生物载体及其在检测中的应用的制作方法
【专利摘要】一种生物载体，其表面具有识别并与目标分子结合作用的聚合物，作为载体颗粒应用于免疫比浊检测技术，实现待测样品中分子的定量检测。本发明提供的生物载体不仅制取方便、稳定性强、特异性高，且可以大量扩增，减少生产环节，显著降低生产成本，载体表面的抗原或抗体还使定量检测更准确。
【专利说明】生物载体及其在检测中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物检测载体的应用，尤其涉及一种利用展示技术获得的生物检 测载体在免疫比浊检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 为了辅助临床医生对某类疾病的判断，实现早发现早治疗，对症下药的防治目的， 首先需要对生物体各项生理指标进行检测，以作直观的了解。常用的检测方法如：生化检 测、微生物检测和特异性抗体检测等，也因此产生了众多针对各种病症的检测产品（也称： 试剂盒）。
[0003] 抗原或抗体的检测属于免疫学检测技术，根据检测标记物的不同，可以将检测方 法分为：酶联免疫检测、同位素免疫检测、胶体金免疫检测、荧光免疫检测和化学发光免疫 检测等，根据检测方式不同，又可以分为：免疫酶标板、免疫侧向层析试纸和免疫渗滤等方 法。除沉淀反应、凝集试验和补体结合试验等可用于特异性抗体检测以外，免疫测定技术已 成为一中广泛并常规应用的检测技术，其中酶联免疫吸附（Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)是目前应用最广泛的检测技术之一。
[0004] 对于检测多肽或蛋白类分子，限于酶联免疫吸附技术定量准确性差、操作时间长、 自动化程度低和干扰大等缺陷，其一般只能用于定性检测。为了实现目标蛋白的定量测定， 中国发明专利申请200910194749. 3公开一种半定量检测类风湿因子方法，以丙种球蛋白 通过物理吸附原理致敏在载体胶乳颗粒上，检测时用不同稀释度的待测血清与致敏胶乳颗 粒起凝集反应，实现对类风湿因子的半定量检测。中国发明专利申请201210545717. 5公 开了一种人胱抑素C化学发光定量检测方法，将磁微粒分离技术和酶促化学发光技术相结 合，采用双抗体夹心一步反应法原理，可用于血清、血浆和尿液样本中人胱抑素C的含量测 定。该技术中，将FITC抗体共价连接在含羧基的磁微粒的表面制得磁分离试剂。
[0005] 研究发现，当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适（一般规定抗体过 量）时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促凝剂（如：聚乙二醇）的作用下，自液 相析出，形成微粒。在沉淀反应中形成的复合物微粒具有特殊的光学性质，可用仪器检测， 提高了检测的速度、灵敏度和易操作性。这种以抗原和抗体结合动态测定的方法即为免疫 比浊检测技术（如：CN1556408A)，又被分为：免疫透射比浊法、免疫散射比浊法和免疫胶乳 比池法。胶乳颗粒增强比池法（particle-enhancedturbidimetricimmunoassay，PETIA) 也是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。
[0006] 如：中国发明专利申请200510096787. 7公开了一种用于免疫比浊定量检测的氨 基化高分子微球。将聚苯乙烯制成的种子微粒与氨基化单体进行化学反应，使种子微粒表 面接上氨基基团，在交联剂（戊二醛）的作用下与蛋白质交联而成稳定的交联产物。
[0007] 另如：中国发明专利申请200810084390.X公开了一种检测血清或血浆中胱抑素 C的胶乳增强型免疫比浊试剂盒，采用胶乳包被的抗胱抑素C的抗体，胶乳通过免疫反应一 层一层聚集形成不溶性免疫颗粒复合物，胶乳的粒径发生改变引起浊度明显变化，用光透 射强度或光散射强度检测该变化。
