高效活性表达的鸭坦布苏病毒e蛋白核心抗原域蛋白的用途
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】内的蛋白质分析、制备和诊断技术，涉及高效活性表达的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域蛋白的用途，鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域碱基序列见序列表中序列1所示，在筛选DTMUV抗原表位核心区域的基础上，建立了高敏感性、准确性和操控性强的间接ELISA检测方法，为有效预防和控制DTMUV的传播提供强有力的工具和技术支撑。
【专利说明】高效活性表达的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域蛋白的用途
[0001]
【技术领域】
本发明涉及生物【技术领域】内的蛋白质分析、制备和诊断技术，涉及高效活性表达的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域蛋白的用途。
[0002]
【背景技术】
2010年，一种新型的鸭源黄病毒在我国规模化养鸭场爆发并迅速蔓延至全国，给我国养鸭业带来了巨大的经济损失。该病原-鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus, DTMUV)为黄病毒科、黄病毒属成员，为有囊膜不分节段单股正链RNA病毒。鸭感染DTMUV后主要出现神经症状、采食量减少、产蛋严重下降甚至绝产，并出现大量死亡。感染DTMUV的鸭容易继发病毒性肝炎、传染性浆膜炎、大肠杆菌等其他疾病，疾病发生后由于大量应用药物，导致药物残留严重，影响到鸭肉品质和人类健康。此外，水禽是流感病毒在自然界中的重要“贮存器”，一旦自身免疫力下降，就会造成流感病毒的大量增殖和重组变异。
[0003]鉴于DTMUV产生和潜在的巨大危害，必须建立合理的防控和监测措施，全面及时的了解鸭群的感染带毒状况。因此，标准化、高准确度的血清学检测方法成为必然。国际上通用的黄病毒属血清学检测方法有ELISA、AGP、血凝抑制试验(HI)、补体结合试验(CF)和中和实验(NT)等，但ELISA具有特异性强、灵敏度高、检测速度快、操作简便等优点。CN103869066A公开了一种坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法。检测灵敏度及准确性，是判断检测方法好坏的依据。现有技术中公开的ELISA检测方法，灵敏度及准确性，都有很大的提升空间。
【发明内容】
[0004]为了解决以上现有技术中坦布苏病毒的ELISA检测方法中存在的灵敏度及准确性不高的问题，本发明提供了一种高效活性表达的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域蛋白在坦布苏病毒的ELISA检测方法中的应用。
[0005]本发明是通过以下措施实现的:
本发明所述的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域的确定，是根据鸭坦布苏病毒E蛋白的表达产物进行同源建模，通过分析其完整3D结构、蛋白组成及各组成区域精细结构，发现E蛋白在病毒表面折叠成3个不同结构域1-1IKDomain 1-1II ):D I是由8个β折叠片组成的桶状结构，位于蛋白的中心位置，为图中浅灰区域；D II (图中深灰色区域)则是形成延伸的指状结构，其序列穿插于D I序列之中，在D II末端即为融合环；在0 II相反的方向为D IIK图中黑色区域),为Ig样(Immunoglobulin-like)结构域,是典型的免疫球蛋白结构，含有7个β片层，同时根据其他相似黄病毒的研究和对该区域精细结构分析发现，此区域是病毒抗原表位存在的主要位置；此外，通过对黄病毒进入宿主细胞的过程研究，发现DTMUV E蛋白中His 144、His285、His320位于D I和D III之间的界面上(见图1标注)，参与E蛋白pH依赖的构象改变，也是抗体作用的主要位点。所以，由以上蛋白质结构可知，DTMUV抗原优势区域位于E蛋白的D III。
[0006]本发明所述的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域(碱基序列见序列表中序列I所示，以下简称E DIII)的表达，是在确定核心抗原域的基础上，首先设计鸭坦布苏病毒E蛋白DIII的 PCR 扩增表达引物 E Dili exp-1: 5 ’ -CATGCCATGGAAAGGCATGACCTACCCGATGTG-3 ’(包含NcoI 酶切位点)，E Dili exp-2: 5’-CCGCTCGAGACTTCTATGCCACTGGTACCT_3’(包含 XhoI 酶切位点)，用于鸭坦布苏病毒E DIII的克隆。采用NcoI和XhoI双酶切PCR产物后，连入同样双酶切的pET32a中，构建重组表达质粒pET32a/E D III，然后转化大肠杆菌表达菌株Rosettagarni B (DE3)进行E D III的高效活性表达。SDS-PAGE结果显示，当温度为18 °C，IPTG浓度为0.2mM过夜诱导培养时，实现了 E DIII蛋白的高效可溶性表达，蛋白表达量可占到菌体总蛋白的42%，并且蛋白具有天然活性。
[0007]本发明所述的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域的表达还包括表达蛋白的高纯度制备。菌体进行超声破碎，收集上清蛋白，选用镍柱进行纯化。首先用含50mM Tris和300mMNaCl (pH值8.0)的缓冲液平衡柱体，然后以合适的速度使上清蛋白经过柱体，最后用不同浓度的咪唑进行梯度洗脱，洗脱液为50mM Tris,300mM NaCl和O mM、20mM、40 mM、50 mM、250mM不同浓度的Imidazole (pH值8.0),收集洗脱的蛋白在20mM Tris (pH7.4 )的条件下透析。最终获得纯度为90%的高纯度蛋白。
