樟芝子实体三萜类组合物、制备与分析方法
【专利摘要】本发明以高效液相色谱及核磁共振图谱技术分离、纯化、解析出樟芝子实体中的麦角甾烷及羊毛甾烷三萜类组合物及它们的立体结构式和含量，并测试它们的细胞毒性。通过前述技术，可以检测药品、保健食品或其他商品中是否含有麦角甾烷及羊毛甾烷三萜类组合物及它们的含量。
【专利说明】憧芝子实体H瞄类组合物、制备与分析方法
[000。 本申请是申请日为2011年04月12日，申请号为201110092150. 6,发明名称为"棒 芝子实体H聰类组合物、制备与分析方法"的申请的分案申请。
【技术领域】
[0002] 本申请涉及一种棒芝子实体组合物，本申请尤其涉及一种棒芝子实体H聰类组合 物，W及该H聰类组合物的制备方法与分析方法。
【背景技术】
[0003] 棒芝（An化Odiacinnamomea)又称棒茹、牛棒茹、牛棒芝等，为台湾特有的真菌菌 种，生长于海拔400至2000公尺特有的牛棒树（Cinnamomumkanehirai)树干腐朽的也材内 壁，或枯死倒伏的牛棒木材阴暗潮湿的表面。因此，要寻找到野生的棒芝子实体（化Uiting body)或确认此多孔菌目（Aphyllophorales)真菌菌株的外观并不容易，也由于其生物活 性成分具潜在的医药价值，因此棒芝的价格居高不下。
[0004]由于棒芝子实体不易被发现和W人工方式培养，因此目前市面上多为棒芝菌丝体 (mycelia)产品，其宣称具有抗癌、减少治疗引起的症状及其他副作用。此外，棒芝菌丝体产 品也被发现具有抗氧化、抗过敏、免疫刺激效果（Liu等人，2007)。该些产品宣称具有与棒 芝子实体相似的主要成分，包括具有细胞毒性的H聰类（trite巧enes)、类固醇（steroid) 及具有免疫刺激性的多糖体等（化en等人，1995 ;Yang等人，1996)。
[0005] 传统上，棒芝被应用于健康食品，W避免发炎、过敏、皮肤癖、肝癌的发生，因此，棒 芝菌丝体及子实体萃取物被认为是具有潜力的化学治疗药物，W对抗肝癌、前列腺癌、膀脫 癌、肺癌细胞等（Qien等人，2007巧SU等人，2007 ;F*eng等人，2007 ;aietty等人，2005;Wu 等人，2006)，但各类有效成分的活性机制与抑制癌症能力并未被完整理清及探讨。
[0006] 此外，中华民国专利号1299665掲露了棒芝萃取物及其制备方法，其W己醇萃取 棒芝菌丝体获得多糖体，用W抑制基质金属蛋白酶的活性，但并非W棒芝子实体进行萃取， 其产物也未能抑制癌细胞的生长；中华民国专利号1279439掲露了W棒芝菌丝体进行培 养，通过调整培养时的酸碱值获得培养物，并未掲露萃取方法；而中华民国专利号591110 掲露了由棒芝菌丝体萃取出Y-氨基下酸，其先冷冻干燥棒芝菌丝体，再W水或有机溶剂 萃取。上述该些发明都没有W棒芝子实体进行有机溶剂或水萃取，而且未鉴定出其所内含 的指标性二次代谢化合物。再者，前述发明也并未公开棒芝子实体所含有的H聰类组合物 或其他组成份。
[0007] 本申请的 申请人:鉴于现有技术中的不足，经过悉也试验与研究，并本着镇而不舍 的精神，最终构思出本申请"棒芝子实体H聰类组合物、制备与分析方法"，能够克服现有技 术的不足，W下为本申请的简要说明。
【发明内容】
[0008]为了克服现有技术无法有效分离棒芝子实体（或菌丝体）或棒芝萃取物中的组合 物，并确定该组合物的立体结构的问题，本发明W高效液相色谱及核磁共振图谱等技术分 离、纯化、解析出棒芝子实体中麦角留焼（ergostane)及羊毛留焼（Ianostane)H聰类组合 物，及它们的立体结构式和含量。通过现有技术，可W检测药品、保健食品或其他商品中是 否含有麦角留焼及羊毛留焼H聰类组合物，及它们的含量。
[0009] 本发明提供一种药物组合物，其包括如下文所掲示的有效剂量的式I?式VI及式 VIII?式IX中的一种的麦角留焼H聰类组合物。
