的性腺分化和发育。由于中华鳖属变温动物，实验证实，适于鳖胚胎发育的温度范围是(23?35) V，最适宜的温度范围是(31?33) V，低于22°C胚胎发育停止，高于34°C孵化率降低，37°C为致死温度，在适于鳖胚发育的温度范围内，随孵化温度的升高发育速度加快，孵化周期缩短。有关研究表明，在(32±0.5) °C温度下孵化鳖卵，自孵化开始，至最初的原始生殖细胞开始迁移、生殖嵴形成、性腺开始分化、精巢或卵巢形成，分别需要孵化至第3、5、16和22天。在胚胎期、出壳7天的稚鳖和I龄幼鳖的精巢与卵巢，外形上难以区别，均呈短细管状，只有从生殖导管与生殖腺的位置关系，才能区分精巢和卵巢。
[0003]从以上分析可知，在不经过长时间饲养的前提下，通过解剖学方法进行中华鳖性别判定存在着较大困难。因此，本发明开发了一种适合于中华鳖胚胎期性别判定的连续切片技术。通过抽取一定的样本数，该技术快速准确的判定胚胎期的性别，而不需要在孵化后进行长期的饲养。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种简单易行的中华鳖胚胎期性腺的连续石蜡切片制作方法。
[0005]本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种使用该连续石蜡切片方法在胚胎性别判定中的应用。
[0006]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种中华鳖胚胎期性腺的连续石蜡切片制作方法，包括①样品固定、②性腺染色、③脱水与透明程序、④透蜡和包埋、⑤切片和展片、⑥染色与封片，其特征在于:在所述步骤②中，对性腺先进行染色；在所述步骤⑤中，分别采用水浴和高温石蜡进行两次展片，先加入0.3mL?1.0mL40°C?50°C的去离子水，切片开始在水膜张力的作用下伸展，在第一次展片结束后吸干水分放入65°C?85°C的烘箱中，在高温环境下石蜡溶解，切片在液态石蜡的环境中进行第二次展片。该高温环境指65 V?85 °C的环境。
[0007]所述步骤①?⑥的具体处理如下:[0008]①样品固定:收集中华鳖胚胎发育中后期胚胎的性腺-中肾-肾上腺的复合体，将取出的复合体立即投入到固定液中固定，固定0.5h~24h之后转移到50~80%酒精溶液中保存；
[0009]②性腺染色:将步骤①中收集到的中华鳖性腺先进行伊红染色处理，伊红染色时间为2min~4min，伊红染色结束后用50%~95%酒精冲洗干净；
[0010]③脱水与透明程序:将步骤②的中华鳖性腺用梯度乙醇脱水；先后采用80%乙醇浸泡Imin~60min、90%乙醇浸泡30s~SOmirulOO1^乙醇浸泡Imin~60min ;然后用体积比为1:1的无水乙醇:二甲苯过渡处理20s~40min,再用二甲苯浸泡处理20s~40min,使之透明；
[0011]④透腊和包埋:用体积比为1:1的二甲苯:石腊过渡处理30s~IOmin,56°C~62°C熔点的石蜡，65~85°C透蜡20min~40min，透蜡2次；将脱水透蜡后的性腺组织进行包埋；
[0012]⑤切片和展片:用切片机做连续切片，切片厚度控制在4μπι~15 μ m，连续切片按照顺序贴于载玻片上，裱片后经过水浴和石蜡两次展片把组织展平。该连续切片的步骤具体为:连续切片按照顺序先摆放整齐，之后在载玻片上按照次序进行裱片；在载玻片上加入40°C~50°C的去离子水进行水浴展片，之后吸干水分，放入65°C~85°C的烘箱中，进行第二次石蜡展片；经过两次展片，石蜡化为液体时对组织的空间阻碍消失，因此二次展片的效果更好。
[0013]⑥染色与封片:染色采用伊红-苏木精复染方法，其中用苏木精染色IOs~5min，伊红染色5s~5min ;然后用中性树胶封片。