[0008]本发明所述的鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA诊断方法其特征在于:用原核表达的高纯度活性E DIII蛋白作为ELISA包被蛋白，每孔加入100--L含0.5ug/ml的E DIII蛋白的包被液，室温作用30min后4°C过夜，PBST洗三次，37°C封闭2h，然后加入待检的稀释10000倍的鸭坦布苏病毒血清，每孔100--L，室温作用0.5h，PBST洗板3次后加入100--L 1:5000稀释的兔抗鸭酶标二抗，室温0.5h，PBST洗板3次，最后加入100--Llmg/mLTMB底物，室温作用15min后加入终止液，酶标仪中测定0D450值。反应同时设阳性和阴性对照，阴性阳性的判定标准为当0D450检测值-阴性对照均值/阳性对照均值-阴性对照均值，所得比值大于等于0.2为阳性，小于等于0.2为阴性。
[0009]本发明提供的ELISA检测试剂盒，其特征在于:
所用的ELISA板为用10mL含0.5mg/mL鸭坦布苏病毒E D III蛋白的包被液室温作用30min后4°C包被过夜，PBST洗板3次，加入封闭液，37°C封闭2h的酶标板。
[0010]所用包被液为含15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.6 的溶液。
[0011]所用PBST 为每 100mL 溶液含 8g NaCl,0.2g KCl, 2.9g Na2HP04.12H20, 0.2gKH2PO4j 0.5mL tween-20 0
[0012]所用底物缓冲液为每500mL溶液含14.2g柠檬酸，10.5g Na2HPO4.12H20。
[0013]所用底物溶液为TMB母液(0.Ig/1OOmL无水乙醇)1mL,底物溶液90mL，H2O2 750uL临用前配制而成。
[0014]所用封闭液为含1%BSA的PBST。
[0015]所用酶标二抗是以PBST 1: 5000稀释。
[0016]所用阳性血清对照标准品为使用鸭坦布苏病毒纯化E DIII蛋白经过四次免疫新西兰大白兔制备而成，作为标准阳性血清_20°C分装保存备用。
[0017]所用阴阳性结果判定:当0D450检测值-阴性对照均值/阳性对照均值-阴性对照均值，所得比值大于等于0.2为阳性，小于等于0.2为阴性。
[0018]本发明的有益效果: 在筛选DTMUV抗原表位核心区域的基础上，建立了高敏感性、准确性和操控性强的间接ELISA检测方法，为有效预防和控制DTMUV的传播提供强有力的工具和技术支撑。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1.E蛋白3D结构示意图，
其中D I为左端浅灰区域，D II为中段深灰区域，D III为右端黑色区域；
图2.鸭坦布苏病毒诱导表达图，
其中:M: Markers, I:未诱导上清，2:未诱导沉淀，3:0.2mM IPTG 18 V过夜(上清);4:0.2mM IPTG 18 °C 过夜(沉淀)；5:0.2mM IPTG 25 °C过夜(上清)；6:0.2mMIPTG 25 °C 过夜(沉淀)；7:0.2mM IPTG 30 °C过夜(上清)；8:0.2mM IPTG 30 °C过夜(沉淀)9:0.2mM IPTG 37 °C (上清)5h ; 10:0.2mM IPTG 37 °C 5h (沉淀)；
图3.鸭坦布苏病毒E D III蛋白纯度鉴定，
其中:M: Markers，1，2均为E D III蛋白纯化产物。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例，进一步阐明本发明有关内容。下列实例中未注明的具体试验方法，通常按照分子克隆实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商提供的条件。
[0021 ] 实施例1抗原蛋白的获得
鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域(以下简称E D III)的表达，是在确定核心抗原域的基础上，首先设计鸭坦布苏病毒E蛋白DIII的PCR扩增表达引物E Dili exp-1: 5’_CATGCCATGGAAAGGCATGACCTACCCGATGTG-3’(包含NcoI 酶切位点)，E Dili exp-2: 5’-CCGCTCGAGACTTCTATGCCACTGGTACCT-3’ (包含XhoI酶切位点)，用于鸭坦布苏病毒E D III的克隆。采用NcoI和XhoI双酶切PCR产物后，连入同样双酶切的pET32a中，构建重组表达质粒pET32a/E D III，然后转化大肠杆菌表达菌株Rosetta garni B (DE3)进行E DIII的高效活性表达。SDS-PAGE结果显示，当温度为18 V，IPTG浓度为0.2mM过夜诱导培养时，实现了 E DIII蛋白的高效可溶性表达，蛋白表达量可占到菌体总蛋白的42%，并且蛋白具有天然活性。
[0022]本发明所述的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域的表达还包括表达蛋白的高纯度制备。菌体进行超声破碎，收集上清蛋白，选用镍柱进行纯化。首先用含50mM Tris和300mMNaCl (pH值8.0)的缓冲液平衡柱体，然后以合适的速度使上清蛋白经过柱体，最后用不同浓度的咪唑进行梯度洗脱，洗脱液为50mM Tris,300mM NaCl和O mM、20mM、40 mM、50 mM、250mM不同浓度的Imidazole (pH值8.0),收集洗脱的蛋白在20mM Tris (pH7.4 )的条件下透析。最终获得纯度为90%的高纯度蛋白。
[0023]实施例2
