人们使用一批杀伤正在生长和分裂的细胞并以多种方式发挥功能的治疗剂来治疗癌症。常见的化疗剂集合已被单独或联合使用了数十年，且该常见的试剂集合已成为临床肿瘤学实践中传统且常规的癌症治疗手段。这类传统的化疗剂通过杀伤所有快速分裂的细胞来发挥作用，快速分裂是大多数癌细胞的主要特性之一。然而，这些试剂也杀伤正在生长的正常细胞，因此这些试剂不被视作杀伤癌细胞的“靶向”方法。近年来，已开发出大量仅特异性靶向癌细胞的癌症治疗剂，其中这些治疗剂特异性攻击仅由癌细胞表达而正常细胞不表达的蛋白质。这种方式被视癌症治疗的“靶向”方法。最近，以“靶向”方式杀伤癌细胞的另一种方法是特异性调控免疫系统以增强癌症患者的免疫系统杀伤癌细胞的能力。
已知癌细胞的PD-L1表达增加可使这些细胞规避宿主免疫系统。其中癌细胞表达高水平PD-L1的肾细胞癌与增加的肿瘤侵染性和提高4.5倍的死亡风险相关。此外，与在其癌细胞中具有较低PD-L1表达的卵巢癌患者相比，具有较高PD-L1表达的患者的预后显著较差。在这些患者中，PD-L1表达与上皮内CD8+T淋巴细胞计数负相关，表明在癌细胞外侧上表达的PD-L1可抑制CD8+T细胞的抗肿瘤活性。这鼓励开发PD-L1抑制剂以压制癌细胞的细胞表面上PD-L1的存在，其继而产生更强的CD8+T细胞的癌细胞杀伤活性。基于这一最新癌症治疗方法，重要的是了解癌细胞中的PD-L1表达水平以确定使用PD-L1抑制剂治疗特定癌症是否会对给定患者中免疫介导的癌细胞杀伤产生显著影响。
提供了用于一种或多种SRM/MRM测定的肽和肽序列，这些SRM/MRM测定可用于定量测定直接处于来自癌症患者的患者来源的生物样品中的PD-L1蛋白质水平，目的是实现改进的癌症疗法的治疗决定。
技术实现要素：
提供来源于PD-L1蛋白质的子序列的特异性肽。PD-L1也称作程序性细胞死亡1配体1，分化群274(CD274)蛋白质和B7同源物1(B7-H1)。PD-L1蛋白质由CD274基因编码，并且在本发明中称作PD-L1。
来源于蛋白质的各种肽的肽序列和碎片/过渡离子可用于基于质谱的选择性反应监测(SRM)测定中，其也称为多反应监测(MRM)测定，在下文中称作SRM/MRM测定。描述了用于PD-L1蛋白质及该蛋白质的同种型的SRM/MRM分析的肽的用途。
可使用一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或五种或更多种SRM/MRM测定来检测是否存来源于PD-L1蛋白质的切割的一种或多种特异性肽并测量其相对或绝对定量水平，并由此提供通过质谱法测量在从生物样品中获得的给定蛋白质制备物中PD-L1蛋白质的总量的方法。可从那些蛋白质中得到的肽中的全部或全部的一部分也可在单一SRM/MRM测定中同时分析或可在单个SRM/MRM测定的任何组合中分析。这些肽各自提供通过质谱对生物样品中获得的给定蛋白质制备物中PD-L1蛋白质总量的测量。
本文描述的SRM/MRM测定可直接测量由从诸如福尔马林固定的癌症患者组织(例如切除的肿瘤或活检样品)的患者组织样品取得的细胞制备的复杂蛋白质裂解物样品中的那些肽。由福尔马林固定的组织制备蛋白质样品的方法描述在美国专利第7,473,532号中，其内容通过引用全文纳入本文。该专利描述的方法可使用获自表达病理学公司(Expression Pathology Inc.)(马里兰州罗克维尔)的Liquid试剂和方案方便地进行。
对从癌症患者中手术移出的组织进行甲醛/福尔马林固定是在病理学实践中已经接受的常规方法。因此，甲醛/福尔马林固定的石蜡包埋组织是最广泛可用的来自那些患者的组织形式。甲醛/福尔马林固定通常采用称为福尔马林的甲醛水溶液。“100％”福尔马林由甲醛在水中的饱和溶液(约40体积％甲醛或37重量％)组成，其含有少量用于限制氧化和聚合程度的稳定剂，通常为甲醇。保藏组织的最常用方式是将整个组织在通常称为10％中性缓冲福尔马林的甲醛水溶液中长时间(8小时至48小时)浸泡，接着在室温下将固定的整个组织包埋在石蜡中以便长期储存。因此，分析福尔马林固定的癌症组织的分子分析方法将是用于分析癌症患者组织的最被接受且大量利用的方法。
SRM/MRM测定的结果可用于关联自其中收集并保藏组织(生物样品)的患者或受试者的具体组织样品(例如癌症组织样品)内这些蛋白质中的任一种或全部的准确且精确的定量水平，以及这些蛋白质的潜在同种型的准确且精确的定量水平。这不仅提供关于癌症的诊断信息，而且容许医师或其它医疗专业人员确定用于患者或受试者的适当疗法。提供关于在患病组织中或在另一患者/受试者样品中蛋白质表达水平的诊断和治疗重要信息的这一测定称为伴随诊断测定。例如，这一测定可设计用于诊断癌症的阶段、程度或组织学并确定将最有效地阻止癌症细胞生长的治疗剂，从而确定患者或受试者将最可能应答的治疗剂。
更具体而言，对来自患者的癌细胞中的PD-L1蛋白质中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种肽的检测和/或定量提供了蛋白质信息，其可指示随后应进行哪种或哪几种治疗方案。
发明详述
本发明所述的测定定量或测量来自PD-L1蛋白质的特定未修饰的肽的相对或绝对水平并且可测量来自PD-L1蛋白质的特定修饰的肽的相对或绝对水平。修饰的示例包括在这些肽上存在的磷酸化氨基酸残基和糖基化氨基酸残基。
