用于获取对肝纤维化鉴别诊断有用的数据的方法与流程

本发明属于医学和分子生物学领域，并且涉及一种方法用于获得对肝纤维化早期诊断有用的数据以及评估对所述疾病的治疗的反应的方法，从而允许建立（定量）特异性识别的单例模式（治疗后修改），允许建立患者群体。

背景技术：

目前，慢性肝病是引起住院和死亡的主要原因之一，尤其是在同时感染HIV和HCV或HBV的患者中。肝脏疾病的发病率正在增加。

肝纤维化是对主要由酗酒、病毒感染或胆管阻塞引起的慢性损伤的病理生理反应。在纤维化过程中，细胞外基质成分，例如胶原蛋白和层粘连蛋白，发生累积。细胞外基质组分含量由多种分子和细胞机制控制，包括胶原产生细胞的增殖和活化。胶原产生细胞和细胞外基质的其他组分的最大来源是肝脏星状细胞（肝星状细胞，即HSCs）。在正常情况下，HSCs处于静止状态，并存储维生素A。肝脏损伤后，所述细胞通过激活和获取肌成纤维细胞的形式发生应答，它们进入细胞周期并开始分泌细胞外基质组分。胶原纤维的沉积有助于形成疤痕，破坏肝结构并因此影响肝细胞的代谢功能。如果损伤成因消失，则可以逆转肝纤维化。在这种情况下，触发肝再生机制，其中包括逆转HSCs的失活状态和复制能够取代功能性肝组织损失的肝细胞。然而，如果维持肝脏损害，肝纤维化的进展将带来不可逆转的疾病阶段，称为肝硬化，其中细胞外基质组分的过度积累扭曲了肝脏架构，则肝脏无法响应生物体代谢需求。

因此，纤维化是一种肝脏疾病中的常见现象，虽然它是非特异性的，其确切表征可用作诊断辅助。其评估包括确定其位置，分布和强度。所述位置可以是门脉，门脉周，腺泡内，带状，肝窦，桥式，或结节周。相对于分布，其也可以是局灶性，弥漫性，叶性，和节段性的。其强度分类为轻度，中度，激烈或严重，和肝硬化。

对纤维化等级的精确诊断，是确定肝脏疾病的进展，进行预后和采取治疗决定所必需的。

目前，肝活检是用于确定肝纤维化程度的参考方法，并已被广泛推荐用于评估是否需要以一种或其它治疗治疗患者。然而，已经开发了用于确定肝纤维化不同阶段的非侵入性操作，可分为两类：成像方法，诸如瞬时弹性测定法，和基于标志物血清定义的测试。

因此，FibroTest是通过结合5项根据年龄和性别调整的间接生化纤维化指标而计算得到的指数。所述标记与HSCs的活化相关联。HSCs是主要的肝纤维化细胞。目前，防止或逆转肝纤维化的主要治疗策略，都基于抑制肝星状细胞的活化或增殖，或者基于在活化细胞中诱导凋亡化。所述APRI测试指的是谷草转氨酶（AST）和血小板的关系指数。它是基于进行性纤维化与AST消除降低和血小板减少症的事实有关。 FIB-4是一种简单指数，其包括年龄，AST水平，转氨酶（ALT）水平和血小板计数。 HGM1和HGM2是基于常规实验室数据的两个肝纤维化诊断的简单指标。 HGM-1是基于血小板计数， AST和空腹血糖水平。 HGM-2是基于血小板计数，INR指数，碱性磷酸酶（ALP）和AST。

也有一些直接血清标志物，如透明质酸锌（zHA），IV型胶原，III型前胶原N端前肽（PIIINP），基质金属蛋白酶（MMP），由参与破坏细胞外基质（ECM）的HSCs分泌的蛋白水解酶，基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs），层粘连蛋白或人软骨39糖蛋白（YKL-40）。

欧洲肝纤维化组织（ELF）已经开发了一种使用年龄和zHA、PIIINP、TIMP-1血清水平的算法。另一种用于肝纤维化的测量模型是Hepascore，基于4种血清标志物水平：胆红素，γ-谷氨酰转肽酶（GGT），zHA和α-2-巨球蛋白，并考虑到年龄性别。

目前，肝纤维化也可以通过瞬时弹性成像（Fibroscan®）诊断，其由肝纤维化的新诊断技术组成，使用了发射和接收超声波的探头。所述超声波通过特定介质的传播速度随着所述介质的密度和弹性变化。使用物理方程，可以基于传输速度计算肝弹性，以这样的方式，速度越快，肝的弹性越低，硬度（纤维化）越高，后者是与弹性相反的性质。

