一种快速检测樟芝无性孢子存活率的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测樟芝无性孢子存活率的方法，属于生物工程领域。该方法可用于检测樟芝孢子低温保藏样品、樟芝接种物（孢子悬浮液）及樟芝孢子悬浮液诱变物中樟芝孢子的活性（存活率）或致死率。该方法可用流式细胞仪（BD）或细胞活力分析仪（NC3000，Chemometec）进行检测。与传统的平板涂布法检测存活率法相比，该方法更为快捷、高效；与传统的孢子萌发率检测法相比，该方法更为准确、快捷。
【专利说明】一种快速检测樟芝无性孢子存活率的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种快速检测樟芝无性孢子存活率的方法。
【背景技术】
[0002]樟芝(An trodi a cinnamomea ),又名牛樟芝或牛樟燕，为台湾特有的一种药用真菌，素有台湾“森林红宝石”之美誉。长期以来，樟芝作为传统药方被台湾民间用于解酒保肝，治疗肝痛、肝癌、食物中毒、腹痛、腹泻、炎症及皮肤瘙痒等，疗效显著。迄今为止，人们已从樟芝子实体及发酵物中分离得到70多种活性物质，包括多糖、二萜类、三萜类、留体类及苯环衍生物等，其药用价值远高于灵芝、人参、冬虫夏草等传统药材，是名符其实的药材王中之王。由于樟芝强烈的寄主专一性、自然界数量稀少及生长缓慢的特点使得樟芝长期供不应求，市场价格极高，被称为世界上最昂贵的药用真菌。[0003]目前，传统的孢子存活率检测方法主要为平板涂涂布法和孢子萌发率检测法。平板涂布法是通过菌落计数来计算孢子存活率的，准确性高，但耗时耗力。因为樟芝孢子涂布后通常要4~6 d方可形成可计数菌落，导致该方法效率低下；孢子萌发率检测法由于受孢子基数(孢子总数)的限制，准确性亦收到限制，且耗时相对较长，一般需3 d左右。本发明所提供的方法简便快速，整个过程只需I~2 h，且准确度高，与平板涂布法相当。将本发明所提供方法应用于樟芝接种物孢子活性(存活率)检测及诱变育种中孢子致死率检测，可大大缩短检测时间，显著提高工作效率，极具实用价值和意义。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种快速检测樟芝无性孢子存活率的方法，可用于检测樟芝孢子低温保藏样品、樟芝接种物(孢子悬浮液)及樟芝孢子悬浮液诱变物中樟芝孢子的活性(存活率)或致死率等。
[0005]为解决上述技术问题，本发明所提供的具体技术方案如下:
用流式细胞仪检测方法:
1.于2 mL EP管中加入5 μL浓度约为IO9个/mL的孢子悬浮液，再用500 μL PBS缓冲液清洗(2000 rpm,离心5 min,弃上清)孢子3次。
[0006]2.加入 250 M-L 缓冲液(staining buffer,含 0.2% pluronic F68 的憐酸缓冲液)，将孢子悬浮。
[0007]3.再加入 5 M-L TO (thiazole orange)及 5 M-L PI (propidium iodide)染料，混匀。
[0008]4.室温避光静置30 min后，用流式细胞仪上机检测，可直接读出存活率。
[0009]所述流式细胞仪型号不限；所述染料为TO (thiazole orange)及PI (propidiumiodide);所述染料添加量为I~50 PL,优选5 KL ;所述缓冲液(staining buffer)优选含
0.2% pluronic F68的磷酸缓冲液；所述染色时间为10~60 min,优选30 min ;所述孢子为无性孢子，优选樟芝无性节孢子。
[0010]用细胞分析仪检测方法:
1.于2 mL EP管中加入5 μL浓度约为IO9个/mL的孢子悬浮液，再用500 μL PBS缓冲液清洗(2000 rpm,离心5 min,弃上清)孢子3次。
[0011]2.向其中一个EP管中加入500 ?细胞裂解液(含staining buffer),再加入5μL TO (thiazole orange)染料,混匀，室温避光静置30 min后用细胞分析仪检测,得孢子总数。
[0012]3.向另一个 EP 管中加入 500 KL 缓冲液(staining buffer,含 0.2% pluronicF68的磷酸缓冲液),再加入5 ? TO (thiazole orange)染料,混匀，室温避光静置30 min后用细胞分析仪检测，得死亡孢子数。
[0013]4.用第2步和第3步的结果计算出孢子死亡率，进而得出孢子存活率。
[0014]所述细胞分析仪型号不限；所述染料为TO (thiazole orange);所述染料添加量为I~50 KL,优选5 ML ;所述缓冲液(staining buffer)优选含0.2% pluronic F68的磷酸缓冲液；所述染色时间为10~60 min，优选30 min ;所述孢子为无性孢子，优选樟芝无性节孢子。