蛋白质及蛋白质同种型的相对定量水平可通过SRM/MRM方法确定，例如通过比较SRM/MRM特征峰面积(signature peak area)(例如，特征峰面积或积分的片段离子强度)来确定。单个PD-L1肽的相对水平可在不同样品(例如，对照样品和由患者或受试者的组织制备的样品)中确定。或者，在各种肽具有其自己的特异性SRM/MRM特征峰的情况下，可以比较PD-L1特征肽中的一种或多种的多个SRM/MRM特征峰面积。通过比较峰面积，可以确定一种生物样品中或一种或多种额外或不同的生物样品中PD-L1蛋白质和潜在蛋白质同种型含量的相对水平。以此方式，可通过在相同实验条件下测定多个(例如，二、三、四、五或更多个)生物样品来确定来自PD-L1蛋白质的一种或多种特定肽的相对含量并从而确定PD-L1蛋白质及潜在同种型的相对含量。另外，确定单一样品内来自PD-L1蛋白质的一种或多种给定肽的相对定量的方法可以是通过SRM/MRM方法比较该肽的特征峰面积与同一来自生物样品的蛋白质制备物中的来自不同的一种或多种蛋白质的其他和不同的一种或多种肽的特征峰面积。
使用这类方法，可确定来自PD-L1蛋白质的特定肽的含量，从而确定相应蛋白质及其潜在同种型中的每一种的含量，所述含量是相对于同一样品内或不同样品中的一种对于另一种而言的。因为单个肽或多种肽的相对定量可相对于样品内或样品之间的另外一种或多种肽的含量来进行，所以可以确定所存在的肽的相对含量(例如，通过确定一种肽相对于另一种肽的峰面积)，而与生物样品中蛋白质的绝对重量：体积或重量：重量的含量无关。因此，来自生物样品的蛋白质制备物中一种或多种PD-L1肽的含量可用来确定在多种样品内及多种样品之间的PD-L1蛋白质的含量。通常将不同样品之间单个特征峰面积的相对定量数据标准化至每种样品的所分析蛋白质的含量(例如，使用样品的总蛋白质浓度和所分析的体积来标准化样品)。相对定量可跨越来自单一样品中同时存在的多种蛋白质和PD-L1蛋白质的许多肽和/或跨越许多样品进行，以进一步了解相对蛋白质含量，一种肽/蛋白质相对于其他肽/蛋白质。
PD-L1蛋白质的绝对定量水平通过例如SRM/MRM方法确定，通过该方法将来自在一种生物样品中的PD-L1蛋白质的单个肽的SRM/MRM特征峰面积与含量已知的样品中“掺入”的含量已知的一种或多种内标物(例如，同位素标记的标准物)的SRM/MRM特征峰面积相比较。在一个实施方式中，该内标物为合成形式的完全相同的PD-L1肽，其含有用一种或多种重同位素标记的一个或多个氨基酸残基。合成这类同位素标记的内标物，使得质谱分析产生可预测且一致的SRM/MRM特征峰，其与天然PD-L1肽特征峰不同且截然不同并可用作比较峰。因此，当内标物以已知含量掺入已知含量的来自生物样品的蛋白质或肽制剂中并通过质谱分析时，可将天然肽的SRM/MRM特征峰面积与内标肽的SRM/MRM特征峰面积相比较。数值比较容许计算来自生物样品的原始蛋白质制剂中存在的天然肽的绝对摩尔浓度和/或绝对重量，可由其确定相应蛋白质的浓度和重量。片段肽的绝对定量数据通常根据每种样品中所分析的蛋白质的含量来显示。绝对定量可跨越许多肽进行，其容许定量确定在单一样品中同时存在的多种(例如，两种、三种、四种、五种等)蛋白质，和/或跨越多种样品进行，以了解单个生物样品中和/或整个单个样品的组中的绝对蛋白质含量。在一个实施方式中，蛋白质的定量可使用如由Gygi等在美国专利7,501,286中描述的肽标准物来进行。
本文使用的术语定量、量化、测量或测度意指测定分析物如蛋白质、多肽、肽、标准物(例如，内标物)的相对或绝对水平。
本发明所述的测定方法可在采用例如患者来源或受试者来源的组织如福尔马林固定的组织时用作确定癌症阶段的辅助手段。本文发明述的SRM/MRM测定也可用作确定哪种治疗剂将最有利地用于治疗该患者或受试者的辅助手段。
为检验与本发明所述的癌症相关蛋白质的水平，可对经由手术移出的部分或全部肿瘤或经由为了确定疑似疾病的存在与否而进行的活检方法从患者或受试者移出的癌性组织或怀疑患癌的组织进行分析。分析这些组织的样品以确定患者或受试者的组织中是否存在PD-L1蛋白质以及存在何种形式的蛋白质。此外，可确定PD-L1蛋白质的表达水平并将其与在健康组织中发现的“正常”或参考水平相比较。在健康组织中发现的蛋白质的正常或参考水平可来源于例如没有癌症的一个或多个个体的相关组织。或者，可通过分析未受癌症影响的相关组织(例如，相同器官的部分)来获得具有癌症的个体的正常或参考水平。
蛋白质或肽的水平或含量可定义为通过SRM/MRM测定确定的蛋白质或肽的摩尔、质量或重量表示的量。可将该水平或含量标准化至所分析的裂解物中的蛋白质或另一组分的总水平或含量(例如，以微摩尔/微克蛋白质或微克/微克蛋白质表示)或甚至标准化至单位重量基础的DNA含量(例如，微摩尔或微克/微克DNA)。另外，蛋白质或肽的水平或含量可基于体积基础确定，例如以微摩尔或纳克/微升表示。通过SRM/MRM测定确定的蛋白质或肽的水平或含量也可标准化至所分析细胞的数目。