鸭坦布苏病毒E DIII间接ELISA方法抗原最佳包被浓度、最佳血清稀释度、抗原最佳包被条件、酶标二抗的工作浓度和时间通过以下方式获得:
(O抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定
抗原与血清的浓度确定采用方阵滴定法。用20mM Tris(pH7.4 )对E DIII抗原蛋白进行倍比稀释，终浓度分别为 I U g/ml, 0.5 μ g/ml, 0.25 μ g/ml, 0.125 μ g/ml,每孔 100 μ L 横向包被酶标板，4°C过夜。然后使用PBST液洗三次，加入封闭液，37°C封闭2h。阴阳性血清从1:2000开始进行酶标板纵向的倍比稀释，稀释度分别为1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:16000,每孔加100--L，室温作用0.5h，PBST洗板3次。然后加入2000倍稀释羊抗鸭酶标二抗酶标二抗100--L，室温0.5h，PBST洗板3次，最后加入100--Llmg/mL TMB底物，室温作用15min后加入终止液，在酶标仪中测定0D450值。根据P/N值最终确定抗原的最佳包被浓度和阴阳性血清的最佳稀释度。当抗原浓度为0.5 μ g/ml，血清稀释度1:10000时，阳性血清的0D450值为1.0303 1)，阴性为0.1597，P/N值最大为6.4493 (见下表)。因此0.05 μ g抗原为包被最佳浓度，血清1:10000稀释是最佳稀释浓度。
[0024]滴定方阵OD值
【权利要求】
1.一种高效活性表达的鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域表达蛋白在鸭坦布苏病毒的ELISA检测方法中的应用，鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域碱基序列如序列表中序列I所/Jn ο
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域表达蛋白是通过以下步骤得到的: 设计鸭坦布苏病毒E蛋白D III的PCR扩增表达引物:
E D III exp-1: 5’-CATGCCATGGAAAGGCATGACCTACCCGATGTG-3’，
E D III exp-2: 5’-CCGCTCGAGACTTCTATGCCACTGGTACCT-3’， 用于鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原基因的克隆，采用NcoI和XhoI双酶切PCR产物后，连入同样双酶切的质粒中，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌表达菌株进行活性表达。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于大肠杆菌表达菌株在18V, IPTG浓度为0.2mM过夜诱导培养。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于对大肠杆菌菌体进行超声破碎，收集上清蛋白，选用镍柱进行纯化得到鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域的高纯度表达蛋白。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于首先用pH值为8.0、含50mMTris和300mMNaCl的缓冲液平衡柱体，然后使上清蛋白经过柱体，最后用咪唑进行梯度洗脱，洗脱液为50mM Tris,300mM NaCl 和浓度分别为 O mM、20mM、40 mM、50 mM、250mM 的咪唑，pH值为 8.0，收集洗脱的蛋白在PH7.4、20mM Tris的条件下透析，获得纯度为90%的高纯度蛋白。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于鸭坦布苏病毒E蛋白核心抗原域表达蛋白作为ELISA包被蛋白，用于鸭坦布苏病毒的ELISA检测。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于ELISA包被蛋白的包被浓度为0.5mg/mL。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所用的ELISA板为用10uL含0.5mg/mL鸭黄病毒E D III蛋白的包被液室温作用30min后4°C包被过夜，PBST洗板3次，加入封闭液，37°C封闭2h的酶标板。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所用包被液为含15mMNaCO3, 35mMNaHCO3, pH 9.6 的溶液；所用 PBST 为每 100mL 溶液含 8gNaCl，0.2gKCl, 2.9gNa2HP04.12H20, 0.2g KH2PO4, 0.5mL tween-20 ;所用底物缓冲液为每 500mL 溶液含 14.2g 柠檬酸，10.5g Na2HPO4.12H20 ;所用底物溶液为0.1g/1OOmL无水乙醇1mL,底物溶液90mL，H2O2 750uL临用前配制而成；所用封闭液为含1%BSA的PBST;所用酶标二抗是以PBST 1:5000稀释。
【文档编号】G01N33/68GK104198736SQ201410445731
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月3日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】张琳, 黄庆华, 张秀美, 许传田, 杨少华, 黄艳艳 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所