一种用于生物传感器信号放大的探针体系及其应用的制作方法

本发明属于电化学生物传感器领域，尤其涉及一种用于生物传感器信号放大的探针体系及其应用。

背景技术：

超灵敏核酸检测技术在病毒、病原菌、基因疾病等检测及其诊断等领域应用广泛。如荧光定量PCR技术、滚环扩增技术(RCA)等微量核酸检测技术基于聚合酶链式反应和荧光信号检测方法达到微量核酸定量或检测，但这些检测方法存在操作步骤复杂、光学信号探针昂贵、需要特定检测仪器等问题。电化学传感技术一直是最应用广泛的生物医学和化学分析检测平台，具有简单、便携式、低成本、高检测灵敏度等优势。新型的电化学生物传感器在床边即时诊断(Point-Of-Care)、微创检测、抗生素使用指导等医学领域有巨大的应用前景。

传统的电化学核酸检测传感器主要是以“三文治”基本结构检测方式为主，即靶基因(TP)的一端与含有其同源互补序列的捕获探针(CP)杂交，靶基因的另一端与信号探针互补杂交，通过检测杂交前后电化学参数(电流、电势、电导、阻抗、电容)的变化来检测目标DNA。传统的“三文治”电化学方法，一个信号探针(DP)对应一个目标DNA，当目标DNA含量过低，传感检测方法本身灵敏度的限制等原因，会导致背景信号与微弱的杂交信号难以区别。在疾病早期诊断、微创检测、食品安全等领域，亟需高灵敏的生物传感器。目前DNA的电化学放大检测方法主要有两类：目标放大和信号放大。目标放大型DNA传感器主要是通过核酸体外扩增技术，提高目标DNA浓度到检测水平，实现痕量DNA检测，但该方法需要配备昂贵的仪器设备和复杂的操作步骤，容易出现假阳性等问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于生物传感器信号放大的探针体系，旨在解决现有生物传感器灵敏度低、操作复杂或仪器设备昂贵的问题。

本发明的另一目的在于提供一种基于DNA/RNA杂交串联探针的电化学信号放大的检测方法。

本发明是这样实现的，一种用于生物传感器信号放大的探针体系，包括接头探针和与所述接头探针连接的信号放大结构，

其中，所述接头探针包括3’端与靶基因互补结合的第一区域和与所述信号放大结构连接的第二区域，所述第二区域包括2-4个相同的序列单元，所述序列单元之间设置有碱基间隔；

所述信号放大结构包括2-4个独立的信号放大单元，所述信号放大单元由信号探针和连接在所述信号探针5’端的串联标记物组成，所述信号探针与所述序列单元互补连接，所述串联标记物由2-4个串联的标记物组成。

以及，一种基于DNA/RNA杂交串联探针的电化学信号放大的检测方法，包括以下步骤：

设计提供待测样品的捕获探针、探头探针和信号放大结构；

提供电极组，所述电极组包括工作电极、辅助电极和参比电极，将所述电极进行活化处理，在所述工作电极上固定所述捕获探针后对所述工作电极进行巯基乙醇封闭，得到捕获探针特异性识别靶基因的DNA/RNA检测芯片；

将待检测样品的靶基因、所述探头探针和所述信号放大结构混合得到检测液；

在所述DNA/RNA检测芯片上滴涂所述检测液，孵育处理形成DNA/RNA杂交串联探针芯片,其中，所述DNA/RNA杂交串联探针包括上述权利要求1-5任一所述的用于生物传感器信号放大的探针体系，所述接头探针中的所述第一区域与所述靶基因互补结合；

检测所述DNA/RNA杂交串联探针的电流信号。

本发明提供的用于生物传感器信号放大的探针体系，通过在所述接头探针(adapter probe,AP)的所述第二区域结合信号探针杂交串联标记物的信号放大结构，且所述信号放大结构包括2-4个独立的信号放大单元，所述串联标记物包括2-4个串联的标记物，由此形成信号叠加放大结构，使所述信号探针上连接的标记物的电化学信号放大，从而提高灵敏度。

本发明提供的基于DNA/RNA杂交串联探针的电化学信号放大的检测方法，该方法具有简单可控、检出限低和信号易于采集等优点，可快速检测待测样品的浓度，且灵敏度高。

附图说明

图1是本发明实施例提供的用于生物传感器信号放大的探针体系示意图；

图2是本发明实施例1提供的使用基于DNA杂交串联探针的电化学信号放大的检测方法测得的大肠杆菌DNA浓度图；

图3是对比例提供的传统“三文治式”DNA传感芯片检测大肠杆菌基因检测方法测得的大肠杆菌DNA片段浓度梯度图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