可通过关联或比较PD-L1蛋白质及其同种型或片段肽的水平与正常组织中观察到的水平来使用PD-L1蛋白质及该蛋白质的同种型的信息帮助确定癌症的组织学阶段或等级。一旦确定了癌症的组织学阶段和/或等级和/或PD-L1蛋白质表达特征，则可将该信息与经开发以特异性治疗由例如所测定的蛋白质(例如PD-L1)的异常表达表征的癌症组织的治疗剂(化学和生物)列表相匹配。来自特定个体的PD-L1蛋白质测定的信息与特异性靶向表达PD-L1蛋白质的细胞/组织的治疗剂列表相匹配表示治疗癌症的个性化用药方法。本发明所述的测定方法使用来自患者或受试者自身的组织的蛋白质的分析作为诊断和治疗判断的来源，从而形成个性化用药方法的基础。
肽产生
原则上，通过任何特异性已知的蛋白水解方法制备的来源于PD-L1蛋白质的任何预测的肽都可用作替代性报告子(surrogate reporter)来确定PD-L1蛋白质的丰度。然而，实践中，发现仅非常少的肽适用于本发明所述的测定。此外，不可能先验地预测来源于PD-L1的多种潜在肽中的哪一种肽(如果存在)将适用于这些测定。
在一个实施方式中，将样品用特异性已知的一种或多种蛋白酶(例如胰蛋白酶和/或胞内蛋白酶Lys-C中的一种或多种)消化。可将由蛋白水解处理产生的一种或多种肽用作替代性报告子以在诸如基于质谱的SRM/MRM测定的合适测定中确定PD-L1蛋白质中的一种或多种的丰度。类似地，也可使用已知在PD-L1蛋白质中被修饰的位点处含有一个氨基酸残基的任何预测的肽序列来测定样品中PD-L1蛋白质的修饰程度。
PD-L1片段肽可通过多种方法来产生，包括使用在美国专利7,473,532中提供的Liquid TissueTM方案。Liquid TissueTM方案和试剂能够通过对组织/生物样品中的蛋白质进行蛋白水解消化来由福尔马林固定的石蜡包埋组织生成适用于质谱分析的肽样品。在Liquid TissueTM方案中，将组织/生物制备物在升高的温度下在缓冲液中维持延长的一段时间(例如，约80℃至约100℃，持续约10分钟至约4小时的时间)以逆转或释放蛋白质交联。所采用的缓冲液为中性缓冲液(例如，基于Tris的缓冲液或含有去垢剂的缓冲液)，且有利地为不妨碍质谱分析的缓冲液。随后，将组织/生物样品用包括但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和胞内蛋白酶Lys-C的一种或多种蛋白酶处理足以破坏所述生物样品的组织和细胞结构并使所述样品液化的时间(例如，在约37℃至约65℃的温度下持续约30分钟至约24小时的时间)。加热和蛋白水解的结果为液态可溶性可稀释的生物分子裂解物。在一组实施方式中，在生物样品的蛋白水解处理中采用选自胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和胞内蛋白酶Lys-C的两种或更多种蛋白酶。
肽分离和测定
一旦制备出裂解物，则可对样品中的肽应用促进其分析和测量(定量)的多种技术。在通过质谱进行分析的情况下，可采用一种或多种色谱方法来促进分析。
在一个实施方式中，这些肽在通过质谱仪分析之前通过液相色谱(LC)分离。例如，可在具有用Jupiter ProteoC12，4μm树脂(菲罗门公司(Phenomenex)，加利福尼亚州托伦斯)自填充到12cm的床长度(bed length)的PicoFrit(100μm ID/10μm tip ID，新目标公司(New Objective))柱的nanoAcquityLC系统(沃特世公司(Waters)，马萨诸塞州米尔福德)或EASY-nLCII(赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific)，加利福尼亚州圣何塞)上分离肽。肽可经含有0.1％甲酸的1％-50％乙腈的12分钟色谱梯度在800nL/分钟的流速下洗脱。一旦通过液相色谱分离，则将洗脱的肽引导到质谱中进行分析。在一个实施方式中，质谱配备有纳米喷雾源。
在另一实施方式中，可通过亲和技术来分离肽，如基于免疫的纯化(例如，免疫亲和色谱)、离子选择性介质上的色谱。如果肽是被修饰的，则还可通过使用适当介质如用于分离碳水化合物修饰的肽的凝集素来实现分离。在另一个实施方式中，采用SISCAPA方法，该方法在质谱分析之前对肽进行免疫分离。SISCAPA技术描述于例如美国专利第7,632,686号中。在其它实施方式中，在通过质谱法分析之前可使用凝集素亲和方法(例如，亲和纯化和/或色谱)来从裂解物中分离肽。分离肽群体的方法，包括基于凝集素的方法，描述于例如Geng等，J.Chromatography B，752：293-306(2001)中。免疫亲和色谱技术、凝集素亲和技术及其它形式的亲和分离和/或色谱(例如，反相、基于尺寸的分离、离子交换)可以任何合适的组合使用以促进通过质谱来分析肽。
令人惊讶的是，发现来自PD-L1蛋白质的许多潜在肽序列并不适合在基于质谱的SRM/MRM测定中使用或者在基于质谱的SRM/MRM测定中使用时是失效的，其原因不明。具体而言，发现不能在来自福尔马林固定的石蜡包埋组织的Liquid TissueTM裂解物中有效地检测或根本不能检测许多来自PD-L1蛋白质的胰蛋白酶肽。由于不可能预测最适合MRM/SRM测定的肽，因此必须通过实验在实际的Liquid TissueTM裂解物中鉴定修饰的和未修饰的肽以开发针对PD-L1蛋白质的可靠且准确的SRM/MRM测定。不希望受任何理论约束，但认为一些肽可能例如难以通过质谱检测，因为它们不会良好地电离或生成与其它蛋白质不同的片段。肽也可能无法在分离(例如，液相色谱)中良好地解析，或者附着到玻璃或塑料器具上。因此，可在由福尔马林固定的组织样品制备的Liquid TissueTM裂解物中检测的来自PD-L1蛋白质的那些肽(例如，表1和2中的肽)是可以在PD-L1蛋白质SRM/MRM测定中采用SRM/MRM测定的肽。在一个实施方式中，单一样品中同时制备PD-L1蛋白质的片段中采用的蛋白酶将是胰蛋白酶。
