核酸突变检测系统的标准化制胶装置及其使用方法
【专利摘要】本发明涉及一种核酸突变检测系统的标准化制胶装置，其特征在于，包括：至少两个自动灌胶部、与至少两个所述的自动灌胶部均连接的灌胶容器部；其中，所述的自动灌胶部包括信号发生器、接受所述的信号发生器发出信号的驱动器、由所述的驱动器驱动的步进电机、以及由所述的步进电机推动的注射器，所述的注射器与所述的灌胶容器部连接。本发明还提供了上述标准化制胶装置的使用方法，采用本发明能够对原先的凝胶灌制设备进行电控设计，并结合一系列操作方法如批量凝胶的制备，凝胶厚度控制以及多块凝胶整体制作后拆分等方案，最大限度的保证了灌胶动作和凝胶形状、凝胶形成的条件的一致性，且易于清洗便于使用。
【专利说明】核酸突变检测系统的标准化制胶装置及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学【技术领域】，特别涉及标准化制作用于核酸突变检测的梯度 丙烯酰胺凝胶领域，具体是指一种核酸突变检测系统的标准化制胶装置及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 核酸突变检测技术（DGGE)是分子生物学常用的一种电泳检测技术，DGGE不是将 分子量不同的DNA分开，而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同 的DNA分开。该方法的原理是根据DNA的解链特性，不同碱基组成的DNA双螺旋发生变 性所要求的变性剂浓度不同，混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺 凝胶电泳时，当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时，相对应的DNA发 生解链变性，导致电泳迁移速率降低。由于泳动受阻DNA分子在凝胶中的停留位置不同， 从而使不同DNA分子得以分离。根据变性剂梯度方向的不同，DGGE可分为：垂直DGGE，即 变性剂梯度与电场方向垂直，常用于试验决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度 范围；平行DGGE，其变性剂的梯度和电场方向平行，主要用于解链范围明确的DNA片段的 检测。DGGE已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌，古菌、微型真核生物、真核生物和病 毒群落的生物多样性。这一技术能够提供群落中优势种类信息并同时分析多个样品，具有 可重复和操作简单等特点，适合于调查种群的时空变化，并且可通过对条带的序列分析 或与特异性探针杂交分析鉴定群落组成。该技术应用领域广泛，简单实用，费用低，但是存 在的问题也比较突出。目前，国内外利用该方法进行研究主要是依赖于美国Bio-Rad公司 生产的DCode通用突变检测系统来完成，其提供了一套通过差速推进从而实现变性剂浓度 梯度的制作，由于人工手动推进存在推进速度、时间上的较大误差，因此每次制作出的凝胶 的变性剂浓度梯度分布差异也较大，这就为后续的电泳图谱的凝胶分析造成了比较大的麻 烦，使得不同图谱上面的信息难以联合分析，因此有必要设计一款产品并提供一套方法，从 而实现梯度变性剂凝胶的标准化生产。