[0014]在进行所述步骤⑥染色之前还进行脱蜡复水，其中脱蜡步骤具体为:先用二甲苯浸泡Imin~15min,再用体积比为1:1的无水乙醇:二甲苯过渡处理Imin~3min ;复水步骤具体为:先后采用100%乙醇浸泡30s~30min、90%乙醇浸泡30s~30min、70%乙醇浸泡30s~30min、50%乙醇浸泡30s~30min、最后用流水冲洗。
[0015]其中，所述的苏木精染液配方为:lg苏木精溶于IOOmL无水乙醇中，20g明矾溶于200mL蒸馏水中，两液混合，加热沸腾3min，稍冷却加入0.51g氧化汞，溶解后即得到苏木精染液。
[0016]所述的伊红染液为1%的伊红溶液，用70%乙醇溶解。即该伊红染液配方可以为:Ig伊红溶于99mL70%乙醇中。
[0017]所述步骤①固定液可以选取4%的多聚甲醛、福尔马林或波恩氏液的一种。
[0018]本发明还提供一种使用该连续石蜡切片方法在胚胎性别判定中的应用。
[0019]通过观察按照上述制备方法制得的连续石蜡切片，该胚胎性别判定的判断标准为:雌性中华鳖性腺皮质层发育明显，外形略显不规则，可见大量的空泡状结构；雄性中华鳖性腺髓质层发育明显，外形饱满而规则，内部曲细精管发育可见大量连续成带状的结构。
[0020]与现有技术相比，本发明的优点在于:
[0021]1、由于胚胎性腺颜色略透明，在组织透明处理后往往不易观察。在进行包埋处理前先进行染色，便于后期的操作和观察，不易丢失样品；
[0022] 2、多个个体的性腺同时包埋在一个蜡块中，并通过连续组织切片的形式进行判定，保证了结果的准确和高效；[0023]3、由于连续组织切片中各个切片的位置受到石蜡位置的影响而不能全部展开，在用水进行展片后再用石蜡高温进行展片，能使组织周围的石蜡熔化，解除了石蜡对组织的空间阻力，组织受到的空间束缚也同时被解除，确保了切片制作的质量；
[0024]4、在胚胎发育的中后期(孵化积温达到17000度时以后)，即可对孵化的群体进行性别比例判定，而不需孵化后长期饲养，降低了实验的成本且缩短了实验的周期；
[0025]5、本发明操作简单，毋需增加专门的仪器，即可以快速准确地对中华鳖胚胎期性别比例进行统计，便于推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为本发明实施例1中入孵24天时雄性性腺切片；
[0027]图2为本发明实施例1中入孵24天时雌性性腺切片；
[0028]图3为本发明实施例2中入孵31天时雄性性腺切片；[0029]图4为本发明实施例2中入孵31天时雌性性腺切片；
[0030]图5为本发明实施例3中出壳I天时雄性性腺切片；
[0031]图6为本发明实施例3中出壳I天时雌性性腺切片。
【具体实施方式】
[0032]以下通过结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
[0033]首先配制苏木精染液、伊红染液和福尔马林、波恩氏固定液。
[0034]苏木精染液:先称取钾明矾20g溶于200mL蒸馏水中，边加热边搅拌，再称取苏木精1.0g溶于IOmL无水乙醇，边加热边搅拌，待钾明矾和苏木素溶解后，混和二溶液，加热至沸腾(89°C~91°C )，然后称取0.51g HgO缓缓加入沸腾的混合液中，边加入边搅拌使溶解，以防产生大量气泡，最后待溶解后使其稍降温置于冷水中，有少许HgO结晶，使用前滤纸过滤，避光保存。
[0035]伊红酒精染液:将Ig伊红溶于99mL70%的乙醇中即得到伊红染液。
[0036]福尔马林溶液:量取甲醛lOOmL，加入磷酸二氢钠6.5g，溶解后加蒸馏水补足1000mL0
[0037]波恩氏液:苦味酸饱和水溶液液75mL，甲醛(37%~40% ) 25mL,冰醋酸5mL，混合。
[0038]4%多聚甲醛:按IOOmL配比为:多聚甲醛4g，0.1M PBS (pH=7.4) 80mL，加热至60°C水浴溶解，边搅拌边滴加IM Na0H2mL溶液至澄清，之后添加IM HC12mL左右，调节pH值后(?!1=7.2~7.4)，定容为lOOmL。(现用现配以防多聚甲醛聚合)