在本发明所述的多个实施方式中发现的PD-L1肽(例如，表1和/或表2)通过胰蛋白酶消化复杂的Liquid TissueTM裂解物内的所有蛋白质而来源于PD-L1蛋白质，该裂解物由从福尔马林固定的癌症组织中取得的细胞制备。除非另外指出，否则在各种情况下，该蛋白酶都为胰蛋白酶。Liquid TissueTM裂解物随后通过质谱分析以确定通过质谱检测并分析的来源于PD-L1蛋白质的那些肽。用于质谱分析的具体优选的肽亚组的鉴定基于：1)实验确定在Liquid TissueTM裂解物的质谱分析中电离的来自蛋白质的一种或多种肽，和2)肽在制备Liquid TissueTM裂解物中使用的方案和实验条件下继续存在的能力。后一性质的范围不仅是肽的氨基酸序列，而且是肽内的修饰的氨基酸残基在样品制备期间以修饰的形式继续存在的能力。
从福尔马林(甲醛)固定的组织中直接取得的细胞的蛋白质裂解物使用Liquid TissueTM试剂和方案制备，Liquid TissueTM试剂和方案要求经由组织显微解剖将细胞收集到样品管中，接着在Liquid TissueTM缓冲液中对细胞加热延长的一段时间。一旦负面地影响到福尔马林诱导的交联，则使用蛋白酶(例如在非限制性实施例中的胰蛋白酶的蛋白酶)消化组织/细胞至完全消化。通过用蛋白酶消化完整的多肽将各蛋白质裂解物而转化成肽的集合。分析(例如，通过离子阱质谱)各Liquid TissueTM裂解物以对肽进行多重全局性蛋白组学研究，其中数据表示为来自各蛋白质裂解物中存在的所有细胞蛋白质的可通过质谱鉴定的尽可能多的肽的鉴定结果。对于分析，通常采用离子阱质谱或能够进行全局性概要分析的另一形式的质谱来鉴定来自单一复杂蛋白质/肽裂解物的尽可能多的肽。尽管可在包括MALDI、离子阱或三重四极质谱的任何类型的质谱上开发并进行SRM/MRM测定，但通常认为对于SRM/MRM测定而言最有利的仪器平台是三重四极质谱仪器平台。
一旦在所采用的条件下在单一裂解物的单一MS分析中鉴定出尽可能多的肽，则整理肽的列表并将其用于确定在该裂解物中检测到的蛋白质。对于多种Liquid TissueTM裂解物重复该过程，且将非常大的肽列表整理成单一数据集。可将该类型的数据集视为代表可在分析的生物样品类型中(蛋白酶消化之后)、特别是在生物样品的Liquid TissueTM裂解物中检测到的肽，且因此包括诸如PD-L1蛋白质的具体蛋白质的肽。
在一个实施方式中，鉴定为可用于确定PD-L1(例如，NCBI登录号Q9NZQ7，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)的绝对或相对含量的PD-L1胰蛋白酶肽列于表1。那些肽各自在由福尔马林固定的石蜡包埋组织制备的Liquid TissueTM裂解物中通过质谱检测。因此，表1中的每种肽或那些肽的任意组合(例如，表1中描述的那些肽中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或六种或更多种)为用于PD-L1蛋白质的定量SRM/MRM测定的候选物，该PD-L1蛋白质包括直接在福尔马林固定的患者或受试者组织中的PD-L1蛋白质。
表1
表1中列出的PD-L1肽包括从包括前列腺、结肠和乳腺的不同人类器官的多种不同福尔马林固定的组织的多种Liquid TissueTM裂解物中检测到的那些。那些肽各自被视为可用于福尔马林固定的组织中的PD-L1蛋白质的定量SRM/MRM测定。这些实验的进一步数据分析表明，并没有优先观察到来自任何特定器官位点的任何特定肽。因此，这些肽中的每一种都被认为是适合对来自来源于任何生物样品或体内的任何器官位点的任何福尔马林固定的组织的Liquid TissueTM裂解物进行PD-L1蛋白质的SRM/MRM测定。
包含同位素标记、但在其它方面与在该实施方式中的中列举的一种或多种肽相同的肽的组合物提供在本发明中且其制备用途、特别是作为质谱标准物的用途描述如下。
在一个实施方式中，表1中的一种或多种肽或那些肽的任意组合(例如，一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种)通过包括但不限于免疫方法(例如，Western印迹或ELISA)的不依赖于质谱法的方法测定。在一个实施方式中，这些测定使用福尔马林固定的组织进行。与如何获得涉及一种或多种肽的(绝对或相对)含量的信息无关，该信息可用于本文所述的方法中的任一种，包括指示(诊断)在患者或受试者中是否存在癌症、确定癌症的阶段/等级/状况、提供预后或确定对于患者或受试者的治疗性或治疗方案。