[0003] 西安工业学院曾与2005年设计过一款全自动电泳用梯度凝胶胶片的制作装置， 该设计采用单片机与电脑相连，为了制作具有凝胶浓度梯度的产品，设计目的并非是为了 制作突变检测系统使用的变性剂梯度凝胶。而且单片机的编程极其复杂，费用较高，不适合 于没有单片机原理背景的生物学实验人员使用；其注胶是多个胶板同时灌注，由于其设计 结构会产生前后速度差，考虑到扩散的影响，最终造成不同凝胶胶片的高度和梯度分布会 有差异，影响胶孔制作和最后凝胶梯度的分布；最后，该发明为了追求一味的自动化，忽视 了灌胶装置清洗这一重要步骤，由于丙烯酰胺在加入凝胶剂后，会在数分钟内由液体凝结 成为胶装固体，如果不及时对灌胶装置进行及时清洗，凝胶会堵塞设备造成设备报废，上述 设计仅考虑到灌胶槽的清洗，并未考虑到注射设备的及时清洗，成为因此我们认为该设计 有比较大的缺陷，虽然在其解决目的领域有一定的应用价值，但是对于制作突变检测用凝 胶来说，显然还需要提供一套能够解决上述问题和更为简便的设计。
[0004] 所以一种适合凝胶突变检测用凝胶的标准化，可以实现凝胶的标准化制作，且结 构简单，易于操作，制胶和清洗也都非常方便，制作费用低，易于在实验室大规模推广的制 作装置以及方法是十分具有实用意义的。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了克服上述现有技术中的缺点，提供一种可以实现凝胶突变检 测用凝胶的标准化制作，且结构简单，易于操作，制胶和清洗非常方便，制作费用低，易于在 实验室大规模推广的核酸突变检测系统的标准化制胶装置及其使用方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种核酸突变检测系统的标准化制胶装 置，其特征在于，包括：至少两个自动灌胶部、与至少两个所述的自动灌胶部均连接的灌胶 容器部；
[0007] 其中，所述的自动灌胶部包括信号发生器、接受所述的信号发生器发出信号的驱 动器、由所述的驱动器驱动的步进电机、以及由所述的步进电机推动的注射器，所述的注射 器与所述的灌胶容器部连接。
[0008] 较佳地，所述的驱动器还与电源连接。
[0009] 较佳地，至少两个所述的自动灌胶部之间的连接关系为并联，由触发开关同时触 发。
[0010] 较佳地，所述的灌胶容器部包括具有互相平行的第一凹槽和第二凹槽的灌胶支 架、分别与所述的第一凹槽与所述的第二凹槽嵌合的第一玻璃组件以及第二玻璃组件，所 述的第一玻璃组件与所述的第二玻璃组件相对而设且宽度和厚度相同，高度不同，所述的 第一玻璃组件与所述的第二玻璃组件之间的高度差用以架设制作点样胶孔的模具（通常 称之为梳子），靠近所述的灌胶支架两端的第一玻璃组件的边缘与第二玻璃组件的边缘之 间设有橡胶条，所述的橡胶条的厚度与要制备胶的厚度一致，第一玻璃组件与第二玻璃组 件之间用紧固螺丝夹紧，所述的第一玻璃组件中的邻边与所述的第二玻璃组件的邻边之间 设有至少两个卡件。
[0011] 更佳地，所述的第一玻璃组件与所述的第二玻璃组件均包括至少两块玻璃板，所 述的第一玻璃组件中的玻璃板之间尺寸相同，所述的第二玻璃组件中的玻璃板之间尺寸相 同，所述的第一玻璃组件中的玻璃板之间以及所述的第二玻璃组件中的玻璃板之间均为通 过密封条连接。
[0012] 更佳地，其特征在于，所述的灌胶支架外侧设有拉筋结构。
[0013] 较佳地，其特征在于，所述的注射器与所述的灌胶容器部之间通过三通管连接。
[0014] 采用了上述的核酸突变检测系统的标准化制胶装置，能够对原先的凝胶灌制设备 进行电控设计，并结合一系列操作方法如批量凝胶的制备，凝胶厚度控制以及多块凝胶整 体制作后拆分等方案，最大限度的保证了灌胶动作和凝胶形状、凝胶形成的条件的一致性， 从而使得突变检测用凝胶的制作在实验室中实现了标准化，所涉及的装置制作费用低，充 分考虑了实验室实验时的可实现性。且能够实现制胶的一致性。且易于清洗。
[0015] 本发明另一方面提供了上述核酸突变检测系统的标准化制胶装置的使用方法，其 特征在于，包括以下步骤：
[0016] 步骤（1):计算好所需的胶溶液的量，根据所述的量制备高浓度变性剂凝胶溶液 和低浓度变性剂凝胶溶液。