[0008] 再如：中国发明专利ZL201010140329.X公开了一种采用胶乳免疫比浊法检测纤 维蛋白（原）降解产物（FDP)含量的试剂盒，将酸化的抗人FDP抗体与聚乙烯基苄基氯胶 乳颗粒发生化学交联并封闭后形成的抗人FDP抗体胶乳试剂。
[0009] 又如：中国发明专利申请201210200339. 7公开了一种竞争法胶乳颗粒增强免疫 比浊BNP检测试剂盒及其制备方法，在胶乳颗粒包被有FGRKMDR-X氨基酸序列，解决了目前 夹心法检测BNP难度较高和检测时间长等问题。
[0010] 基于胶乳颗粒增强比浊法定量检测各种物质的类似技术还有很多，各种技术各有 特点。虽有相关技术对胶乳进行了改进（如：CN101819208A)，但共同之处在于必须将具有 识别作用的分子（如：蛋白、多肽或抗体）共价或非共价结合于载体颗粒（如：胶乳或磁微 粒）。虽然解决了定量检测的问题，简化了操作难度，缩短了检测时间和提高了准确性，但是 同样增加了胶乳及其与特定分子结合的制备环节。由此，带来了胶乳检测试剂均一性和稳 定性等新问题。
【发明内容】
[0011] 本发明的一个目的在于提供一种生物载体，具有在其表面展示的聚合物，该聚合 物具有识别并与目标分子结合的作用，适用于免疫比浊检测技术。
[0012] 本发明的另一个目的在于提供一种生物载体，作为载体颗粒应用于免疫比浊检测 产品。
[0013] 本发明的又一个目的在于提供一种免疫比浊检测组合物，含有一种表面具有聚合 物的生物载体。
[0014] 本发明的再一个目的在于提供一种免疫比浊检测方法，向待测样品中加入含有生 物载体的检测试剂，以形成复合物（如：抗原和抗体形成的免疫复合物），并可通过进行比 浊法定量或定性检测。
[0015] 聚合物是一种由众多原子或原子团主要以共价键结合而成的化合物，尤其是以氨 基酸或核糖核苷为单体结合而成的多肽、蛋白质、核酸、抗体或纳米抗体。氨基酸或核糖核 苷可直接来自于自然界或通过水解、酶解或化学方式间接获得，其构型不得限定本发明。本 领域技术人员所能理解的，这些聚合物还应当包括其它必要的分子修饰或成键，如：但不仅 限于糖基化、二硫键和硫修饰等，以及以非共价键，如：但不仅限于氢键和疏水相互作用。
[0016] 这些聚合物应理解为内源性或外源性的分子，即其作为一个整体来自于生物载体 的遗传信息所复制、转录或表达而获得的分子，如：核酸、多肽、蛋白质和抗体及其片段等， 也可以是并非完全来自于生物载体的遗传信息所复制、转录或表达的结果，即所谓的具有 外源性的属性。这些外源性的聚合物可以通过生物或化学的方法在体外或体内获得、表达 或于生物载体表面展示，如：分离、多肽的化学合成、核酸的PCR扩增、噬菌体展示、细菌展 示和真菌展示等。在这些聚合物中，优先选择的是含有抗原、抗体及其Fab片段、单链抗体、 单域抗体等分子。
[0017] 本领域技术人员可以理解，抗原和抗体系免疫学上对两种分子的表述，本发明中 应理解为是一对能够互相特异性结合的分子，具有识别性。
[0018] 抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后，可刺激机体产 生抗体和引起细胞免疫。在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。抗原的反应性取 决于抗原决定簇（antigenicdeterminant),亦称表位（epitope)。一个抗原分子可带有不 同的决定簇。此外，还可以通过基因工程或化学连接的方式对表位进行拼接。
[0019] 本发明所称的抗原还包括但不限于通常认为的半抗原（即只有反应原性，不具免 疫原性，hapten)。此外，那些既不具有反应原性，也不具免疫原性的分子（如：重金属）通 过与其它分子连接后而形成的半抗原或形成完全抗原而能够被识别的分子也应属于此范 畴。