在进行SRM/MRM测定时一个重要的考虑因素为可用于肽分析的仪器的类型。尽管可在包括MALDI、离子阱或三重四极质谱仪的任何类型的质谱仪上开发并进行SRM/MRM测定，但目前用于SRM/MRM测定的最有利的仪器平台通常被认为是三重四极仪器平台。该类型的质谱常被视作最适用于分析可由来自细胞内含有的所有蛋白质的数万至数百万个单个肽组成的很复杂的蛋白质裂解物内的单个分离的靶标肽。
为了对来源于PD-L1蛋白质的各种肽最有效地实施SRM/MRM测定，需要在分析中利用除了肽序列之外的信息。该额外信息可用于引导并指导质谱(例如，三重四极质谱)对特异性靶标肽进行正确且集中的分析，从而可有效地进行测定。
关于靶标肽总体和关于特定PD-L1肽的额外信息可包括各种肽的单同位素质量、其前体电荷状态、前体m/z值、m/z过渡离子和各过渡离子的离子类型中的一种、两种、三种、四种或更多种。对于来自表1中列表的一(1)种PD-L1肽，可用于开发用于PD-L1蛋白质的SRM/MRM测定的额外肽信息示于表2中。可制备、获得表2所示的针对肽进行描述的额外信息并将其应用到来自PD-L1蛋白质的任何其它肽的分析中，所述肽包括在其它蛋白酶或蛋白酶组合(例如，胰蛋白酶和/或LysC)的作用下生成的那些肽。SEQ ID NO：4的肽的一种、两种、三种或四种过渡离子的任意和所有的组合可用于该测定。
表2
在一些实施方式中，适用于PD-L1蛋白质的测定的肽(例如，在表1中阐述并显示为SEQ ID No.1-7的肽)可含有肽序列内部的额外蛋白水解位点，其如果被切割则将生成子肽(sub-peptide)。这类子肽可通过评价鉴定的肽序列中所需蛋白酶的蛋白水解切割位点来识别。在一个实施方式中，胰蛋白酶肽可包括额外的内部胰蛋白酶切割位点，其可在由胰蛋白酶进一步切割时产生子肽。在另一实施方式中，胰蛋白酶肽可含有蛋白酶的内部位点，所述蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶、GluC、AspN、糜蛋白酶和/或LysC，其可在由胰蛋白酶、GluC、AspN、糜蛋白酶和/或LysC中的任一种、两种或更多种切割时形成子肽。在另一实施方式中，LysC肽可含有其它蛋白酶如GluC、AspN、糜蛋白酶和/或胰蛋白酶的内部位点，其可在由GluC、AspN、糜蛋白酶和/或胰蛋白酶中的任一种、两种或更多种切割时形成子肽。应理解SEQ ID No.1-7中描述的任一种或多种肽的此类子肽、特别是胰蛋白酶、GluC、AspN、糜蛋白酶和/或LysC切割片段都示于且在本公开内容的范围内。
本发明中描述的实施方式包括包含表1和2中的一种或多种肽的组合物，且可任选包括经同位素标记、但在其它方面与在表1和2中的一种或多种肽相同的肽。在一些实施方式中，这些组合物包含表1和2中的肽中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种或全部七(7)种。这类组合物可任选包含以下的肽、多肽或蛋白质：其氨基酸序列包含同位素标记、但在其它方面与表1和表2中的一种或多种肽相同的肽。在采用包含表1和表2中的肽中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种的同位素标记的合成或天然的肽、多肽或蛋白质的情况下，蛋白酶处理释放经同位素标记、但在其它方面与在表1和2中的肽相同的肽。这类同位素标记的生物制剂或生物合成肽可例如使用同位素标记的氨基酸在程序性细胞裂解物中或细胞培养物中制备。同位素标记的肽中的每一种可用独立地选自由以下各物组成的组的一种或多种同位素标记：18O、17O、34S、15N、13C、2H或其组合。包含来自PD-L1蛋白质的肽(无论是同位素标记的，还是未标记的)的组合物不必含有来自该蛋白质的所有肽(例如，完整的一组胰蛋白酶肽)。在一些实施方式中，这些组合物不含有来自PD-L1蛋白质的组合形式的所有肽，具体而言是不含有表1和表2中的所有肽。包含肽的组合物的形式可以是干燥或冻干材料、液体溶液(例如，水溶液)或悬浮液、阵列或印迹。
在一个实施方式中，关于特定PD-L1肽的额外信息包括由PD-L1蛋白质的LysC蛋白水解产生的肽的各肽单同位素质量、其前体带电状态、前体m/z值、m/z过渡离子和各过渡离子的离子类型中的一种或多种、两种或更多种或三种或更多种。
在另一实施方式中，关于特定PD-L1肽的额外信息包括由PD-L1蛋白质的胰蛋白酶蛋白水解产生的肽的各肽单同位素质量、其前体带电状态、前体m/z值、m/z过渡离子和各过渡离子的离子类型中的一种或多种、两种或更多种，或三种或更多种。
在另一实施方式中，关于特定PD-L1肽的额外信息包括由PD-L1蛋白质的胰蛋白酶和/或LysC蛋白水解产生的肽的各肽单同位素质量、其前体带电状态、前体m/z值、m/z过渡离子和各过渡离子的离子类型中的一种或多种、两种或更多种或三种或更多种。在一个实施方式中，来自PD-L1蛋白质的单一胰蛋白酶和/或LysC蛋白水解肽与相关额外信息一起用于诊断确定中。
某些实施方式
本发明的某些实施方式如下文所述。
1.一种测量生物样品中PD-L1蛋白质水平的方法，包括使用质谱检测和/或定量由所述生物样品制备的蛋白质消化物中的一种或多种修饰的和/或未修饰的PD-L1蛋白质片段肽的含量；以及计算所述样品中修饰的和/或未修饰的PD-L1蛋白质的水平；且
其中所述含量是相对含量或绝对含量。