[0017] 步骤⑵：将所述的高浓度变性剂凝胶溶液装入一个自动灌胶部的注射器中，将 所述的低浓度变性剂凝胶溶液装入另一个自动灌胶部的注射器中。
[0018] 步骤（3):由触发开关同时触发所述的自动灌胶部，信号发生器将信号传送至驱 动器，所述的驱动器接受所述的信号发生器的信号，在电源的供电下驱动步进电机运作，所 述的步进电机驱动所述的注射器将所述的胶溶液灌入灌胶容器部，容纳所述的高浓度变性 剂凝胶溶液的注射器作匀减速推进，容纳所述的低浓度变性剂凝胶溶液的注射器作匀加速 推进。
[0019] 较佳地，所述的容纳高浓度变性剂凝胶溶液的注射器与容纳低浓度变性剂凝胶溶 液的注射器之间的加速度的绝对值相同，注胶量和所用时间一致。
[0020] 较佳地，还包括以下步骤，所述的灌胶容器部采用两块相对而设带有刻度线的玻 璃板，灌胶之前，将两块所述的带有刻度线的玻璃板通过夹子夹紧，灌入与需要灌入凝胶溶 液相同体积的水，通过调节所述的夹子的力度，使得水位与刻度线一致，然后放出水40°c烘 干备用。
[0021] 采用了上述核酸突变检测系统的标准化制胶装置的使用方法，操作简单，仅一页 纸的说明书即可完成。其操作过程可以根据胶的大小和浓度等条件任意更改，简便易行。本 发明将实现标准化制胶的关键步骤进行了严格的控制。对于一些不会对标准化造成影响的 步骤采用了手动操作，一方面增加了方法的灵活性和实验室的可操作性，另外一方面降低 了成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1是本发明实施例中自动灌胶部的原理图。
[0023] 图2是本发明实施例中灌胶容器部的正视图。
[0024] 图3是本发明实施例中灌胶容器部的侧视图。
[0025] 图4是本发明实施例中灌胶容器部的俯视图。
[0026] 图5是本发明实施例中灌胶容器部的结构示意图。
[0027] 图6是本发明实施例中自动灌胶部与灌胶容器部连接的示意图。
[0028] 图中标号说明如下：
[0029] 11信号发生器
[0030] 12驱动器
[0031] 13 电源
[0032] 14步进电机
[0033] 15注射器
[0034] 16注射启动钮
[0035] 21灌胶狭缝
[0036] 22玻璃板
[0037] 23加强筋
[0038] 24灌胶支架
[0039] 25紧固螺丝
[0040] 31三通连接管
[0041] 32混合胶注胶头
[0042] 33混合胶注射分管
[0043] 34高浓度硅胶管
[0044] 35低浓度硅胶管
【具体实施方式】
[0045] 为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，下面结合附图对本发明的具体实施方 法作进一步说明。
[0046] 凝胶的制备：每批试验之前，计算好该次试验所需要的凝胶的量，制作好足够该项 试验所需要的高变性剂和低变性剂浓度的凝胶各一瓶，该步骤目的是为了规避不同批配置 的凝胶的配置误差。
[0047] 灌胶动作采用步进电机结合程序设计较为简易的步进电机信号发生器\驱动器 \电源开关来完成，具体设计电路如图1所示，信号发生器11将信号传至驱动器12,驱动器 12在电源13供电下驱动步进电机14实现动作。步进电机与注射器15连接，整个自动灌胶 部采用两套上述的配置并联，由注射启动钮16实现同时触发。
[0048] 如图2?6所示，使用时根据需要灌制的胶的大小以及变性剂浓度梯度的变化范 围，进行操作。两套自动灌胶部分别注射高浓度和低浓度丙烯酰胺凝胶，通过三通连接管混 合后注入玻璃板制成的胶膜当中。
