一种改良的胱抑素c检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种定量检测胱抑素C（胱抑素C）的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1主要由缓冲液1、稳定剂1、防腐剂1、EDTA、增凝剂和保护剂1组成；所述试剂R2主要由交联胱抑素C抗体的聚苯乙烯胶乳微球、缓冲液2、稳定剂2、防腐剂2、保护剂2组成，其中聚苯乙烯胶乳微球与胱抑素C抗体之间以共价交联方式连接。本发明检测试剂盒制备成本低廉，稳定性好，易于保存，数据重复性好，检测灵敏度高，可广泛应用于临床生化仪。
【专利说明】一种改良的胱抑素C检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种改良的胱抑素C检测试剂盒及其制备 方法和用途。
【背景技术】
[0002] 临床评价肾脏疾病进展和严重程度，一般以肾功能为参考，肾功能一般以肾小球 滤过率（GFR)反映。它是反映肾功能最重要的指标。根据肾小球滤过率（GFR)标志物来 源，分外源性和内源性。外源性标志物包括菊粉（inulin)、碘海醇（i〇heX〇l)、51Cr-EDTA、 99mTc-DTPA等。内源性标志物包括血清肌酐（Scr)、尿素（Urea)、P 2-微球蛋白（@ 2-M)、 ￠-痕迹蛋白（BTP)以及血清胱抑素C(Cystatin C，Cys C)。
[0003] 胱抑素C(Cystatin C，Cys C)，又名Y 2痕迹碱性蛋白或后Y球蛋白，是半胱氨 酸蛋白酶抑制剂蛋白质中的一种。编码Cys C的基因属于管家基因，能在所有的有核细胞 内以恒定速度持续转录与表达，无组织特异性，故Cys C可在体内以恒定速度产生，并存在 于各种体液之中，尤以脑脊液和精浆中含量为高，尿液中最低，不受年龄、性别、体重、炎症 等因素影响。胱抑素C分子量小（13KD)，生理条件下带正电荷，能自由从肾小球滤过，完全 被肾小管上皮细胞重吸收并于细胞内降解，不重新回到血液中，同时肾小管上皮细胞也不 分泌Cys C至管腔内，因此，其血清浓度主要由GFR决定。近年来有许多试验证明胱抑素C 是迄今基本满足理想内源性GFR标志物要求的内源性物质。是新近发展起来的评估肾功能 的一种敏感性好、特异性高的指标。Cystatin C在一系列生理病理过程中也发挥着作用，有 重要的临床意义。
[0004] 目前临床对胱抑素C的检测，主要通过免疫学的方法，借助抗原抗体特异性的结 合，以双抗夹心的方式定量检测血清中胱抑素C的含量。具体的检测方法包括酶联免疫吸 附测定法、化学发光法和免疫比浊法。酶联免疫吸附测定法和化学发光法由于操作繁琐、耗 时长、费用高等不足，限制了其广泛应用。而免疫比浊法随着全自动生化仪的普及和多种快 速免疫比浊检测技术的发展，拥有反应时间短，精密度好，检测范围宽，黄疸、溶血和脂血标 本影响小，易于自动化等优点，已成为临床胱抑素C的主流检测方法。
[0005] 但是，由于免疫比浊法的检测原理缺乏酶促放大反应，导致现有的胱抑素 C免疫 比浊检测试剂盒不给避免的出现灵敏度较低等不足。同时，在试剂盒制备过程中，为保证产 品达到所需灵敏度，较酶联免疫吸附测定法和化学发光法，其对所用抗体的质量要求更高， 包被量和抗体使用量更大，增加了试剂盒的成本。且目前广泛使用的鼠单克隆抗体、兔多克 隆抗体或羊多克隆抗体由于自身属性，在使用过程中都不可避免的会受到类风湿因子和异 嗜性抗体等的干扰，影响最终的检测结果。
[0006] 卵黄抗体（Egg yolk antibodies, eyAb)，也称卵黄免疫球蛋白（Egg yolk immunoglobulin, IgY)，是一种从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，与传统鼠单克 隆抗体、兔多克隆抗体或羊多克隆抗体相比，卵黄抗体具有以下优点：⑴产量高，免疫时间 短，易于大量制备；⑵物理性质稳定性强；⑶与哺乳动物种系差别大，可识别更多表位；⑷ 特异性强，同一家族抗原无交叉反应；(5)干扰小，不能识别哺乳动物体内的补体和人Fe受 体，不会和类风湿因子及HAM(人抗鼠抗体）反应。由于其自身优点突出，IgY抗体将来有 望越来越多的进入诊断试剂的领域，在诊断试剂的开发中发挥更加重要的作用。
【发明内容】
[0007] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供提供一种改良的胱抑素 C 检测试剂盒，该试剂盒与现有胱抑素C检测试剂盒相比，能进一步提高血清中胱抑素C的检 测灵敏度，不受类风湿因子和异嗜性抗体的干扰，具灵敏度高，特异性好、线性范围宽和稳 定性佳的特点，且成本更低，易于推广使用。
[0008] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种定量检测胱抑素 C的胶乳增强 免疫比浊试剂盒，包括彼此独立的试剂Rl和试剂R2,所述试剂Rl主要由缓冲液1、稳定剂 1、防腐剂1、EDTA、增凝剂和保护剂1组成；所述试剂R2主要由交联胱抑素 C抗体的聚苯乙 烯胶乳微球、缓冲液2、稳定剂2、防腐剂2、保护剂2组成，其中聚苯乙烯胶乳微球与胱抑素 C抗体之间以共价交联方式连接。
[0009] 本发明中的防腐剂1和2是指可以抑制试剂中细菌和微生物污染的一类试剂，对 试剂具有防腐杀菌的作用。试剂R2中的保护剂2是一类能够保护胶乳颗粒表面的抗体的 试剂。稳定剂1和2可以保持试剂内的电荷平衡。
[0010] 本技术方案中的胱抑素C胶乳增强免疫比浊试剂盒，将胱抑素C抗体交联在聚苯 乙烯胶乳微球表面，当血液中的胱抑素C与胱抑素C抗体反应时，带动聚苯乙烯胶乳微球聚 集产生一定浊度，而浊度与血液中的胱抑素C含量在一定范围成正比，可以用全自动生化 仪在400-800nm波长下检测血液中胱抑素C的含量。