2.实施方式1所述的方法，还包括在检测和/或定量一种或多种修饰的和/或未修饰的PD-L1蛋白质片段肽的含量前对所述蛋白质消化物进行分级的步骤。
3.实施方式2所述的方法，其中所述分级的步骤选自凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米反相液相色谱、高效液相色谱或反相高效液相色谱。
4.实施方式1-3中任一项所述的方法，其中所述生物样品的所述蛋白质消化物通过Liquid TissueTM方案制备。
5.实施方式1-3中任一项所述的方法，其中所述蛋白质消化物包括蛋白酶消化物。
6.实施方式5所述的方法，其中所述蛋白质消化物包括胰蛋白酶和/或LysC消化物。
7.实施方式1-6中任一项所述的方法，其中所述质谱包括串联质谱、离子阱质谱、三重四极质谱、MALDI-TOF质谱、MALDI质谱和/或飞行时间质谱。
8.实施方式7所述的方法，其中使用的质谱模式是选择反应监测(SRM)、多反应监测(MRM)和/或多选择反应监测(mSRM)或其任意组合。
9.实施方式1-8中任一项所述的方法，其中所述PD-L1蛋白质片段肽包括如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
10.实施方式1-9中任一项所述的方法，其中所述生物样品为血液样品、尿样品、血清样品、腹水样品、疲液样品、淋巴液、唾液样品、细胞或实体组织。
11.实施方式1-10中任一项所述的方法，其中所述生物样品为福尔马林固定的组织。
12.实施方式1-11中任一项所述的方法，其中所述生物样品为石蜡包埋的组织。
13.实施方式1-12中任一项所述的方法，其中所述生物样品为从肿瘤中获得的组织。
14.实施方式13所述的方法，其中所述肿瘤为原发肿瘤。
15.实施方式13所述的方法，其中所述肿瘤为继发肿瘤。
16.实施方式1-15中任一项所述的方法，其进一步包括定量修饰的和/或未修饰的PD-L1蛋白质片段肽。
17(a).实施方式1-16中任一项所述的方法，其中定量所述PD-L1蛋白质片段肽包括比较一种生物样品中包含PD-L1蛋白质的约8至约45个氨基酸残基的氨基酸序列的一种或多种PD-L1蛋白质片段肽的含量与另外一个不同的样品或生物样品中相同PD-L1蛋白质片段肽的含量。
17(b).实施方式1-16中任一项所述的方法，其中定量所述PD-L1蛋白质片段肽包括比较一种生物样品中如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的包含PD-L1蛋白质的约8至约45个氨基酸残基的氨基酸序列的一种或多种PD-L1蛋白质片段肽的含量与另外一个不同的生物样品中相同PD-L1蛋白质片段肽的含量。
18.实施方式17(a)或17(b)所述的方法，其中定量一种或多种PD-L1蛋白质片段肽包括通过与已知含量的添加的内标肽相比较来确定生物样品中各PD-L1蛋白质片段肽的含量，其中所述生物样品中各PD-L1蛋白质片段肽的含量与添加的具有相同氨基酸序列的内标肽相比较。
19.实施方式18所述的方法，其中所述内标肽是同位素标记的肽。
20.实施方式19所述的方法，其中所述同位素标记的内标肽包括选自18O、17O、34S、15N、13C、2H或其组合的一种或多种重稳定同位素。
21.实施方式1-20中任一项所述的方法，其中检测和/或定量所述蛋白质消化物中一种或多种修饰的或未修饰的PD-L1蛋白质片段肽的含量表示患者或受试者中存在修饰的或未修饰的PD-L1蛋白质且与癌症相关联。
22.实施方式21所述的方法，其进一步包括关联所述检测和/或定量一种或多种修饰和/或未修饰的PD-L1蛋白质片段肽的含量或所述PD-L1蛋白质的含量的结果与所述癌症的诊断阶段/等级/状况。
23.实施方式22所述的方法，其中关联所述检测和/或定量一种或多种修饰的或未修饰的PD-L1蛋白质片段肽的含量或所述PD-L1蛋白质的含量的结果与所述癌症的诊断阶段/等级/状况与检测和/或定量其它蛋白质或来自其它蛋白质的肽的含量以多路格式组合，从而提供关于所述癌症的诊断阶段/等级/状况的额外信息。
24.实施方式1-23中任一项的方法，其进一步包括基于一种或多种PD-L1蛋白质片段肽的存在、不存在或含量或者PD-L1蛋白质的含量为患者或受试者选择治疗方法，所述生物样品获自所述患者或受试者。
25.实施方式1-24中任一项的方法，其进一步包括向患者或受试者给予治疗有效量的治疗剂，所述生物样品获自所述患者或受试者，其中所述治疗剂和/或所述治疗剂的给药量基于一种或多种修饰的或未修饰的PD-L1蛋白质片段肽的含量或PD-L1蛋白质的含量。
26.实施方式24和25的方法，其中所述治疗或所述治疗剂针对表达PD-L1蛋白质的癌细胞。
27.实施方式1-27所述的方法，其中所述生物样品为已经采用Liquid TissueTM方案和试剂处理以便定量一种或多种修饰的或未修饰的PD-L1蛋白质片段肽的含量的福尔马林固定的肿瘤组织。
28.实施方式1-28中任一项的方法，其中所述一种或多种修饰的或未修饰的PD-L1蛋白质片段肽为表1中的肽中的一种或多种。
29.一种组合物，其包含表1中的肽中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种和/或其抗体。