结合图1，本发明实施例提供了一种用于生物传感器信号放大的探针体系，包括接头探针3和与所述接头探针3连接的信号放大结构4，其中，所述接头探针3包括3’端与靶基因2互补结合的第一区域31和与所述信号放大结构4连接的第二区域32，所述第二区域32包括2-4个相同的序列单元，所述序列单元之间设置有碱基间隔；

所述信号放大结构4包括2-4个独立的信号放大单元41，所述信号放大单元41由信号探针411和连接在所述信号探针411的5’端的串联标记物412组成，所述信号探针411与所述序列单元互补连接，所述串联标记物412由2-4个串联的标记物组成。

具体的，本发明实施例中，所述接头探针3根据连接对象的不同，分为两个区域，具体的，包括3’端与靶基因2互补结合的第一区域31和5’端与所述信号放大结构4连接的第二区域32。本发明实施例将所述信号放大结构4设置在所述接头探针3的5’端，主要原因在于形成的所述信号放大结构4与后述提到的电极5的距离较近，易于获得电化学信号。

作为优选实施例，本发明实施例所述第一区域31的碱基个数为15-25个。该合适的碱基个数不会因为长度过长增加设计难度，或在杂交过程中由于长度过长引起侧交；也不会由于长度过短结合力不够，不足以承载其5’段连接的所述信号放大结构4。

所述第二区域32是与所述信号放大结构4连接的区域。所述第二区域32根据2-4个互补的所述信号探针411对应包括2-4个相同的序列单元。作为优选实施例，所述序列单元的序列为：5'-CAACCTTCCCTCATTT-3'。

为了减弱所述信号探针串联杂交时的空间位阻效应，在每个序列单元之间设置有碱基间隔。作为优选实施例，所述碱基间隔由两个A碱基构成。该优选的碱基个数和碱基类型可以保证所述序列单元之间合适的空间距离，且还可以保证杂交时的杂交效率和准确性。

所述信号放大结构4是用于放大生物传感器电化学信号的功能结构，所述信号放大结构4中信号探针放大单元的个数，对电化学信号的放大功能影响较大，当所述信号探针放大单元41的个数在两个以上时，其信号放大基本能够满足各种样品浓度的测试要求，且所述信号探针放大单元41的个数越多，所述生物传感器测试灵敏度相对越高；当所述信号探针放大单元41的个数在四个以上时，其信号放大作用基本趋于稳定。因此，作为优选实施例，所述信号探针放 大单元41的个数为优选为2-4个。基于类似的道理，所述标记物的个数优选为2-4个，所述且标记物的个数过多时，容易形成较大的空间位阻，影响测试结果。

作为优选实施例，所述信号探针411的序列对应为：5'-AAATGAGGGAAGGTTG-3'。所述标记物优选为二茂铁、荧光素、生物素、亚甲基蓝中的至少一种。进一步的，由于二茂铁性质稳定不受环境中氧浓度的变化影响，在水中的溶解度小，电子专递速度快，氧化还原电位低，本发明实施例中优选使用二茂铁作为标记物。以二茂铁作为所述信号探针411的标记物，与电解液中离子结合后，氧化还原电位发生改变，从而实现靶基因2片段的检测方法。通过所述接头探针3捕获的多个所述信号探针411上所述标记物的电信号叠加放大，实现生物传感芯片检测靶核酸片段的检测灵敏度提高，可达fM级别以下。

作为一个较佳实施例，所述第二区域32包括4个相同的序列单元，所述信号放大结构4包括4个独立的信号放大单元41，所述串联标记物412由4个串联的标记物组成。

此外，本发明实施例所述用于生物传感器信号放大的探针体系还包括靶基因2、捕获探针1和电极5，所述捕获探针1、所述探头探针3的第一区域31分别与所述靶基因1互补结合，所述捕获探针1一端与所述电极5连接。由此获得的用于生物传感器信号放大的探针体系，是通过固定在金电极表面的所述捕获探针1与所述靶基因2互补序列杂交，捕获检测样品中靶基因片段，再通过所述接头探针3的第一区域31与所述靶基因2的杂交、所述第二区域32与信号探针多聚体的联杂交的所述信号放大结构4，形成多信号叠加放大多聚体结构。