[0039]另外，本发明适合的性别比判定时间在孵化积温达到17000度时以后，也就是在正常孵化温度(31~33) °〇下，入孵23天之后。
[0040]实施例1
[0041]①样品固定:在入孵24天后收集孵化温度为33°C中华鳖胚胎100枚，剪开腹腔后取出性腺-中肾-肾上腺的复合体，需要注意的是中华鳖两侧性腺只需要取出一侧即可，将取出的复合体立即投入到4%的多聚甲醛固定液中固定，固定3h之后转移到70%酒精溶液中保存；
[0042]②性腺染色:将步骤①中收集到的中华鳖性腺先进行伊红染色处理，伊红染色时间为2min，伊红染色结束后用80%酒精冲洗干净；
[0043]③脱水与透明程序:将步骤②的中华鳖性腺用梯度乙醇脱水；先后采用80%乙醇浸泡20min、90%乙醇浸泡20min、100%乙醇浸泡IOmin ;然后用体积比为1:1的无水乙醇:二甲苯过渡处理IOmin,再用二甲苯浸泡处理IOmin,使之透明；
[0044]④透蜡和包埋:用体积比为1:1的二甲苯:石蜡过渡处理10min，60°C熔点的石蜡，65°C透蜡30min，透蜡2次；将脱水透蜡后的性腺组织进行包埋，每个蜡块包埋5个性腺；
[0045]⑤切片和展片:用切片机做连续切片，切片厚度控制在10 μ m，连续切片按照顺序贴于载玻片上，裱片后经过水浴和石蜡两次展片把组织展平。该连续切片的步骤具体为:连续切片按照顺序先摆放整齐，之后在载玻片上按照次序进行裱片；在载玻片上加入1.0mL50°C的去离子水进行水浴展片，之后吸干水分，放入85°C的烘箱中，进行第二次石蜡展片；
[0046]⑥脱蜡、复水、染色与封片:脱蜡步骤具体为:先用二甲苯浸泡3min，再用体积比为1:1的无水乙醇:二甲苯过渡处理3min ;复水步骤具体为:先后采用100%乙醇浸泡IOmin,90%乙醇浸泡10min、70%乙醇浸泡20min、50%乙醇浸泡20min、最后用流水冲洗；染色采用伊红-苏木精复染方法，其中用苏木精染色1.5min，伊红染色IOs ;然后用中性树胶封片，在载玻片上均匀滴加3滴树胶，轻压盖玻片赶出树胶内气泡。应注意压片时用力要均匀，不宜用力过大，以免压坏盖玻片或使样品移位。
[0047]⑦观察、拍照与统计:待样片风干后用刀片刮去多余的树胶进行观察和根据中华鳖雌雄性腺的特点，分别进行个体统计。在普通光学显微镜下观察，放大倍数为100倍。在统计的过程中，左右手分别拿一个血细胞计数器，左手记录雄性样本数，右手记录雌性样本数。在载玻片上自上而下观察每排性腺组织的变化，而统计的判断标准为:雌性中华鳖性腺皮质层发育明显，外形略显不规则，可见大量的空泡状结构；雄性中华鳖性腺髓质层发育明显，外形饱满而规则，内部曲细精管发育可见大量连续成带状的结构。
[0048]该性腺皮质层石蜡切片清晰、对比度大、观察方便，当找到所包埋样品数量时即可停止，然后进入下一个蜡块连续切片的统计。采用该方法可以快速准确地对中华鳖胚胎期性别判定，同时对其比例进行统计。
[0049]⑧观察结果:表明在孵化温度为33°C时，雄性的比例为56%，雌性的比例为44%。
[0050]实施例2
[0051]①样品固定:在入孵31天后收集孵化温度为32°C中华鳖胚胎100枚，剪开腹腔后取出性腺-中肾-肾上腺的复合体，需要注意的是中华鳖两侧性腺只需要取出一侧即可，将取出的复合体立即投入到福尔马林固定液中固定，固定24h之后转移到80%酒精溶液中保存；
[0052]②性腺染色:将步骤①中收集到的中华鳖性腺先进行伊红染色处理，伊红染色时间为2min，伊红染色结束后用70%酒精冲洗干净；
[0053]③脱水与透明程序:将步骤②的中华鳖性腺用梯度乙醇脱水；先后采用80%乙醇浸泡40min、90%乙醇浸泡30min、100%乙醇浸泡20min ;然后用体积比为1:1的无水乙醇:二甲苯过渡处理20min,再用二甲苯浸泡处理20min,使之透明；