[0011] 优选地，所述试剂Rl中的缓冲液1选自Ifepes缓冲液、TriS-HCl缓冲液、MOPS缓 冲液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼砂缓冲液中的任意一种或多种的组合，其pH为7. 0? 9. 0,浓度为25?500mmol/L ;所述试剂R2中的缓冲液2选自PBS缓冲液、硼砂缓冲液、甘 氨酸缓冲液、Hepes缓冲液、GOODS缓冲液、MOPS缓冲液中任意一种或多种的组合，其pH为 7. 0 ?9. 0,浓度为 25 ?500mmol/L。
[0012] 优选地，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，本发明对所述试剂Rl中 的缓冲液1进行了改进，所述试剂Rl中的缓冲液1包括下列组分：水苏糖、明矾、果糖二磷 酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度 为3. 5 - 7. 5g/L，生物缓冲液1的pH值为7. 2 - 7. 6。
[0013] 优选地，各组分在缓冲液1中的浓度为：
[0014]
【权利要求】
1. 一种胱抑素C检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2,所述试剂R1主要由 缓冲液1、稳定剂1、防腐剂1、EDTA、增凝剂和保护剂1组成；所述试剂R2主要由交联胱抑 素C抗体的聚苯乙烯胶乳微球、缓冲液2、稳定剂2、防腐剂2、保护剂2组成，其中聚苯乙烯 胶乳微球与胱抑素C抗体之间以共价交联方式连接。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的缓冲液1选自Hepes 缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼砂缓冲液中的任意一 种或多种的组合，其pH为7. 0?9. 0,浓度为25?500mmol/L ;所述试剂R2中的缓冲液2 选自PBS缓冲液、硼砂缓冲液、甘氨酸缓冲液、Hepes缓冲液、GOODS缓冲液、MOPS缓冲液中 任意一种或多种的组合，其pH为7. 0?9. 0,浓度为25?500mmol/L。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的缓冲液1包括下列组 分：水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六 偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3. 5 - 7. 5g/L，生物缓冲液1的pH值为7. 2 - 7. 6。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的稳定剂1选自KC1、 似(：1、0&(：12中的任意一种或多种的组合，其质量浓度为0.5%?10% ;所述试剂1?2中的 稳定剂2采用离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用；其中离子稳定剂为NaCl、KC1、Na2C03、 Na2S04或者K2S04,悬浮稳定剂为PEG8000、鹿糖、甘油或者葡萄糖。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的防腐剂1为叠氮钠、硫 柳汞或者ProClin300 ;所述试剂R2中的防腐剂2为叠氮钠、硫柳汞或ProClin300。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的增凝剂为PEG8000或 者葡聚糖。
7. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的聚苯乙烯乳胶微球 的表面官能团为氨基、羧基、酰肼、醛基或环氧基，聚苯乙烯乳胶微球的的粒径在100? 600nm〇
8. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的保护剂1为牛血清白 蛋白；所述试剂R2中的保护剂2为牛血清白蛋白。
9. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的EDTA的浓度为10? 100mmol/L〇
10. 根据权利要求1?9任一权利要求所述的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在 于，具体包括如下步骤： (1) 试剂R1的制备： 在缓冲液1中加入稳定剂1、增凝剂、防腐剂1、保护剂1和EDTA，搅拌混合均匀，即得试 剂R1 ; (2) 试剂R2的制备： 步骤一：将胱抑素C抗体进行4°C透析，再用缓冲液2将胱抑素C抗体稀释至2mg/ml， 得到胱抑素C抗体稀释液；将聚苯乙烯胶乳微球用蒸馏水离心、洗涤3次； 步骤二：用缓冲液2将经过步骤一洗涤后的聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1%， 再加入质量浓度为〇. 01 % _〇. 1 %的EDC，在室温下搅拌反应30min，反应结束后15000rpm 离心洗涤以除去未反应的EDC，然后加入步骤一得到的胱抑素C抗体稀释液，室温下搅拌反 应30min，再加入终止液终止反应，将得到的反应液15000rpm离心，用缓冲液2洗漆沉淀，重 复离心洗涤3次，最后加入缓冲液2、防腐剂2、稳定剂2、保护剂2搅拌混合均匀即得试剂 R2。
【文档编号】G01N33/531GK104360081SQ201410735830
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】李元丽 申请人:重庆中元生物技术有限公司