一种应用于蛋白芯片定量检测的阳性参照及制备方法
【专利摘要】一种应用于蛋白芯片定量检测的阳性参照，于生物芯片上依次为：1)FLAG包被抗体；2)HA-FLAG多肽；3)HA生物素标记抗体。本发明还公开了制备上述阳性参照的方法。本发明能表征从抗原与抗体反应到显色整个实验成功与否，并做为参比物质对血清中的目标物进行定量分析，解决了以往方法存在的可靠性差及无法标准化的缺陷。
【专利说明】一种应用于蛋白芯片定量检测的阳性参照及制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种应用于蛋白芯片定量检测的阳性参照。
[0002]本发明还涉及制备上述阳性参照物的方法。
【背景技术】
[0003]蛋白芯片的技术原理最早由Roger Ekin在上世纪80年代就已提出，它将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面形成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子准确、快速、大信息量的检测。蛋白芯片技术主要用于基于芯片的蛋白质组学研究，其特点是高通量，即在一个只有几十平方毫米的片基上标记成千上万种蛋白质用于检测其他目的蛋白。其基本原理就是利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点，将游离的杂蛋白和结合于固相载体的目的蛋白分离，并利用特殊的标记物对其进行定量分析。蛋白芯片有着广泛的应用范围，包括，药物筛选，疾病诊断治疗、司法鉴定等领域。
[0004]现有的生物芯片检测方法包括发光检测方法和非发光检测方法两类，最广泛应用的还是发光检测方法，其中又主要包括荧光检测法、化学发光检测法和复合光照射检测法。而近年发展起来的化学发光检测法因其快速、精确、重现性好及试剂安全无毒的特点，显示出很好的应用前景。用化学发光检测法对目标物进行检测时，为了降低背景值以及实验体系对目标检测物定量的影响，一般要设置一个参照点，将测得的目标物的发光值与参照点的发光值相比得到相对值。
[0005]目前蛋白芯片参照点通常是将某种(些)特异的蛋白直接进行酶标记或者生物素标记等直接包被于芯片表面。这类参照点的作用是用来指示化学发光反应的正常进行，或者对芯片点样位置进行确定。这类参照点尽管也曾被用于作为待测物质的参比点。但由于结合不牢固，容易被洗液冲洗掉，影响了对目标物定量的准确性。而且这类参照点只能表征杂交反应中从生物素与辣根过氧化物酶(HRP)反应到显色反应，无法表征抗原-抗体的反应，也影响了对目标物定量的准确性。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种应用于蛋白芯片定量检测的阳性参照。
[0007]本发明的又一目的是提供一种制备上述阳性参照物的方法
[0008]为实现上述目，本发明提供的应用于蛋白芯片定量检测的阳性参照，于生物芯片上依次为:
[0009]I) FLAG 包被抗体；
[0010]2) HA-FLAG 多肽；
[0011]3)HA生物素标记抗体。
[0012]本发明提供的制备上阳性参照的方法:
[0013]a)将FLAG包被抗体固定于生物芯片上；
[0014]b)在生物芯片上加入含有多肽的样品和各个浓度梯度的标准抗原；
[0015]c)除去抗原物质，除去非特异性结合的物质；
[0016]d)加入生物标记抗体；
[0017]e)除去多余的抗体。
[0018]其中，FLAG包被抗体以矩阵形式固定于生物芯片上。
[0019]其中，为FLAG包被抗体为AFP、CEA、t-PSA以及Flag包被抗体。
[0020]其中，HA-FLAG多肽的基础序列为:YPYDVPDYA-C-C-C-C-C-C-DYKDDDDK。
[0021]本发明的阳性参照可以监控蛋白芯片免疫反应的每个阶段，与样本检测同步，有效的降低了人为操作或仪器误差给蛋白芯片检测带来的误差。
【具体实施方式】
[0022]本发明提供的应用于蛋白芯片定量检测的阳性参照，是利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点，在样品中(特别是血清)混入一种人工合成的多肽，将多肽与抗体物质结合的发光值作为参照，用测得的目标物发光值与其比较，得到相对值，以此进行样品中目标物的定量分析。