[0010] 而麦角留焼H聰类组合物是从棒芝子实体的己酸己醋萃取物（W下简称己酸己 醋萃取物）中分离。为了得到己酸己醋萃取物，W己醇溶液、正己焼溶液及己酸己醋溶液依 次对棒芝子实体进行萃取。麦角留焼H聰类组合物经实验证实具有杀死血癌细胞的活性。
[0011] 本发明另提供一种制备麦角留焼H聰类组合物的方法，其对己酸己醋萃取物进行 层析，获得麦角留焼H聰类组合物，其中该麦角留焼H聰类组合物包括下文掲示的式I至 式X的组合物（或称为立体异构体纯的化合物）。
[0012] 进一步而言，该层析步骤还包括；使用高效液相色谱柱，在流动相溶剂为己膳与含 酸水的条件下分离麦角留焼H聰类组合物，获得麦角留焼H聰类组合物的立体异构体纯的 化合物。
[0013] 此外，该层析步骤还可获得羊毛留焼H聰类组合物。麦角留焼H聰类组合物 包括棒芝酸A、棒芝酸B、棒芝酸C、antcinA、antcinC和/或antcinK,而羊毛留 焼H聰类组合物包括下文所掲示的去氨硫色多孔菌酸（dehy化OSiil地urenicacid, 式XI)、硫色多孔菌酸（sulphurenicacid,式XII)、15a-己醜基-去氨硫色多孔菌酸 (15a-acetyl-dehydrosulphurenicacid,式XIII)、变孔孔菌酸（versisponicacidD, 式XIV)、去氨齿孔酸（dehy化oeburicoicacid,式XV)和 / 或齿孔酸（eburicoicacid,式 XVI)。
[0014] 具体地，本申请提供一种制备麦角留焼H聰类组合物的方法，包括：
[0015] 提供棒芝子实体的己酸己醋萃取物；且
[0016]层析该棒芝子实体的己酸己醋萃取物，W获得该麦角留焼H聰类组合物，其中该 麦角留焼H聰类组合物选自由3a，4目，7目-H轻基-4a-甲基麦角留焼-8, 24 (28)-二 帰-11-丽-25S-26-酸、3a，4目，7目-S轻基-4a-甲基麦角留焼-8,24(28)-二 帰-11-丽-25R-26-酸、7目-轻基-4a-甲基麦角留焼-8,24(28)-二帰-3, 11-二 丽-25S-26-酸、7目-轻基-4a-甲基麦角留焼-8, 24 (28)-二帰-3, 11-二丽-25R-26-酸、 3a，12a-二轻基-4a-甲基麦角留焼-8, 24 (28)-二帰-7, 11-二丽-25R-26-酸、 3a，12a-二轻基-4a-甲基麦角留焼-8, 24 (28)-二帰-7, 11-二丽-25S-26-酸、 3a-轻基-4a-甲基麦角留焼-8, 24(28)-二帰-7, 11-二丽-26-酸、4a-甲基麦角 留焼-8,24 (28)-二帰-3, 7, 11- H丽-25S-26-酸、4 a-甲基麦角留焼-8,24 (28)-二 帰-3, 7, Il-H丽-25R-26-酸、4 a-甲基麦角留焼-8,24 (28)-二帰-3, 11-二丽-26-酸及 其组合组成的组之一。
[0017] 其中，该棒芝子实体的己酸己醋萃取物通过依次W己醇溶液、正己焼溶液和己酸 己醋溶液萃取棒芝子实体而获得。
[0018] 其中，该层析步骤还可获得羊毛留焼H聰类组合物。
[0019] 其中，该羊毛留焼H聰类组合物选自由去氨硫色多孔菌酸、硫色多孔菌酸、 15a-己醜基-去氨硫色多孔菌酸、变孔孔菌酸、去氨齿孔酸、齿孔酸及其组合组成的组之 O
[0020] 其中，该层析步骤还包括；使用高效液相色谱柱，在流动相溶剂为己膳与含酸水的 条件下分离该麦角留焼H聰类组合物，获得麦角留焼H聰类组合物的立体异构体纯的化合 物。