[0054]④透蜡和包埋:用体积比为1:1的二甲苯:石蜡过渡处理10min，58°C熔点的石蜡，70°C透蜡20min，透蜡2次；将脱水透蜡后的性腺组织进行包埋，每个蜡块包埋5个性腺；[0055]⑤切片和展片:用切片机做连续切片，切片厚度控制在12 μ m，连续切片按照顺序贴于载玻片上，裱片后经过水浴和石蜡两次展片把组织展平；该连续切片的步骤具体为:连续切片按照顺序先摆放整齐，之后在载玻片上按照次序进行裱片；在载玻片上加入
1.0mL40°C的去离子水进行水浴展片，之后吸干水分，放入80°C的烘箱中，进行第二次石蜡展片；
[0056]⑥脱蜡、复水、染色与封片:脱蜡步骤具体为:先用二甲苯浸泡5min，再用体积比为1:1的无水乙醇:二甲苯过渡处理2min ;复水步骤具体为:先后采用100%乙醇浸泡20min、90%乙醇浸泡20min、70%乙醇浸泡30min、50%乙醇浸泡30min、最后用流水冲洗；染色采用伊红-苏木精复染方法，其中用苏木精染色2min，伊红染色Imin ;然后用中性树胶封片，在载玻片上均匀滴加3滴树胶，轻压盖玻片赶出树胶内气泡。应注意压片时用力要均匀，不宜用力过大，以免压坏盖玻片或使样品移位。
[0057]⑦观察、拍照与统计:待样片风干后用刀片刮去多余的树胶进行观察和根据中华鳖雌雄性腺的特点，分别进行个体统计。在普通光学显微镜下观察，放大倍数为100倍。在统计的过程中，左右手分别拿一个血细胞计数器，左手记录雄性样本数，右手记录雌性样本数。在载玻片上自上而下观察每排性腺组织的变化，采用该方法可以快速准确地对中华鳖胚胎期性别进行判定，同时对其比例进行统计，而统计的判断标准为如同实施I采用的标准。
[0058]⑧观察结果:表明在孵化温度为32°C时，雄性的比例为55%，雌性的比例为45%。
[0059]实施例3
[0060]①样品固定:在出壳后I天收集孵化温度为31°C中华鳖胚胎100枚，剪开腹腔后取出性腺-中肾-肾上腺的复合体，需要注意的是中华鳖两侧性腺只需要取出一侧即可，将取出的复合体立即投入到波恩氏固定液中固定，固定12h之后转移到75%酒精溶液中保存；
[0061]②性腺染色:将步骤①中收集到的中华鳖性腺先进行伊红染色处理，伊红染色时间为3min，伊红染色结束后用90%酒精冲洗干净；
[0062]③脱水与透明程序:将步骤②的中华鳖性腺用梯度乙醇脱水；先后采用80%乙醇浸泡50min、90%乙醇浸泡15min、100%乙醇浸泡30min ;然后用体积比为1:1的无水乙醇:二甲苯过渡处理30min,再用二甲苯浸泡处理30min,使之透明；
[0063]④透蜡和包埋:用体积比为1:1的二甲苯:石蜡过渡处理5min，62°C熔点的石蜡，85°C透蜡40min，透蜡2次；将脱水透蜡后的性腺组织进行包埋；
[0064]⑤切片和展片:用切片机做连续切片，切片厚度控制在8 μ m，连续切片按照顺序贴于载玻片上，裱片后经过水浴和石蜡两次展片把组织展平；该连续切片的步骤具体为:连续切片按照顺序先摆放整齐，之后在载玻片上按照次序进行裱片；在载玻片上加入
0.8mL45°C的去离子水进行水浴展片，之后吸干水分，放入75°C的烘箱中，进行第二次石蜡展片；
[0065]⑥脱蜡、复水、染色与封片:脱蜡步骤具体为:先用二甲苯浸泡6min，再用体积比为1:1的无水乙醇:二甲苯过渡处理2.5min ;复水步骤具体为:先后采用100%乙醇浸泡15min、90%乙醇浸泡15min、70%乙醇浸泡10min、50%乙醇浸泡lOmin、最后用流水冲洗；染色采用伊红-苏木精复染方法，其中用苏木精染色4min，伊红染色2min ;然后用中性树胶封片，在载玻片上均匀滴加3滴树胶，轻压盖玻片赶出树胶内气泡。应注意压片时用力要均匀，不宜用力过大，以免压坏盖玻片或使样品移位。