[0015]本发明的有益效果如下:传统的孢子存活率检测方法主要为平板涂涂布法和孢子萌发率检测法。平板涂布法是通 过菌落计数来计算孢子存活率的，准确性高，但耗时耗力。因为樟芝孢子涂布后通常要4~6 d方可形成可计数菌落，导致该方法效率低下；孢子萌发率检测法由于受孢子基数(孢子总数)的限制，准确性亦收到限制，且耗时相对较长，一般需3 d左右。本发明所提供的方法简便快速，整个过程只需I~2 h，且准确度高，与平板涂布法相当。将本发明所提供方法应用于樟芝接种物孢子活性(存活率)检测及诱变育种中孢子致死率检测，可大大缩短检测时间，显著提高工作效率，极具实用价值和意义。
[0016]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。例如用于检测不同物种的不同孢子、使用不同型号的仪器检测、改变染料添加量及染色时间、改变缓冲液种类及添加量等。
[0017]以下通过实例形式的【具体实施方式】对本发明的上述内容再做进一步详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实例，凡基于本发明上述内容所实现的【技术领域】均属于本发明的范围。
【具体实施方式】
[0018]1.菌种:以保藏号为 ATCC N0.200183 的棒芝菌株作为出发菌种获取无性孢子。
[0019]2.发酵培养基(g/L):葡萄糖 20.0，酵母粉 2.0，KH2PO4 3.0，MgSO4 1.5，pH 4.5。
[0020]3.樟芝液态发酵培养:按1.0X IO6个/mL的接种量将樟芝孢子在接入装有100mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，150 rpm，26 °G恒温培养12 d。
[0021]4.孢子收集:将樟芝发酵物用2层纱布过滤，所得滤液再用2层擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rmp,离心10 min,弃上清,沉淀即为樟芝无性孢子。
[0022]5.用流式细胞仪检测樟芝孢子存活率:(I)于2 mL EP管中加入5 μL浓度约为IO9个/mL的孢子悬浮液，再用500 μL PBS缓冲液清洗(2000 rpm,离心5 min,弃上清)孢子 3 次；(2)加入 250 M-L staining buffer (含 0.2% pluronic F68 的憐酸缓冲液)，将抱子悬浮；(3)再加入 5 M-L TO (thiazole orange)及 5 M-L PI (propidium iodide)染料，混匀；(4)室温避光静置30 min后，用流式细胞仪上机检测，可直接读出存活率。
[0023]6.用细胞分析仪检测樟芝孢子存活率:(I)于2 mL EP管中加入5 μL浓度约为IO9个/mL的孢子悬浮液，再用500 μL PBS缓冲液清洗(2000 rpm,离心5 min,弃上清)孢子3次；(2)向其中一个EP管中加入500 μL细胞裂解液(含staining buffer)，再加入5μL TO (thiazole orange)染料,混匀，室温避光静置30 min后用细胞分析仪检测,得孢子总数；(3)向另一个 EP 管中加入 500 M-L staining buffer (含 0.2% pluronic F68 的憐酸缓冲液)，再加入5 ? TO (thiazole orange)染料,混匀，室温避光静置30 min后用细胞分析仪检测，得死亡孢子数；(4)用第2步和第3步的结果计算出孢子死亡率，进而得出孢子存活率。
[0024]实施例1:
将步骤4中收集到的樟芝新鲜孢子用生理盐水悬浮，配成浓度为I X IO7个/mL的孢子悬浮液，分别用流式细胞仪检测法、细胞活力分析仪检测法、平板涂布法及培养60 h孢子萌发率法检测孢子存活率，每个做实验做3个重复。结果见表1，4种方法的检测结果无显著差异。
[0025]表1
【权利要求】
1.一种快速检测樟芝无性孢子存活率的方法，其特征在于，用流式细胞仪或细胞活力分析仪检测，所用染料为TO及PI，染色时间为10?60 min。
2.权利要求1所述的方法，其特征为:检测仪器可为流式细胞仪或细胞活力分析仪中的任一种。
3.权利要求1所述的方法，其特征为:所述的染料为TO或PI。
4.权利要求1所述的方法，其特征为:所述的染色时间为10?60min。
5.权利要求1所述的方法，其特征为:所述的孢子为樟芝无性节孢子。
【文档编号】G01N15/10GK103954547SQ201410189887
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月7日 优先权日:2014年5月7日
【发明者】耿燕, 许正宏, 史劲松 申请人:江南大学