进一步的，作为优选实施例，为了使得所述探头探针3上连接的所述信号放大结构4与所述电极5的距离较近、从而更好地获得电化学信号，所述捕获探针1、探头探针3分别与所述靶基因2接合的结合位点之间相差0-12个bp。 更进一步的，所述电极5优选为金电极。

本发明实施例提供的用于生物传感器信号放大的探针体系，通过在所述接头探针(adapter probe,AP)的所述第二区域结合信号探针杂交串联标记物的信号放大结构，且所述信号放大结构包括2-4个独立的信号放大单元，所述串联标记物包括2-4个串联的标记物，由此形成信号叠加放大结构，使所述信号探针上连接的标记物的电化学信号放大，从而提高灵敏度。

相应的，本发明实施例还提供了一种基于DNA/RNA杂交串联探针的电化学信号放大的检测方法，包括以下步骤：

S01.设计提供待测样品的捕获探针、探头探针和信号放大结构；

S02.提供电极组，所述电极组包括工作电极、辅助电极和参比电极，将所述电极进行活化处理，在所述工作电极上固定所述捕获探针后对所述工作电极进行巯基乙醇封闭，得到捕获探针特异性识别靶基因的DNA/RNA检测芯片；

S03.将待检测样品的靶基因、所述探头探针和所述信号放大结构混合得到检测液；

S04.在所述DNA/RNA检测芯片上滴涂所述检测液，孵育处理形成DNA/RNA杂交串联探针芯片,其中，所述DNA/RNA杂交串联探针包括上述用于生物传感器信号放大的探针体系，所述接头探针中的所述第一区域与所述靶基因互补结合；

S05.检测所述DNA/RNA杂交串联探针的电流信号。

具体的，上述步骤S01中，所述捕获探针、探头探针和信号放大结构的设计可以采用计算机软件合成。所述捕获探针、探头探针和信号放大结构优先筛选特异性高、灵敏度和重复性好的最佳探针组合。其中，所述捕获探针、所述探头探针与靶基因连接的所述第一区域，应根据靶基因的序列进行设计。作为具体实施例，可以先设计合成靶基因序列，进而通过所述靶基因系列设计所述探头探针的第一区域。其中，所述合成靶基因序列的设计，可以通过对Genebank数据库已有的待测样品基因序列以及国内外已发表文献中报道的相关核酸序列 进行序列比对分析，以待测样品基因的无二级结构且高度保守的区段，根据引物探针无错配的基本原则，利用软件合成。

上述步骤S02中，所述电极组优选使用薄膜金电极。所述活化处理的方法可以采用本领域常规方法实现，具体可为，将电极浸泡在0.1M的稀硫酸中，在0-1.2V范围内进行电化学活化，用超纯水冲洗电极表面10s，彻底清洗电极表面残留的喜酸，然后氮气吹干。

本发明实施例在所述工作电极上固定所述捕获探针的方法为本领域常规方法。作为一个具体实施例，在所述工作电极上滴涂1μL捕获探针水溶液，25℃水浴静置2小时，所述捕获探针固定结束后，用超纯水冲洗电极表面10秒，氮气吹干。所述巯基乙醇封闭的方法，也可采用本领与常规方法实现，具体可为：在固定了所述捕获探针的工作电极上滴涂1μL1mM的巯基乙醇水溶液，25℃水浴静置2小时，用超纯水冲洗后氮气吹干，在电极表面形成捕获探针/巯基乙醇复合层。

上述步骤S03中，所述检测液应该是包含有靶基因、包括有信号探针的信号放大结构、探头探针的混合溶液。

上述步骤S04中，作为优选实施例，所述孵育处理的温度为25-42℃，时间为10-60min。进一步的，所述孵育处理的温度为35℃，时间为15min。本发明实施例检测方法中，由于形成了含有信号放大结构的探针体系，检测灵敏度提高，杂交时间可大大缩短。

上述步骤S05中，杂交结束后将所述DNA/RNA杂交串联探针芯片用电解液洗涤10s，所述电解液可采用1mol/L的NaClO₄(pH7.4)。然后将所述DNA/RNA杂交串联探针芯片浸泡在电解液、特别是新鲜的电解液中，检测所述共组电极的电流信号。作为优选实施例，检测所述DNA/RNA杂交串联探针的电流信号采用交流伏安法或差分脉冲伏安法实现。具体的，当采用交流伏安法检测所述工作电极的电流信号时，电压范围为电压范围为-0.3～0.4V，频率为100-2000Hz，扫描速率为0.01-0.05V/s。