[0020] 抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即 IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。本发明中，抗体还包 括具有识别抗原作用的分子，如：但不限于由Ig衍生而来的抗体Fab段、单链抗体、单域抗 体和纳米抗体等也应属于此范畴。
[0021] 一种本发明纳米抗体的【具体实施方式】，是基于一个重链可变区组成的单域抗体， 是通过克隆缺失轻链的重链抗体（如：来源于骆驼体内）的可变区得到的功能性抗原结合 片段，亦称单域抗体。其抗体片段可通过多肽合成的方式获得，也可以通过生物载体表达所 克隆的序列而得到。
[0022] 多肽、蛋白质、抗体、抗体Fab段、单链抗体、单域抗体或纳米抗体的制备，可以通 过从自然界生物体中分离、多肽化学合成（Eur.J.Immunol. 1994, 24, 3188-3193 ;J.Org. Chem. 1972, 37, 3404-3409 ;多肽合成[P]，北京：科学出版社，1985)、原核微生物（如：大肠 杆菌）基因工程菌表达后纯化、真核微生物（如：啤酒酵母、毕赤酵母和乳酸克鲁韦酵母 等）基因工程菌表达后纯化或由动物细胞（如：中国仓鼠CH0、仓鼠BHK、鼠骨髓瘤细胞小鼠 成纤维细胞、猴CV1细胞和人淋巴细胞等）等进行表达并纯化。
[0023] 核酸的制备可以通过体外扩增技术获得，这些技术已记载于《分子克隆手册》一书 中，也是普通技术人员必须具备和熟练掌握的操作技能。
[0024] 生物载体如：但不仅限于噬菌体、病毒、细菌、真菌和细胞等，其通常包括遗传物质 和包被。包被应当理解为能将遗传物质包覆于其内，并能在其表面承载遗传物质所表达的 聚合物或能将聚合物结合于其表面的一类物质的统称。适宜的包被，如：但不仅限于脂膜、 脂质体、细胞膜、细胞壁、细胞器膜、病毒外壳和噬菌体外壳等。
[0025] 本发明中，通过生物表达系统而将外源性的分子引入生物载体中，并在生物载体 表面得以展示。对于这样的展示，本领域技术人员仅需采用常见的展示技术就可实现。生 物表达系统应当理解为是一类能携带遗传信息的物质，如：噬菌体展示相关质粒（如：包括 但不限于pCantab、pHen和pComb等）、病毒展示相关质粒（如：包括但不限于pBACsurf-1、 pLenti6、pAAv和pLV.Des2d.P等）、细菌展示相关质粒（如：包括但不限于pMB172、 pINA1317、pETAg43、pTNIM和pBLIM等）和真菌展示相关质粒（如：包括但不限于pCTcon2、 pYDl和pKFS等）。
[0026] 本发明所称的展示还包括采用物理或化学方法将外源性的分子通过吸附、疏水相 互作用或偶联等方式标记到生物载体表面。
[0027] 本发明提供的生物载体还包括聚合体，即若干个生物载体以自动的方式（如：物 理吸附）聚集在一起，而形成的集合体。在此情况下，应理解为一种生物自发的自然现象。
[0028] 本发明提供的生物载体还包括连接体，即采用生物的或化学的连接技术 (BioConjugateChemistry)以人为操作方式实现将一种或若干种生物载体相互连接在一 起。在此情况下，应理解为其有别于生物的自然现象，而是在人为干预的情况下实现。这些 技术可以从现有已公开的专利/申请、期刊或论文中了解并实施，如：美国化学协会（ACS) 提供的期刊BioConjugateChemistry。
[0029] 本发明的提供一种免疫比浊检测组合物，采用含有一种表面具有聚合物的生物载 体，其它组份与已公开的技术大体相同。该免疫比浊检测组合物用于定量检测待测样品所 含的目标分子。
[0030] 本发明提供的一种免疫比浊检测方法，其特征在于将生物载体作为检测试剂加入 待测样品中形成免疫复合物，或再辅以增敏剂、表面活性剂和缓冲液等手段，进而通过比浊 法对待测样品的进行定量和定性的检测。
[0031] 本发明所称的"待测样品"或"试样"源自于受试者或病患的血液、分泌物、组织液、 体外培养液或组织等。