[0023]本发明的的阳性参照包括以下几个部分:
[0024]I) FLAG 包被抗体；
[0025]2) HA-FLAG 多肽，其基础序列为:YPYDVPDYA-C-C-C-C-C-C-DYKDDDDK
[0026]3) HA生物素标记抗体
[0027]由以上三种组成一个“三明治”的复合物。
[0028]本发明举实施例来进一步说明本发明，但本发明保护范围不限于下述实施例。
[0029]1、检测血清中肿瘤标志物AFP、CEA、t-PSA的浓度
[0030]a)将AFP、CEA、t_PSA包被抗体以及Flag包被抗体用点样仪以矩阵形式固定于生物芯片上；
[0031]b)在封闭好的芯片上加入含有人工合成多肽的血清样品和各个浓度梯度的标准抗原，反应1-1.5小时；
[0032]c)除去抗原物质，用洗液(1XTBS/1%甘油/0.1 % BSA/0.05%吐温)除去非特异性结合的物质；
[0033]d)加入生物标记的AFP、CEA、t-PSA抗体以及HA抗体，反应25_40min ；
[0034]e)用洗液(1XTBS/1%甘油/0.1% BSA/0.05%吐温)除去多余的抗体；
[0035]f)加入 HRP (1/10000)，反应 30min ；
[0036]g)用洗液(1XTBS/1%甘油/0.1% BSA/0.05%吐温)除去多余的HRP ；
[0037]h)加入发光液，显色；
[0038]i)收集AFP、CEA、t-PSA发光值以及阳性参照点发光值；
[0039]j)将AFP、CEA、t-PSA发光值除以阳性参照发光值，得到CEA的相对值；
[0040]k)将AFP、CEA、t_PSA各个浓度标准抗原的相对发光值与理论浓度做成标准曲线，然后将血清中AFP、CEA、t-PSA的相对值带入血清中，得到中AFP、CEA、t_PSA在血清中的浓度。
[0041]本发明的特点在于，经过Blast比对后，没有发现人体蛋白质组中有与其同源的蛋白，不易被血清中的酶类降解，由人工合成纯化后纯度能达到95%以上，价格较低，能够表征从抗原与抗体反应到显色整个实验成功与否，并做为参照点对血清中的目标物进行定量分析，解决了以往方法存在的可靠性差及无法标准化的缺陷，以实现免疫杂交技术在体外诊断中的成功应用。
[0042]通过表1和表2的对比数据可以看出，以HA-FLAG为参照点所测得的数据从准确性和重复性两方面都要优于C-myc带有生物素的蛋白，说明以HA-FLAG为参照点监控整个免疫杂交过程，这样的参照点所测出的数据稳定性较好，准确性较高。
【权利要求】
1.一种应用于蛋白芯片定量检测的阳性参照，于生物芯片上依次为: DFLAG包被抗体；
2)HA-FLAG 多肽； 3)HA生物素标记抗体。
2.根据权利要求1所述的阳性参照，其中，FLAG包被抗体以矩阵形式固定于生物芯片上。
3.根据权利要求1或2所述的阳性参照，其中，为FLAG包被抗体为AFP、CEA、t-PSA以及Flag包被抗体。
4.根据权利要求1所述的阳性参照，其中，HA-FLAG多肽的基础序列为:YPYDVPDYA-C-C-C-C-C-C-DYKDDDDK。
5.制备权利要求1所述阳性参照的方法: a)将FLAG包被抗体固定于生物芯片上； b)在生物芯片上加入含有多肽的样品和各个浓度梯度的标准抗原； c)除去抗原物质，除去非特异性结合的物质； d)加入生物标记抗体； e)除去多余的抗体。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，FLAG包被抗体以矩阵形式固定于生物芯片上。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，为FLAG包被抗体为AFP、CEA、t-PSA以及Flag包被抗体。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，HA-FLAG多肽的基础序列为:YPYDVPDYA-C-C-C-C-C-C-DYKDDDDK。
【文档编号】G01N33/68GK104198738SQ201410471782
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】丁立功, 马君兰, 臧百盛, 宫晓艳 申请人:北京九州泰康生物科技有限责任公司