本发明实施例提供的基于DNA/RNA杂交串联探针的电化学信号放大的检测方法，该方法具有简单可控、检出限低和信号易于采集等优点，可快速检测待测样品的浓度，且灵敏度高。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1、基于DNA杂交串联探针的电化学信号放大的检测方法检测大肠杆菌基因，包括以下步骤：

S11.探针的设计：通过对Genebank数据库已有的细菌基因组上的大肠杆菌16srRNA基因序列以及国内外已发表文献中报道的相关核酸序列进行序列比对分析，以大肠杆菌16srRNA基因序列的保守片段为靶基因，选择无二级结构且高度保守的区段，根据引物探针无错配的基本原则，利用软件，人工设计捕获探针、靶基因序列、信号探针、接头探针。以上述设计的多组探针分别检测上述的合成靶基因序列，经反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳探针组合：CP、AP、DP1，所述CP、AP、DP1的序列分别如下：

AP序列：

5'-CAACCTTCCCTCATTTAACAACCTTCCCTCATTTAACAACCTTCCCTCATTTAACAACCTTCCCTCATTTAACTTTACTCCCTTCC-3'。

CP序列：

5'-S-S-C6-TCCCCGCTGAAAGTA CTTTACAACCCGAAGGCCTT-3'。

TP序列：

5'-TGTATGAAGAAGGCCTTCGG

GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACC-3'。

DP1：

5'-FcFcFcFc-AAATGAGGGAAGGTTG-3'，其5'-端标记为4个连续的二茂铁(Fc)。

S12.DNA芯片制备：电极选用为薄膜电极，工作电极、辅助电极和参比 电极均为电极。将三个电极浸泡在0.1M的稀硫酸中，在0V-1.2V范围内进行电化学活化，用超纯水冲洗电极表面10秒，彻底清洗电极表面残留的稀酸，然后氮气吹干。CP固定：在工作电极上滴涂1μL CP水溶液，25℃水浴静置2小时，捕获探针固定结束后，用超纯水冲洗电极表面10秒，氮气吹干。MCH封闭：在修饰电极上滴涂1μL1mM的MCH水溶液，25℃水浴静置2小时，用超纯水冲洗后氮气吹干，电极表面形成CP/巯基乙醇复合层，获得特异性识别靶基因的DNA检测芯片。

S13检测液制备：检测液是包含不同浓度的大肠杆菌基因片段(TP)、信号探针(DP1)、接头探针(AP)的6×SSC(pH7.4)杂交液。TP的浓度包括1pM、100fM、10fM、1fM、100aM、0aM。DP和AP的浓度分别为1μM。

S14.杂交反应：在已经修饰了CP的DNA/巯基乙醇芯片上滴涂1ul检测液，35℃孵育15分钟。

S15.电信号检测：杂交结束后，将DNA/巯基乙醇芯片用电解液(1M NaClO₄，pH7.4)洗涤10秒。然后将电极浸泡在新鲜的电解液中，采用交流伏安法(ACV)检测工作电极的电流信号，电压范围为-0.3～0.4V，频率为250Hz，交流电位为25mV，扫描速率为20mV/s。

对比例、采用传统“三文治式”DNA传感芯片检测靶基因

探针的设计：CP、AP与上述S11相同，信号探针DP2的序列为5'-Fc-AACTTTACTCCCTTCC-3'，其5'-端标记为1个二茂铁(Fc)。

检测液制备：检测液是包含不同浓度的大肠杆菌基因片段(TP)、信号探针(DP2)的混合杂交液。TP的浓度包括10pM、1pM、100fM、10fM、0pM。DP和AP的浓度分别为1μM。

杂交反应：在DNA/MCH-SAM芯片上滴涂1ul检测液。35℃孵育15分钟。

电信号检测：杂交结束后，将DNA/MCH-SAM芯片用电解液(1M NaClO4，pH7.4)洗涤10秒，然后将电极浸泡在新鲜的电解液中，采用交流伏安法检测 电极电流信号，电压范围为-0.3～0.4V，频率为250Hz，交流电位为25mV，扫描速率为20mV/s。

使用本发明实施例1基于DNA杂交串联探针的电化学信号放大的检测方法测得的大肠杆菌DNA浓度图如图2所示。传统“三文治式”DNA传感芯片检测大肠杆菌基因检测方法测得的大肠杆菌DNA片段浓度梯度如图3所示。由图可见，本发明实施例提供的基于DNA杂交串联探针的电化学信号放大的检测方法具有更高的灵敏度，可以获得更准确的结果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。