一种猪传染性胸膜肺炎抗体检测用抗原及制备方法
【专利摘要】本发明的目的是为猪群的猪传染性胸膜肺炎抗体检测提供一种检测用抗原及制备方法。本发明中抗原是从猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1～15型菌株培养物中提取的多糖抗原，为菌体分泌多糖，具有很强的特异性和敏感性，能真实的检测出猪传染性胸膜肺炎抗体；本发明中抗原标准浓度临界值的确定，为酶联免疫吸附试验检测和间接血凝试验检测提供了保障；操作简单、方便快速，无需特殊设备和仪器，适合在基层推广应用。
【专利说明】-种猪传染性胸膜肺炎抗体检测用抗原及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品【技术领域】，具体涉及一种猪传染性胸膜肺炎抗体检测用 抗原及制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actionobacillus pleuropneumoniae，AP巧引起猪的一种呼吸系统重要传染病。本病主要是引起猪的一种伴 有胸膜炎的纤维素性、出血性、坏死性肺炎，多呈最急性或急性病程而迅速致死，发病率和 死亡率均在50% W上，它可发生于任何年龄的猪只，猪传染性胸膜肺炎在世界各国均有发 生，阳性率逐年在上升，近年来几乎全国各国各省均有本病发生的报道。尤其在集约化养猪 场，一旦发生会造成重大经济损失。（进口猪嗜血杆菌胸膜肺炎血清学检查中国畜禽传染 病1988(1)31?32 ;陈小玲，杨旭夫，朱±盛.猪传染性胸膜肺炎的流行现状和措施.中 国兽医杂志，2001, 37:33-35 ;Nicolet J. Taxonomy and serological identification of Actionobacillus pleuropneumoniae. Can Vet, 1988, 29:578-580)。根据细菌芙膜多糖和 脂多糖（LP巧抗原对血清的反应，可将生物I型分为12个血清型；生物II型至少有3个血 清型（本病至今已有15个血清型），现有的而各型毒力有所差异，型间交叉保护性极差或缺 少。由于本病病原的血清型众多，给本病的预防和控制带来了一定的难度，该就要求加强口 岸检疫和猪群抗体的检测；因此血清学抗体检测是最重要的诊断方法之一。但由于APP各 型之间缺少交叉保护，如果将每个样本都进行15个血清型的检测，操作繁琐，工作量大，难 W实施，不能满足临床检测需求。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是为猪群的猪传染性胸膜肺炎抗体检测提供一种检测用抗原及制 备方法，从而克服现有检测抗原的不足。
[0004] 本发明所提供的猪传染性胸膜肺炎抗体检测用抗原，为猪传染性胸膜肺炎1?15 型的混合抗原；
[0005] 本发明的抗原优选为从猪胸膜肺炎放线杆菌1?15型菌株培养物中提取的多糖 抗原；采用W下步骤制备：
[0006] 1)生产抗原用种子制备
[0007] 将APP1?15型冻干菌种分别划线接种于S琼脂平板上，置5%?10% C〇2条件 下，37C培养16?18小时，分别挑选菌落接种5?6日龄SPF鸡胚卵黄囊内，在37C继续 赔育，收集30小时内死亡的鸡胚卵黄液作为一级种子；再分别取各型菌株一级种子划线接 种S琼脂平板，在含5%?10% C〇2条件下37C培养16?18小时后，挑选菌落或菌苔接种 于S肉汤培养基中，置37C振荡培养10?12小时制成二级种子；
[0008] 2)菌液的培养
[0009] 将各型菌株的二级种子按3%接种到S肉汤中进行扩大培养，37C振荡培养10? 12小时，收获菌液；将各型菌液按终浓度为0. 5 %加入甲酵溶液，37°C振荡灭活24小时，灭 活，将菌液5000r/min离也20min去上清，将沉淀的菌体用抑6. 4PBS洗涂2次，将沉淀的 菌体用P册.4PBS稀释，稀释后将各型菌液置于-2(TC W下反复冻融3?5次，然后进行冰 浴超声裂解，间歇破碎5min，W 8000r/min离也30min，各型上清液分别用0. 22 y m滤膜无 菌抽滤，收集于无菌瓶内，其滤液即为猪传染性胸膜肺炎1?15型单型诊断用抗原液；将 APP1?15型标准浓度抗原等量混合，即成为1个光吸收单位的标准浓度多型混合抗原。