示例性SRM/MRM测定方法
如下所述的方法用于：1)鉴定可用于PD-L1蛋白质的基于质谱的SRM/MRM测定的来自PD-L1蛋白质的候选肽，2)针对来自PD-L1蛋白质的靶标肽开发单个SRM/MRM测定或多种SRM/MRM测定，和3)将定量测定应用于癌症诊断和/或最佳疗法的选择。
1.PD-L1蛋白质的SRM/MRM候选片段肽的鉴定：
a.使用一种或多种蛋白酶(可能包括或可能不包括胰蛋白酶)消化蛋白质，从而由福尔马林固定的生物样品制备Liquid TissueTM蛋白质裂解物
b.在离子阱串联质谱上分析Liquid TissueTM裂解物中的所有蛋白质片段并鉴定来自PD-L1蛋白质的所有片段肽，其中单个片段肽不含任何诸如磷酸化或糖基化的肽修饰
c.在离子阱串联质谱上分析Liquid TissueTM裂解物中的所有蛋白质片段并鉴定来自带有诸如磷酸化或糖基化残基的肽修饰的PD-L1蛋白质的所有片段肽
d.可测量由完整的全长PD-L1蛋白质通过具体消化方法可能产生的所有肽，但用于开发SRM/MRM测定的优选肽为在由福尔马林固定的生物样品制备的复杂Liquid TissueTM蛋白质裂解物中通过质谱直接鉴定的那些
e.在分析来自福尔马林固定的生物样品时将在患者或受试者组织中特异性修饰(磷酸化、糖基化等)并在质谱中电离化且因此可检测的肽鉴定为用于测定PD-L1蛋白质的肽修饰的候选肽
2.来自PD-L1蛋白质的片段肽的质谱测定
a.将针对Liquid TissueTM裂解物中鉴定的单个片段肽的三重四极质谱上的SRM/MRM测定应用于来自PD-L1蛋白质的肽
i.针对包括但不限于以下实验的最佳色谱条件确定片段肽的最佳保留时间：凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米反向液相色谱、高效液相色谱或反向高效液相色谱
ii.确定肽的单同位素质量、各肽的前体电荷状态、各肽的前体m/z值、各肽的m/z过渡离子和各片段肽的各过渡离子的离子类型以开发用于各肽的SRM/MRM测定。
iii.随后可使用来自(i)和(ii)的信息在三重四极质谱上进行SRM/MRM测定，其中各肽均具有特征性且独特的SRM/MRM特征峰，该特征峰精确地限定在三重四极质谱上进行的独特的SRM/MRM测定
b.进行SRM/MRM分析使得来自SRM/MRM质谱分析的独特SRM/MRM特征峰面积的函数形式的所检测的PD-L1蛋白质的片段肽的含量可指示特定蛋白质裂解物中PD-L1蛋白质的相对含量和绝对含量。
i.相对定量可通过以下实现：
1.通过比较以下数值来确定PD-L1蛋白质的增加或减少的存在量：来自一种福尔马林固定的生物样品的Liquid TissueTM裂解物中检测到的给定PD-L1肽的SRM/MRM特征峰面积与来自至少第二、第三、第四或更多的福尔马林固定的生物样品的至少第二、第三、第四或更多的Liquid TissueTM裂解物中相同PD-L1片段肽的相同SRM/MRM特征峰面积
2.通过比较以下数值来确定PD-L1蛋白质的增加或减少的存在量：来自一种福尔马林固定的生物样品的Liquid TissueTM裂解物中检测到的给定PD-L1肽的SRM/MRM特征峰面积与由来源于不同且单独的生物来源的其它样品中的其它蛋白质的片段肽发展的SRM/MRM特征峰面积，其中针对肽片段的两种样品之间的SRM/MRM特征峰面积的比较标准化至各样品中分析的蛋白质的含量。
3.通过比较以下数值来确定PD-L1蛋白质的增加或减少的存在量：给定PD-L1肽的SRM/MRM特征峰面积与来自福尔马林固定的生物样品的相同Liquid TissueTM裂解物内的不同蛋白质来源的其它片段肽的SRM/MRM特征峰面积，从而将PD-L1蛋白质的变化水平标准化至多种细胞条件下都不改变其表达水平的其它蛋白质的水平。
4.这些测定可应用于PD-L1蛋白质的未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中以与确定未修饰的肽的相对含量相同的方式确定修饰的肽的相对水平。
ii.给定肽的绝对定量可通过比较以下数值来实现：来自单个生物样品中的PD-L1蛋白质的给定片段肽的SRM/MRM特征峰面积与掺入来自生物样品的蛋白质裂解物中的内部片段肽标准物的SRM/MRM特征峰面积
1.内标物为测量中的PD-L1蛋白质的片段肽的经标记的合成形式。将该标准物以已知量掺入样品中，并可单独地确定生物样品中的天然肽片段和内部片段肽标准物的SRM/MRM特征峰面积，接着比较两个峰面积
2.这可应用于未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中这些修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中可以与确定未修饰的肽的绝对水平相同的方式来确定修饰的肽的绝对水平。
3.将片段肽定量应用于癌症诊断和治疗
a.进行PD-L1蛋白质的片段肽水平的相对和/或绝对定量并说明证实了患者或受试者肿瘤组织中的PD-L1蛋白质表达与阶段/等级/状况的先前确定的关联性，如同在癌症领域中充分理解的那样