[0066]⑦观察、拍照与统计:待样片风干后用刀片刮去多余的树胶进行观察和根据中华鳖雌雄性腺的特点，分别进行个体统计。在普通光学显微镜下观察，放大倍数为100倍。在统计的过程中，左右手分别拿一个血细胞计数器，左手记录雄性样本数，右手记录雌性样本数。在载玻片上自上而下观察每排性腺组织的变化，采用该方法可以快速准确地对中华鳖胚胎期性别进行判定，同时对其比例进行统计，而统计的判断标准为如同实施I采用的标准。
[0067]⑧观察结果:表明在孵化温度为31 °C时，雄性的比例为53%，雌性的比例为47%。
【权利要求】
1.一种中华鳖胚胎期性腺的连续石蜡切片制作方法，包括①样品固定、②性腺染色、③脱水与透明程序、④透蜡和包埋、⑤切片和展片、⑥染色与封片，其特征在于:在所述步骤②中，对性腺先进行染色；在所述步骤⑤中，分别采用水浴和高温石蜡进行两次展片，先加入0.3mL?1.0mL40°C?50°C的去离子水，切片开始在水膜张力的作用下伸展，在第一次展片结束后吸干水分后放入65°C?85°C的烘箱中，在高温环境下石蜡溶解，切片在液态石蜡的环境中进行第二次展片。
2.根据权利要求1所述的中华鳖胚胎期性腺的连续石蜡切片制作方法，其特征在于:所述步骤①?⑥的具体处理如下: ①样品固定:收集中华鳖胚胎发育中后期胚胎的性腺-中肾-肾上腺的复合体，将取出的复合体立即投入到固定液中固定，固定0.5h?24h之后转移到50?80%酒精溶液中保存； ②性腺染色:将步骤①中收集到的中华鳖性腺先进行伊红染色处理，伊红染色时间为2min?4min，伊红染色结束后用50%?95%酒精冲洗干净； ③脱水与透明程序:将步骤②的中华鳖性腺用梯度乙醇脱水；先后采用80%乙醇浸泡Imin?60min、90%乙醇浸泡30s?30min、100%乙醇浸泡Imin?60min ;然后用体积比为1:1的无水乙醇:二甲苯过渡处理20s?40min,再用二甲苯浸泡处理20s?40min,使之透明； ④透蜡和包埋:用体积比为1:1的二甲苯:石蜡过渡处理30s?10min，56°C?62°C熔点的石蜡，65?85°C透蜡20min?40min，透蜡2次；将脱水透蜡后的性腺组织进行包埋； ⑤切片和展片:用切片机做连续切片，切片厚度控制在4μπι?15μ m，连续切片按照顺序贴于载玻片上，裱片后经过水浴和石蜡两次展片把组织展平； ⑥染色与封片:染色采用伊红-苏木精复染方法，其中用苏木精染色IOs?5min，伊红染色5s?5min ;然后用中性树胶封片。
3.根据权利要求1所述的中华鳖胚胎期性腺的连续石蜡切片制作方法，其特征在于:在进行所述步骤⑥染色之前还进行脱蜡复水，其中脱蜡步骤具体为:先用二甲苯浸泡Imin?15min,再用体积比为1:1的无水乙醇:二甲苯过渡处理Imin?3min ;复水步骤具体为:先后采用100%乙醇浸泡30s?30min、90%乙醇浸泡30s?30min、70%乙醇浸泡30s?30min、50%乙醇浸泡30s?30min、最后用流水冲洗。
4.根据权利要求2所述的中华鳖胚胎期性腺的连续石蜡切片制作方法，其特征在于:所述的苏木精染液配方为:lg苏木精溶于IOOmL无水乙醇中，20g明矾溶于200mL蒸馏水中，两液混合，加热沸腾3min，稍冷却加入0.51g氧化汞，溶解后即得到苏木精染液。
5.根据权利要求2所述的中华鳖胚胎期性腺的连续石蜡切片制作方法，其特征在于:所述的伊红染液为I %的伊红溶液，用70%乙醇溶解。
6.根据权利要求2所述的中华鳖胚胎期性腺的连续石蜡切片制作方法，其特征在于:所述步骤①固定液为4%的多聚甲醛、福尔马林或波恩氏液。
7.一种使用如权利要求1所述的制作方法在性别判定中的应用。
【文档编号】G01N1/28GK103940647SQ201410132534
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】王伟, 钱国英, 李彩燕, 宋伟, 汪财生, 尹尚军, 朴龙斗 申请人:浙江万里学院