[0010] 所述的S琼脂，其制备方法如下；取鸡肉汁100ml，膜蛋白腺血琼脂基质3g，多聚 蛋白腺0. 5g，加热溶解后调抑值至7. 2?7. 4,115C灭菌30分钟，待冷至55C左右，加入 灭活鸡血清5ml，1 %辅酶I 1ml。
[0011] 所述的S肉汤，其制备方法如下；取鸡肉汁100ml，多聚蛋白腺0. 5g，膜蛋白腺 0. 5g，氯化轴0. 5g，加热溶解后调抑值至7. 2?7. 4,115°C灭菌30分钟，待冷至55°C左右， 加入灭活的鸡血清5ml，1 %辅酶I 1ml。
[0012] 本发明中抗原是从猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1?15型菌株培养物中提取的多 糖抗原，为菌体分泌多糖，具有很强的特异性和敏感性，能真实的检测出猪传染性胸膜肺炎 抗体；本发明中抗原标准浓度临界值的确定，为酶联免疫吸附试验检测和间接血凝试验检 测提供了保障；操作简单、方便快速，无需特殊设备和仪器，适合在基层推广应用；本发明 是目前国内唯一可W用于酶联免疫吸附试验和间接血凝试验检测的诊断抗原。而本发明基 于稳定性好、特异强、敏感性高等突出优点的同时，还能用于酶联免疫吸附试验和间接血凝 试验检测方法中，且检测效果均良好，能够在临床检测上得到更好的应用。
【具体实施方式】
[0013] 本发明提供一种可同时应用猪传染性胸膜肺炎酶联免疫吸附试验和间接血凝试 验应用免疫原性良好的APP1?15型菌株制备，按本发明能制备出稳定性好、特异强、敏感 性高的APP1?15型混合抗原，本发明抗原主要优点还可同时进行猪传染性胸膜肺炎酶联 免疫吸附试验和间接血凝试验，本发明要解决的技术问题在于克服现有检测抗原的不足， 现有的检测用抗原仅能应用一种检测方法，而本发明抗原可同时用于猪传染性胸膜肺炎酶 联免疫吸附试验和间接血凝试验检测，无论应用哪一种检测方法进行检测，本发明抗原检 测效果均良好。该方法的建立还可满足抗体检测快速、准确，为进出口种猪抗体检测提供保 障。
[0014] 本发明的抗原的制备方法如下：
[0015] 1生产抗原用种子制备
[001引1. 1鸡肉汤琼脂（简称S琼脂）巧IJ备取鸡肉汁100ml，膜蛋白腺血琼脂基质3g，多 聚蛋白腺0. 5g，加热溶解后调抑值至7. 2?7. 4,115°C灭菌30分钟，待冷至55°C左右，按 无菌要求加入灭活鸡血清5ml，1 %辅酶I (NADH) 1ml。
[0017] 1. 2 -级种子繁殖与鉴定将APP1?15型冻干菌种划线接种于S琼脂平板上，置 5%?10% C〇2条件下，37C培养16?18小时，挑选5个W上具有虹彩光泽的典型菌落（或 菌苔），接种5?6日龄SPF鸡胚卵黄囊内，在37°C继续赔育，收集30小时内死亡的鸡胚卵 黄液，经纯粹检验合格后，作为一级种子。-2(TC保存，使用期应不超过1个月；-7(TCW下保 存，使用期应不超过3个月，在培养基上继代应不超过6代。
[0018] 1. 3二级种子繁殖取各型菌株一级种子，划线接种S琼脂平板，在含5 %?10 % 0)2 条件下，37C培养16?18小时，挑选具有虹彩光泽的典型菌落或菌苔，接种于S肉汤培养 基中，置37C振荡培养10?12小时，经纯检合格后，即为二级种子。2?8C保存，应不超 过24小时。
[001引 2菌液的培养
[0020] 2. 1鸡肉汤培养基（简称S肉汤）巧IJ备取鸡肉汁100ml，多聚蛋白腺0. 5g，膜蛋白 腺0. 5g，氯化轴0. 5g，加热溶解后调抑值至7. 2?7. 4,115°C灭菌30分钟，待冷至55°C左 右，按无菌要求加入灭活的鸡血清5ml，1 %辅酶I (NADH) 1ml。
[0021] 2. 2培养方法将纯检合格的各型菌株的二级种子按3%接种到S肉汤中进行扩大 培养，37C振荡培养10?12小时，收获菌液进行纯粹检验。
[0022] 2. 3纯粹检验将培养物涂片进行革兰氏染色镜检，应纯粹。
[0023] 3菌液处理将各型菌液按终浓度为0. 5%加入甲酵溶液，37C振荡灭活24小时，灭 活检验合格后，将菌液5000r/min离也20min去上清，将沉淀的菌体用抑6. 4PBS洗涂2次， 将沉淀的菌体用P册.4PBS稀释，按比浊法测定，每毫升含菌量约为90亿。稀释后将各型菌 液置于-2(TC W下反复冻融3?5次，然后进行冰浴超声裂解，间歇破碎5min，W 8000r/min 离也30min，各型上清液分别用0. 22 y m滤膜无菌抽滤，收集于无菌瓶内，其滤液即为猪传 染性胸膜肺炎1?15型单型诊断用抗原液。