[0032] 本发明所称的"病患"、"病人"和"受试者"指人、野生动物和家畜（Livestock)。野 生动物为自然状态下未经人工驯化的动物。家畜是为了提供食物来源而人工饲养的动物， 如：猴、狗、鼠、仓鼠、猪、兔、奶牛、水牛、公牛、绵羊、山羊、鹅和鸡等。给予诊断的"患者"优 先选择哺乳动物，尤其是人。
[0033] 本发明提供的一种生物载体，为噬菌体，其外壳上具有抗体。
[0034] 本发明提供的一种生物载体，为噬菌体，其外壳上具有抗原。
[0035] 本发明提供的另一种生物载体，为细菌，其上细胞壁具有抗体或抗原。
[0036] 本发明提供的另一种生物载体，为真菌，其上细胞膜或细胞壁具有抗体或抗原。
[0037] 本发明针对不同种类的特定分子（抗原或抗体），可以通过添加目前通用的免疫 比浊法相关的增敏剂（如：PEG)、表面活性剂（如：但不仅限于非离子性表面活性剂、阴离 子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂和两性表面活性剂）、缓冲液（如：磷酸缓冲液、Tris 缓冲液、咪唑缓冲液、三乙醇胺?盐酸缓冲液、MES缓冲液、Bis-Tris缓冲液、ADA缓冲液、 PIPES缓冲液、Bis-Tris-丙烷缓冲液、ACES缓冲液、MOPS缓冲液、BES缓冲液、TES缓冲液、 HEPES缓冲液、HEPPS缓冲液、Tricine缓冲液、Bicine缓冲液和TAPS缓冲液等）或其他试剂 对检测时间、检测范围或检测灵敏度进行调整。同时，检测结果也可能会因检测仪器（如： 不同光径或光程的比色杯）、检测环境（如：温度和pH值等）不同而略有差异。
[0038] 本发明技术方案实现的有益效果：
[0039] 本发明通过在生物载体上展示特定抗原或抗体的方式，改变了目前使用杂交瘤获 得抗体的方式，不仅简化了制取的过程，而且所获得的单个生物载体（如：噬菌体）所展示 的抗体或抗原均为单克隆。
[0040] 经验证，本发明生物载体适用于在可见光范围内应用于样品的免疫比浊检测，不 仅大大加快检测速度（与ELISA相比），其在较宽的浓度范围内均表现出良好的线性关系， 有利于提高微量物质检测的准确性。
[0041] 本发明生物载体制备方便，稳定性强、特异性高和易于大规模制取等特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0042] 图1为本发明生物载体用于检测IgY的时间与浓度关系图；
[0043] 图2为本发明生物载体用于检测无关蛋白BSA的时间与浓度关系图；
[0044] 图3为本发明生物载体在320nm波长下的免疫比浊检测结果；
[0045] 图4为本发明生物载体在400nm波长下的免疫比浊检测结果；
[0046] 图5为本发明生物载体浓度为3. 525X105检测血清中抗体结果；
[0047] 图6为本发明生物载体浓度为3. 525X107检测血清中抗体结果；
[0048] 图7为本发明生物载体配合使用5%PEG4000助剂而获得的浊度变化情况；
[0049] 图8为本发明生物载体配合使用不同分子量的PEG助剂而获得的浊度变化情况；
[0050] 图9为本发明生物载体配合使用不同浓度的PEG6000助剂而获得的浊度变化情 况；
[0051] 图10为通过化学法获得的本发明生物载体使用不同浓度的PEG6000助剂而获得 的浊度变化情况；
[0052] 图11为通过化学法获得的本发明生物载体对梯度抗原进行检测而获得的浊度变 化情况。
【具体实施方式】
[0053] 以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技 术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员 应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精 神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