[0021] 本发明另提供一种方法，用W检测棒芝子实体中至少一种麦角留焼H聰类立体异 构体纯的化合物的含量，该方法包括下列步骤：萃取棒芝子实体，获得己酸己醋萃取物，W 电核磁共振图谱仪检测己酸己醋萃取物，确定己酸己醋萃取物中是否具有至少一种麦角留 焼H聰类组合物。当出现该至少一种麦角留焼H聰类组合物时，W高效液相色谱仪检测己 酸己醋萃取物中该至少一种麦角留焼H聰类立体异构体纯的化合物的含量。
[0022] 其中，该萃取步骤依次W己醇溶液、正己焼溶液和己酸己醋溶液萃取该棒芝子实 体，而获得该棒芝子实体的己酸己醋萃取物。
[0023] 进一步而言，前述检测步骤还包括W咱核磁共振图谱仪检测该至少一种麦角留焼 H聰类组合物的28位的亚甲基信号。
[0024] 再者，该检测方法还用W同时检测棒芝子实体中至少一羊毛留焼H聰类组合物的 含量，包括步骤；核磁共振图谱仪检测己酸己醋萃取物，确定该至少一种羊毛留焼H聰 类组合物是否出现；W及当出现该至少一羊毛留焼H聰类组合物时，W高效液相色谱仪检 测该至少一种羊毛留焼H聰类组合物的含量。Ih核磁共振图谱仪的检测是检测该至少一种 羊毛留焼H聰类组合物的28位的亚甲基信号。而高效液相色谱仪包括使用全波长检测器、 单波长检测器和/或串联质谱仪所组合的检测器。
[00巧]本发明另提供一种分离化合物的立体异构体的方法，该化合物的駿基的a位置 具有不对称中也，该方法包括：计算化合物的地a值（表示为a值）；调整分离溶媒的抑值 为b值，该b值之范围为a-1. 5《b《a+1. 5,且1. 0《b<7 ;W及W该分离溶媒层析该化合 物，W分离出该化合物中的立体异构体。
[0026] 本发明另提出一种检测待测萃取物中麦角留焼H聰类组合物的方法，包括下列步 骤：W棒芝酸A的不同浓度样本为标准品制作核磁共振图谱及检量线；W核磁共振图谱仪 分析待测萃取物中麦角留焼H聰类组合物的28位的亚甲基信号；W及比对检量线及28位 的亚甲基信号，由28位的亚甲基信号的积分面积比计算待测萃取物中麦角留焼H聰类组 合物的含量。
[0027] 参照前述检测方法，本发明另提出一种检测待测萃取物中羊毛留焼H聰类组合物 的方法，包括下列步骤；W去氨齿孔酸的不同浓度样本为标准品制作核磁共振图谱及检量 线；W核磁共振图谱仪分析待测萃取物中羊毛留焼H聰类组合物的28位的亚甲基信号；W 及比对检量线及28位的亚甲基信号，由28位的亚甲基信号的积分面积比计算待测萃取物 中羊毛留焼H聰类组合物的含量。
[0028]本发明另提出一种分析棒芝子实体中麦角留焼H聰类立体异构体纯的化合物的 方法，包括步骤；W高效液相色谱柱层析己酸己醋萃取物，W分离出立体异构体混合物；W 及依据麦角留焼H聰类立体异构体纯的化合物的Ih核磁共振图谱、高效液相色谱柱层析的 保留时间及旋光数据来判断麦角留焼H聰类立体异构体纯的化合物的25位在结构上为R 构型或S构型。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1为本发明的棒芝子实体己酸己醋萃取物的制备方法流程图。
[0030]图2为棒芝酸A立体异构体混合物的高效液相色谱的再循环色谱图谱。
[0031] 图3为从棒芝酸A立体异构体混合物分离取得的纯的化合物E9W及化合物ElO 的色谱图谱。
[0032] 图4为自antcinC立体异构体混合物分离取得纯的化合物E3W及化合物E4的 色谱图谱。
[0033] 图5为自棒芝酸C立体异构体混合物分离取得纯的化合物E5W及化合物E6的色 谱图谱。
[0034] 图6(a)至图6(C)分别为（a)棒芝酸A、化）化合物E9及（C)化合物ElO溶于C5D5N 在600MHz的咱核磁共振图谱。
[00对图7 (a)至图7 (C)分别为（a)棒芝酸A、化）化合物E9及（C)化合物ElO溶于C5D5N在150MHz的"C核磁共振图谱。
[0036] 图8(a)与图8(b)分别为（a)醋类合成化合物E9-1RAT及化）醋类合成化合物 E9-1SAT的化学结构示意图。