[0049] 对丙烯酰胺溶液添加凝胶剂总量1 %的过硫酸铵和TEMED，混匀后，触发自动灌胶 部启动注射器15抽胶，抽胶程序可设置为匀速。注射器15抽取凝胶后，停顿数秒，此时将 两注射器15前段硅胶管连接到三通连接管31上。连接好后，推胶流程开始，高浓度变性剂 的凝胶从一个较快的速度开始做匀减速推进，低浓度变性剂凝胶从速度为0开始做匀加速 推进，两支注射器15的加速度绝对值相等。注胶量和所用时间一致，从而保证了凝胶变性 剂浓度梯度的均匀。注胶完毕，为清洗硅胶管和注射器15中的残留余胶，从新触发上述程 序一次，用灭菌纯水对装置进行润洗。
[0050] 为了保证上述灌胶动作的一致性，还提供以下方案用以控制凝胶模具的标准化：
[0051] 方案一：提供一款带有刻度线的玻璃板，灌胶之前，将两块玻璃板夹紧，灌入与需 要灌入凝胶相同体积的水，通过调节夹子的力度，使得水位与刻度线一致，然后放出水40°C 烘干备用。由于玻璃板的面积（到刻度线）和凝胶的体积是固定的，因此通过该方法可以 有效地控制玻璃板的厚度，加之凝胶的动作和凝胶的配置的一致性，从而最大限度的保证 了凝胶变性剂梯度的标准化。
[0052] 方案二：设计一款一次性制作多块凝胶的支架。基本原理是制作一块大于所需凝 胶宽度数倍的凝胶，将凝胶切为多块，也可以保证凝胶变性剂浓度梯度的一致性。具体的， 以一次制作四块凝胶为例，如图2?图5所示，将四对玻璃板22嵌入灌胶支架24凹槽内， 两块玻璃板22之间具有灌胶狭缝21，支架最外侧的两块玻璃板22之间使用橡胶条卡住，橡 胶条厚度与所制备胶的厚度一致。玻璃板22与卡槽之间接触部分采用弹性材料，利用玻璃 板紧固螺丝25夹紧前后玻璃板，两对玻璃板22相邻边使用弹性小卡件在玻璃板22之间的 上角和下角，小卡件厚度与所制备的凝胶的厚度一致。小卡件和两端的玻璃板22之间的橡 胶条共同支撑其灌胶的空间。外侧支架设置加强筋23保证其强度。使用电动注射装置灌 制好凝胶后，由于4块凝胶是一个整体，其凝胶梯度可以保证完全一致。取下时，由于每两 块玻璃板以及凝胶之间巨大的张力，每对玻璃板连同凝胶很容易分开。采用这样的思路，可 以一次制备4?8块梯度完全一致的突变检测用凝胶，对于大规模分析已经足够使用了。
[0053] 凝胶注射也可以采用如图6所示：高、低变性剂浓度凝胶混合后，可由几个分管分 别注入，可进一步增加凝胶变性剂梯度的均一性。分管数越多，效果越好。
[0054] 实施例1
[0055] 按照以下步骤编写程序：
[0056] 步骤一、抽胶：
[0057] 制作一块16cm*16cm的凝胶需要消耗凝胶合计22ml，两支注射器以4. 4cm/s的速 度勾速抽取，共需要5s。
[0058] 步骤二、停顿
[0059] 暂停时间15s，该时间为实验者有时间将硅胶管接在三通连接管31上。
[0060] 步骤三、推进
[0061] 每只注射器需要推进22cm，在11秒注射完毕。
[0062] 高浓度凝胶速度程序设定为：
[0063] 第 1 秒，速度为 4. 40cm/s
[0064] 第 2 秒，速度为 3. 96cm/s
[0065] 第 3 秒，速度为 3. 52cm/s
[0066] 第 4 秒，速度为 3. 08cm/s
[0067] 第 5 秒，速度为 2. 64cm/s
[0068] 第 6 秒，速度为 2. 20cm/s
[0069] 第 7 秒,速度为 1. 76cm/s
[0070] 第 8 秒，速度为 1. 32cm/s
[0071] 第 9 秒，速度为 0. 88cm/s
[0072] 第 10 秒，速度为 0· 44cm/s
[0073] 第11秒，速度为Ocm/s
[0074] 低浓度凝胶速度程序为：
[0075] 第1秒，速度为〇cm/s
[0076] 第 2 秒，速度为 0. 44cm/s
[0077] 第 3 秒，速度为 0. 88cm/s
[0078] 第 4 秒，速度为 1. 32cm/s
[0079] 第 5 秒,速度为 1. 76cm/s
[0080] 第 6 秒，速度为 2. 20cm/s