b.进行PD-L1蛋白质的片段肽水平的相对和/或绝对定量并说明与来自不同治疗策略的临床结果的关联性，其中该关联性已经在该领域中说明或可在将来说明(通过针对患者或受试者群或来自那些患者或受试者的组织的关联性研究)。一旦通过该测定证实了先前确立的关联性或将来得出的关联性，则该测定方法可用于确定最佳治疗策略
该内标物可为测量中的来自PD-L1蛋白质的片段肽的经标记的合成形式(或包含蛋白水解时释放的片段肽的经标记的合成形式的蛋白质或多肽)。将该标准物以已知含量掺入样品中，并可单独地确定生物样品中天然片段肽和内部片段肽标准品的SRM/MRM特征峰面积，接着比较两个峰面积。
这可应用于未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中这些修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中可以与确定未修饰的肽的绝对水平相同的方式来确定修饰的肽的绝对水平。
基于福尔马林固定的患者来源或受试者来源的组织的分析对组织中PD-L1蛋白质水平的评价可提供关于各特定患者或受试者的诊断、预后和治疗有关的信息。本发明描述了一种测量生物样品中PD-L1蛋白质的水平的方法，其包括使用质谱检测和/或定量由所述生物样品制备的蛋白质消化物中一种或多种修饰和/或未修饰的PD-L1蛋白质片段肽的含量；和计算所述样品中修饰的或未修饰的PD-L1蛋白质的水平；且其中所述水平为相对水平或绝对水平。在一个相关实施方式中，定量一种或多种PD-L1蛋白质片段肽包括通过与添加的已知含量的内标肽比较来确定生物样品中各PD-L1蛋白质片段肽的含量，其中该生物样品中的各PD-L1蛋白质片段肽均与添加的具有相同氨基酸序列的内标肽相比较。在一些实施方式中，该内标物为同位素标记的内标肽，其包含选自18O、17O、34S、15N、13C、2H或其组合的一种或多种重稳定同位素。
本发明所述的测量生物样品中PD-L1蛋白质(或作为其替代的片段肽)的水平的方法可用作患者或受试者中癌症的诊断指标。在一个实施方式中，可通过关联(例如比较)组织中发现的PD-L1蛋白质的水平与正常和/或癌性或癌前期组织中发现的PD-L1蛋白质的水平来将PD-L1蛋白质水平的测量结果用于确定癌症的诊断阶段/等级/状况。
用于检测福尔马林固定的患者组织中具体蛋白质的水平的当前唯一方法是免疫组织化学法(IHC)。该方法仅每次分析来自患者肿瘤组织样品的单一组织切片上的一种蛋白质。因此，为了分析多种蛋白质，必须观测多个组织切片，其耗费很多时间和劳动力。IHC使用抗体来检测靶标蛋白质的存在，且因为抗体与蛋白质具有非特异性结合的潜力，在任何IHC实验中都存在巨大的信号背景固有电位。另外，IHC充其量只是半定量的。出于这些问题，IHC无法同时提供对于多种蛋白质的客观定量分析。本发明的实施方式能够利用患者组织样品的单一切片以100％的测定特异性同时提供PD-L1蛋白质的客观定量，节省了大量时间和金钱，同时提供涉及PD-L1蛋白质表达的更有价值的数据。
该多路SRM/MRM测定还可包括对除PD-L1蛋白质以外的其它额外的蛋白质同时进行分析，所述额外的蛋白质包括诸如EGFR、IGF-1R和cMet的药物靶标蛋白质。这是有价值的，因为额外的蛋白质的分析也指示哪种额外的药物可用于治疗特定癌症。基于额外的示例性药物靶标蛋白质的分析的额外的药物的示例包括靶向EGFR受体的爱必妥(Erbitux)、靶向IGF-1R的芬妥木单抗(Figitumumab)，以及靶向c-Met和血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)的芬妥尼布(Foretinib)。靶向PD-L1的药物的一个示例是称作MPDL3280A或RG7446的工程改造的单克隆抗PD-L1抗体。该抗体可单独使用或与其他药物联用，例如与(贝伐单抗(bevacizumab))联用以针对实体瘤，以及与(威罗菲尼(vemurafenib))联用以针对转移性黑素瘤。
因为核酸和蛋白质两者都可由相同的Liquid TissueTM生物分子制备物分析，所以可以由用于蛋白质分析的相同样品中的核酸生成关于疾病诊断和药物治疗判断的额外信息。例如，如果PD-L1蛋白质由某些细胞以增加的水平表达，当通过SRM测定时，数据可提供关于细胞的状态及其不受控制地生长的潜在性、潜在的抗药性和癌症发展的信息。同时，可从相同的Liquid TissueTM生物分子制备物中存在的核酸中获得关于PD-L1基因和/或核酸及其编码的蛋白质的状况的信息(例如，mRNA分子及其表达水平或剪接变化)，可在PD-L1蛋白质的SRM分析的同时对其进行评价。可在PD-L1蛋白质的SRM分析的同时对不来自PD-L1且存在于相同生物分子制备物中的任何基因和/或核酸进行评价。在一个实施方式中，关于PD-L1蛋白质和/或一种、两种、三种、四种或更多种额外的蛋白质的信息可通过检查编码那些蛋白质的核酸来评价。那些核酸可例如通过以下方法中的一种或多种、两种或更多种或三种或更多种检查：测序方法、聚合酶链式反应方法、限制性片段多态性分析、插入、缺失的鉴定，和/或是否存在突变的确定，包括但不限于单碱基对多态性、转换、颠换或其组合。
上述方法和组合物的描述和示例性实施方式用于说明本发明的范围。然而，由于存在对于本领域技术人员而言显而易见的变化，本发明的内容并不旨在局限于上述具体实施方式。