[0054] 本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，可参考自《分子克隆》一书（J.萨 姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科学出版社，1994)。该书及其后续出版版本是 本领域技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。 此外，根据不同实验目的，本领域技术人员在各种商品化试剂盒（Kit)所附带的操作手册 的指导下完成相应的实验或委托专业化的公司进行，如：基因测序、质粒测序和确定分子量 等。
[0055] 本发明实施例其它所用的试剂若未经说明，均购自西格玛一奥德里奇（Sigma- Aldrich)公司或者国药集团化学试剂有限公司。
[0056] 实施例1噬菌体纳米抗体库构建
[0057] 通过抽取7只羊驼血细胞，并分离其淋巴细胞后，设计羊驼纳米抗体引物，通过巢 式PCR，克隆羊驼纳米抗体基因，构建噬菌粒，感染细菌后，在辅助噬菌体协助下，包装成展 示纳米抗体的噬菌体，成功获得滴度在10 11的纳米抗体库。主要内容如下：
[0058] 涉及的三对引物如表1
[0059]表1
[0060]
【权利要求】
1. 一种生物载体在免疫比浊检测技术中的应用，所述的生物载体表面具有识别并与目 标分子结合作用的聚合物。
2. -种生物载体在免疫比浊检测产品中的应用，以所述的生物载体作为载体颗粒，其 表面具有识别并与目标分子结合作用的聚合物。
3. 根据权利要求1或2所述的生物载体的用途，其特征在于所述的聚合物包括氨基酸、 多肽和蛋白质之一种或几种。
4. 根据权利要求1或2所述的生物载体的用途，其特征在于所述的聚合物为抗原和抗 体之一种或几种。
5. 根据权利要求1或2所述的生物载体的用途，其特征在于所述的生物载体选自于噬 菌体、病毒、细菌和真菌之一种或几种。
6. 根据权利要求1或2所述的生物载体的用途，其特征在于所述的生物载体为由噬菌 体、病毒、细菌和真菌之一种或几种形成的聚合体和连接体。
7. -种免疫比浊检测组合物，其特征在于含有一种生物载体，所述的生物载体表面具 有识别并与目标分子结合作用的聚合物。
8. 根据权利要求7所述的免疫比浊检测组合物，其特征在于所述的免疫比浊检测组合 物为检测试剂盒。
9. 根据权利要求7所述的免疫比浊检测组合物，其特征在于所述的聚合物包括氨基 酸。
10. 根据权利要求7所述的免疫比浊检测组合物，其特征在于所述的聚合物为抗原和 抗体之一种或几种。
11. 根据权利要求7所述的免疫比浊检测组合物，其特征在于所述的生物载体选自于 噬菌体、病毒、细菌和真菌之一种或几种。
12. 根据权利要求7所述的免疫比浊检测组合物，其特征在于所述的生物载体为由噬 菌体、病毒、细菌和真菌之一种或几种形成的聚合体和连接体。
13. -种免疫比浊检测方法，其特征在于将生物载体作为检测试剂加入待测样品中形 成复合物，所述的生物载体表面具有识别并与目标分子结合作用的聚合物。
14. 根据权利要求13所述的免疫比浊检测方法，其特征在于所述的生物载体为由噬菌 体、病毒、细菌和真菌之一种或几种形成的聚合体和连接体。
15. 根据权利要求13所述的免疫比浊检测方法，其特征在于所述的生物载体为由噬菌 体、病毒、细菌和真菌之一种或几种。
16. 根据权利要求13所述的免疫比浊检测方法，其特征在于还加入增敏剂、表面活性 剂和缓冲液之一种或几种。
17. 根据权利要求13所述的免疫比浊检测方法，其特征在于所述的聚合物为抗原和抗 体之一种或几种。
18. 根据权利要求13所述的免疫比浊检测方法，其特征在于所述的聚合物包括氨基 酸。
【文档编号】G01N33/569GK104459127SQ201410777916
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月15日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】顾晋元 申请人:顾晋元