[0037] 图9为依据麦角留焼H聰类（IR)-及（1巧-1-(9-意基）-2,2,2-H氣己醇醋类合 成物的Ih核磁共振化学位移的差值判定的结构25位的绝对立体构型的示意图。
[0038] 图10为棒芝子实体的己酸己醋萃取物于不同有机酸（0. 1%的H氣己酸、0. 1%的 甲酸W及0. 1%的己酸）为流动相条件下，于254皿波长的高效液相色谱图谱。
[0039] 图11为棒芝子实体的己酸己醋萃取物于0. 1 %己酸为流动相条件下，高效液相色 谱图谱中各波峰所代表的化合物对照，检测波长为254nm。
[0040] 图12(a)与图12(b)分别为棒芝子实体的己酸己醋萃取物于（a)W己酸馈调整抑 值为3. 75W及4. 0、化）W己酸馈调整抑值为4. 25、4. 5W及5. 0和流动相为0. 1 %己酸 条件下（pH值为3. 3)的高效液相色谱图谱比较，检测波长为254nm。
[0041]图13为优化的分析条件下高效液相色谱图中各波峰所代表的化合物对照。
[0042] 图14(a)至图14讯分别为（a)化合物E1、E2与antcinK、化）化合物E3、E4与 antcinC、（C)化合物E5、E6与棒芝酸C、（d)化合物E7、E8与棒芝酸B、（e)化合物E9、E10 与棒芝酸A及（f)化合物Ell、E12与antcinA于254皿波长的高效液相色谱图谱。
[004引图15(a)与图15(b)分别为（a)棒芝子实体的己酸己醋萃取物与内部标准品化嗦 溶于DMS0-d6在400MHz的咱核磁共振图谱、化）棒芝酸A与去氨齿孔酸的28位的亚甲基 特征信号放大图。
【具体实施方式】
[0044]本申请提出的"棒芝子实体H聰类组合物、制备与分析方法"将可由W下的实施 例说明而得到充分了解，使得本领域技术人员可W据此完成，然而本申请的实施并非由下 列实施例限制其实施方案，本领域技术人员仍可依据示例性实施例的精神推演出其他实施 例，该些实施例都属于本发明的范围。
[004引 实施例
[0046] 为方便说明本发明所萃取的麦角留焼（ergostane)H聰类组合物El?E12,在此 先将组合物El?E12对应的结构式（式I至式幻及其高效液相色谱图对应的波峰详列如 下。
【权利要求】
1. 一种用以检测樟芝子实体中至少一种麦角留烷三萜类立体异构体纯的化合物的含 量的方法，该方法包括下列步骤： 萃取该樟芝子实体，获得该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物； 以1H核磁共振图谱仪检测该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物，确定该樟芝子实体的乙酸 乙酯萃取物中是否具有至少一种麦角留烷三萜类组合物；以及 当该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物中具有该至少一种麦角留烷三萜类组合物时，以高 效液相色谱仪检测该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物中该至少一种麦角留烷三萜类立体异 构体纯的化合物的含量。
2. 如权利要求1所述的方法，其中该萃取步骤依次以乙醇溶液、正己烷溶液和乙酸乙 酯溶液萃取该樟芝子实体，而获得该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物。
3. 如权利要求1所述的方法，还包括以该4核磁共振图谱仪检测该至少一种麦角甾烷 三萜类组合物的28位的亚甲基信号。