[0081] 第 7 秒，速度为 2. 64cm/s
[0082] 第 8 秒，速度为 3. 08cm/s
[0083] 第 9 秒，速度为 3. 52cm/s
[0084] 第 10 秒，速度为 3. 96cm/s
[0085] 第 11 秒，速度为 4. 40cm/s
[0086] 步骤四：清洗
[0087] 重新启动上述程序一遍，用清水清洗注射器和硅胶管。
[0088] 实施例2
[0089] 制作变性剂浓度梯度为40% -60%的聚丙烯酰胺凝胶，凝胶浓度为8%，用于分析 200bp的核酸片段。
[0090] 制作10块凝胶保证一批实验的凝胶的标准化，分别配置变性剂（尿素和去离子 甲酰胺）浓度40%和60 %的8%的丙烯酰胺溶液各250ml。在玻璃板高约14cm处标上刻 度，将两块玻璃板用架子夹上，使用电动推进装置按照注胶程序注入22ml水，调节夹子松 紧，使得水的高度与刻度线一致，倒去水40°C烘干，重新安装在灌胶支架上。每次灌注前各 取12ml高浓度和低浓度凝胶，加入凝胶剂（过硫酸铵和TEMED)后，将两个注射器分别抽取 11ml高浓度和低浓度凝胶从高浓度硅胶管34以及低浓度硅胶管35注入。启动电动推进装 置，完成凝胶灌注。发现灌注凝胶正好与刻度线持平，效果良好。待凝胶凝结后，装上电泳 梳在凝胶上层注入变性剂为0的胶将梳子埋入，待上层无变性剂凝胶凝结，拔去梳子即可 为后续电泳实验使用。
[0091] 实施例3
[0092] 采用多块凝胶整体制作的支架一次性制作4块凝胶。
[0093] 根据四块凝胶所需丙烯酰胺的量计算出四块凝胶共需要88ml凝胶，高浓度凝胶 和低浓度凝胶各取45ml，安装好图2?图5所示支架，将4对玻璃板固定好，安装好图6所 示的混合胶注胶头32,启动自动推进注胶装置，两个注射器分别抽取44ml高、低浓度加入 凝结剂的凝胶，接好三通连接管31后，在三通连接管31充分混合的凝胶从四根混合胶注射 分管33分别流出，通过注胶头注入四对玻璃板间的灌胶狭缝，由于四对玻璃板间的夹缝相 连，四个注胶头注入的胶连成一片，形成一个整体，凝结后，在上层封上无变性剂凝胶。拆下 主支架盖板，用手术刀切开每对玻璃板之间相连的多余凝胶，得到四块梯度完全一致的凝 胶。如需清洗只需要再次启动自动灌胶部的程序一次，不过抽取的液体用水代替凝胶即 可。
[0094] 采用了上述的核酸突变检测系统的标准化制胶装置及其使用方法，只需要对原先 的凝胶灌制设备进行电控设计，并结合一系列操作方法如批量凝胶的制备，凝胶厚度控制 以及多块凝胶整体制作后拆分等方案，最大限度的保证了灌胶动作和凝胶形状、凝胶形成 的条件的一致性，从而使得突变检测用凝胶的制作在实验室中实现了标准化，所涉及的装 置制作费用低，比如电控灌胶设备的成本能够控制在1000元人民币以内，价格甚至远远低 于市面上公司的手动灌胶设备的销售价格，灌胶支架的第一套方案只需要在目前已有的设 备基础上稍加改造（在玻璃板上面加刻度线即可）并按照提出的使用方法即可达到远高于 原先的使用效果。灌胶支架的第二套方案的支架制作也不过几百元一套。上述方案充分考 虑了实验室实验时的可实现性。操作简单，操作仅一页纸的说明书即可完成，可以根据胶的 大小和浓度编写程序来进行操作，不需要具备复杂的编程知识即可完成。且可以根据胶的 大小和浓度等条件任意更改，简便易行。本发明将实现标准化制胶的关键步骤进行了严格 的控制。对于一些不会对标准化造成影响的步骤采用了手动操作，一方面增加了方法的灵 活性和实验室的可操作性，另外一方面降低了成本。
[0095] 在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出 各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限 制性的。