[0024] 4各型抗原最佳浓度标定将APP1?15型抗原液分别按适宜比例稀释，在紫外分光 光度计波长260nm处测定其浓度（W光吸收单位表示），然后将各单型抗原用P册.4PBS稀 释成1个光吸收单位，作为各型抗原的标准浓度。
[00巧]5APP1?15型混合抗原的配制将APP1?15型标准浓度抗原等量混合，即成为1 个光吸收单位的标准浓度多型混合抗原。
[002引 6成品检验
[0027] 【性状】对制备的3批猪传染性胸膜肺炎诊断抗原进行了性状检测，结果均为无色 透明液体。
[0028] 【无菌检验】对本发明所制备的3批猪传染性胸膜肺炎诊断抗原按2010年版《中 国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。
[0029] 【效价测定】我们对所抽取的诊断用抗原，进行了 ELISA、间接血凝（IHA)效价的测 定，达不到要求全部报废。对制备的3批猪传染性胸膜肺炎诊断抗原进行了检测，结果均符 合要求。详见表1。
[0030] 表1 ;3批诊断抗原效价测定结果
[0031]
【权利要求】
1. 一种猪传染性胸膜肺炎抗体检测用抗原，其特征在于，所述的抗原为猪传染性胸膜 肺炎1?15型的混合抗原。
2. 如权利要求1所述的抗原，其特征在于，所述的抗原为从猪胸膜肺炎放线杆菌1? 15型菌株培养物中提取的多糖抗原。
3. 权利要求1所述的抗原的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤： 1) 生产抗原用种子制备 将APP1?15型冻干菌种分别划线接种于S琼脂平板上，置5%?10% 0)2条件下，37°C 培养16?18小时，分别挑选菌落接种5?6日龄SPF鸡胚卵黄囊内，在37°C继续孵育，收 集30小时内死亡的鸡胚卵黄液作为一级种子；再分别取各型菌株一级种子划线接种S琼脂 平板，在含5%?10% C02条件下37°C培养16?18小时后，挑选菌落或菌苔接种于S肉汤 培养基中，置37°C振荡培养10?12小时制成二级种子； 2) 菌液的培养 将各型菌株的二级种子按3%接种到S肉汤中进行扩大培养，37°C振荡培养10?12小 时，收获菌液；将各型菌液按终浓度为〇. 5%加入甲醛溶液，37°C振荡灭活24小时，灭活，将 菌液5000r/min离心20min去上清，将沉淀的菌体用pH6. 4PBS洗涤2次，将沉淀的菌体用 pH6. 4PBS稀释，稀释后将各型菌液置于-20°C以下反复冻融3?5次，然后进行冰浴超声裂 解，间歇破碎5min，以8000r/min离心30min，各型上清液分别用0? 22 y m滤膜无菌抽滤，收 集于无菌瓶内，其滤液即为猪传染性胸膜肺炎1?15型单型诊断用抗原液；将APP1?15 型标准浓度抗原等量混合完成制备。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的S琼脂，其制备方法如下：取鸡肉汁 100ml，胰蛋白胨血琼脂基质3g，多聚蛋白胨0. 5g，加热溶解后调pH值至7. 2?7. 4,115°C 灭菌30分钟，待冷至55 °C左右，加入灭活鸡血清5ml，1 %辅酶I lml。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的S肉汤，其制备方法如下：取鸡肉汁 100ml，多聚蛋白胨0. 5g，胰蛋白胨0. 5g，氯化钠0. 5g，加热溶解后调pH值至7. 2?7. 4， 115 °C灭菌30分钟，待冷至55 °C左右，加入灭活的鸡血清5ml，1 %辅酶I lml。
【文档编号】G01N33/531GK104502581SQ201410745717
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月7日 优先权日:2014年12月7日
【发明者】马爽, 范根成, 孙健, 宋新宇, 郭玉广, 郭莉莉, 胡潇, 程增青, 王红, 李金积 申请人:青岛易邦生物工程有限公司