4. 如权利要求1所述的方法，其中该方法还用以同时检测该樟芝子实体中至少一种羊 毛甾烷三萜类组合物的含量，包括以下步骤： 以该1H核磁共振图谱仪检测该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物，确定该樟芝子实体乙酸 乙酯的萃取物中是否具有该至少一种羊毛留烷三萜类组合物；以及 当该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物中具有该至少一种羊毛留烷三萜类组合物时，以该 高效液相色谱仪检测该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物中该至少一种羊毛留烷三萜类组合 物的含量。
5. 如权利要求4所述的方法，还包括以该4核磁共振图谱仪检测该至少一种羊毛甾烷 三萜类组合物的28位的亚甲基信号。
6. 如权利要求4所述的方法，其中该高效液相色谱仪包括检测器，该检测器选自由全 波长检测器、单波长检测器及串联质谱仪及其组合组成的组之一。
7. 如权利要求1所述的方法，其中当确定该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物中具有该至 少一种麦角留烷三萜类组合物时，则该至少一种麦角留烷三萜类立体异构体纯的化合物的 羧基的a位具有不对称中心，且该方法还包括下列步骤： 计算该至少一种麦角留烧三廠类立体异构体纯的化合物的pKa值，该pKa值表示为a ; 调整分离溶媒的pH值为b值，b值的范围为a-1. 5彡b彡a+1. 5,且1. 0彡b〈7 ;且 以该分离溶媒层析该至少一种麦角留烷三萜类立体异构体纯的化合物，以分离出该至 少一种麦角留烷三萜类立体异构体纯的化合物中的立体异构体。
8. 如权利要求1所述的方法，还包括下列步骤： 以樟芝酸A的不同浓度样本为标准品制作第一核磁共振图谱及第一检量线； 以核磁共振图谱仪分析该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物中的该至少一种麦角留烷三 萜类组合物的28位的亚甲基信号；以及 比对该第一检量线及该28位的亚甲基信号，由该28位的亚甲基信号的积分面积比计 算该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物中该至少一种麦角留烷三萜类组合物的含量。
9. 如权利要求8所述的方法，还包括下列步骤： 以去氢齿孔酸的不同浓度样本为标准品制作第二核磁共振图谱及第二检量线； 以核磁共振图谱仪分析该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物中羊毛留烷三萜类组合物的 28位的亚甲基信号；以及 比对该第二检量线及该羊毛留烷三萜类组合物的该28位的亚甲基信号，由该羊毛甾 烷三萜类组合物的该28位的亚甲基信号的积分面积比计算该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取 物中该羊毛留烷三萜类组合物的含量。
10.如权利要求1所述的方法，包括步骤： 在以高效液相色谱仪检测该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物中该至少一种麦角留烷三 萜类立体异构体纯的化合物的含量后，分离出该至少一种麦角留烷三萜类立体异构体纯的 化合物；以及 依据该至少一种麦角留烷三萜类立体异构体纯的化合物的1H核磁共振图谱、该高效 液相色谱仪检测出的保留时间及旋光数据，判断该至少一种麦角留烷三萜类立体异构体纯 的化合物的25位在结构上为R构型或S构型。
【文档编号】G01N24/08GK104359933SQ201410495474
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2011年4月12日 优先权日:2011年1月26日
【发明者】吴永昌, 张芳荣, 吕美津, 杜英齐, 吴东颖, 许育铭 申请人:高雄医学大学