【权利要求】
1. 一种核酸突变检测系统的标准化制胶装置，其特征在于，包括：至少两个自动灌胶 部、与至少两个所述的自动灌胶部均连接的灌胶容器部； 其中，所述的自动灌胶部包括信号发生器、接受所述的信号发生器发出信号的驱动器、 由所述的驱动器驱动的步进电机、以及由所述的步进电机推动的注射器，所述的注射器与 所述的灌胶容器部连接。
2. 根据权利要求1所述的核酸突变检测系统的标准化制胶装置，其特征在于，所述的 驱动器还与电源连接。
3. 根据权利要求1所述的核酸突变检测系统的标准化制胶装置，其特征在于，至少两 个所述的自动灌胶部之间的连接关系为并联，由触发开关同时触发。
4. 根据权利要求1所述的核酸突变检测系统的标准化制胶装置，其特征在于，所述的 灌胶容器部包括具有互相平行的第一凹槽和第二凹槽的灌胶支架、分别与所述的第一凹槽 与所述的第二凹槽嵌合的第一玻璃组件以及第二玻璃组件，所述的第一玻璃组件与所述的 第二玻璃组件相对而设且宽度和厚度相同，高度不同，所述的第一玻璃组件与所述的第二 玻璃组件之间的高度差用以架设制作点样胶孔的模具，靠近所述的灌胶支架两端的第一玻 璃组件的边缘与第二玻璃组件的边缘之间设有橡胶条，所述的橡胶条的厚度与要制备胶的 厚度一致，第一玻璃组件与第二玻璃组件之间用紧固螺丝夹紧，所述的第一玻璃组件中的 邻边与所述的第二玻璃组件的邻边之间设有至少两个卡件。
5. 根据权利要求4所述的核酸突变检测系统的标准化制胶装置，其特征在于，所述的 第一玻璃组件与所述的第二玻璃组件均包括至少两块玻璃板，所述的第一玻璃组件中的玻 璃板之间尺寸相同，所述的第二玻璃组件中的玻璃板之间尺寸相同，所述的第一玻璃组件 中的玻璃板之间以及所述的第二玻璃组件中的玻璃板之间通过密封条连接。
6. 根据权利要求4所述的核酸突变检测系统的标准化制胶装置，其特征在于，所述的 灌胶支架外侧设有拉筋结构。
7. 根据权利要求1所述的核酸突变检测系统的标准化制胶装置，其特征在于，所述的 注射器与所述的灌胶容器部之间通过三通管连接。
8. -种核酸突变检测系统的标准化制胶装置的使用方法，其特征在于，包括以下步 骤： 步骤（1):计算好所需的胶溶液的量，根据所述的量制备高浓度变性剂凝胶溶液和低 浓度变性剂凝胶溶液。 步骤（2):将所述的高浓度变性剂凝胶溶液装入一个自动灌胶部的注射器中，将所述 的低浓度变性剂凝胶溶液装入另一个自动灌胶部的注射器中。 步骤（3):由触发开关同时触发所述的自动灌胶部，信号发生器将信号传送至驱动器， 所述的驱动器接受所述的信号发生器的信号，在电源的供电下驱动步进电机运作，所述的 步进电机驱动所述的注射器将所述的胶溶液灌入灌胶容器部，容纳所述的高浓度变性剂凝 胶溶液的注射器作匀减速推进，容纳所述的低浓度变性剂凝胶溶液的注射器作匀加速推 进。
9. 根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，所述的容纳高浓度变性剂凝胶溶液 的注射器与容纳低浓度变性剂凝胶溶液的注射器之间的加速度的绝对值相同，注胶量和所 用时间一致。
10.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，还包括以下步骤，所述的灌胶容器 部采用两块相对而设带有刻度线的玻璃板，灌胶之前，将两块所述的带有刻度线的玻璃板 通过夹子夹紧，灌入与需要灌入凝胶溶液相同体积的水，通过调节所述的夹子的力度，使得 水位与刻度线一致，然后放出水烘干备用。
【文档编号】G01N27/447GK104090018SQ201410304676
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】赵良杰, 周平凡, 刘其根, 刘军, 唐永涛 申请人:上海海洋大学