肝活检是用于确定肝纤维化的存在和状态的目前首选诊断技术。可以通过几种系统来量化肝纤维化阶段，例如通过用苏木精和曙红或天狼星红对活检标本的胶原纤维染色进行组织学分析。最广​​泛使用的是METAVIR（METAVIR评分系统）。 METAVIR将纤维化度量在0-4的尺度范围上，其中，F0对应于无纤维化; F1为无隔膜门脉纤维化; F2为少量隔膜的门脉纤维化; F3为多隔膜无肝硬化；和F4，肝硬化。纤维化阶段等于或大于F2时，认为纤维化显著；当纤维化阶段等于或大于F3时，认为是晚期纤维化。检测患者处于F2或更严重阶段具有重要的临床意义，因为在大多数情况下，其被认为是开始治疗的临界点。除了组织学分析以外，还必须寻找确认纤维化进程存在的标记物。

转录因子GATA-4或GATA结合蛋白4（也称为ASD2和VSD1）是锌指型转录因子家族的成员，在各种器官胚胎发育期间表达，如心脏，胰脏，并在成年阶段继续表达。该家庭成员识别GATA基序，该基序存在于许多基因的启动子中。这种蛋白被认为调节参与胚胎发育和心肌分化及功能的基因。该基因的突变与心室间隔缺损有关。该基因位于人类染色体8（8p23.1-P22）。

对肝纤维化的存在和其大小的量化的检测，对肝脏疾病的临床管理决策至关重要。由于患有轻度或中度纤维化的个体治疗更可能有效，疾病更可能稳定甚至逆转，因此有必要找到一种标记物，来允许对此类纤维化的早期检测。

技术实现要素：

本发明的发明人所进行的实验室免疫组织化学分析表明，GATA-4在非病理学病症下的成人肝脏星状细胞中表达。然而，GATA-4表达在纤维化晚期减少。在C病毒引起的肝脏疾病（尤其是在酒精性肝病中）的活组织检查肝硬化阶段，该减少更为显著。

本发明的作者开发了一种方法和一种试剂盒，其中使用灵敏度足以区分纤维化早期和晚期及肝硬化阶段的标记物。

本发明的实施例展示了对患者组织样本中参与肝纤维化的GATA-4蛋白的免疫组织化学定位。

该蛋白质染色图案，在肝纤维化和肝硬化发展阶段不同的患者中是不一样的。

因此，本发明的第一方面涉及GATA-4基因或GATA-4蛋白在纤维化和硬化鉴别诊断中的应用。

本发明的又一方面涉及用于获取对纤维化和硬化鉴别诊断有用的数据的方法，包括：

a. 从个体获取包含细胞的分离生物样本；和

b. 在步骤a所述的分离样本中检测GATA-4基因的表达水平，和/或GATA-4蛋白量，和

c. 将步骤b中获得的基因表达与参照量进行比较。

上述方法中的步骤b和/或c可以完全或部分自动化，例如，使用传感器机械仪器在步骤b中检测含量或在步骤b中进行电脑化比较。

本发明的又一方面涉及下文中的本发明的第二种方法，即用于在个体中进行肝纤维化和肝硬化鉴别诊断的方法，包括根据本发明第一方法中所述步骤a至c，且进一步包括：

d. 当在步骤a中获取的所述样本中的GATA-4基因表达高于患者参照人群（FO）中检测到的所述基因表达量时，或当所述样本中的GATA-4蛋白量高于患者参照人群（F0）中检测到的所述蛋白量时，将步骤a中所述个体诊断为无隔膜门脉纤维化（F1）。在本发明此方面的一个优选实施例中，星状细胞核中检测到较高的GATA-4基因表达或GATA-4蛋白量。更优选地，所述步骤a中所述个体的GATA-4基因表达水平是所述患者参照人群（F0）的110%。

在又一个优选实施例中，当所述GATA-4基因表达水平比参照个体低15%-25%时，将步骤a中所述个体诊断为少量隔膜（FII）或多隔膜（FIII）无肝硬化门脉纤维化患者。更优选地，步骤a中所述个体的GATA-4基因表达水平比参照个体低约20%。

本发明的又一优选实施例中，当所述GATA-4基因表达水平比参照个体低55%-65%时，将步骤a中所述个体诊断为肝硬化 (FIV)患者。更优选地，步骤a中所述个体的GATA-4基因表达水平比参照个体低约60%。

分离的“生物样本”包括但不限于，本领域技术人员通过任何已知方法获得的生物体细胞、组织和/或生物液体。

在本发明此方面的一个优选实施例中，步骤a中来自个体的所述分离生物样本为组织样本，优选为肝组织样本。

对基因表达或蛋白质量的检测，可通过现有技术中已知的任何方法来进行。

对浓度的测定，优选以定量方式，可直接或间接进行。直接测量指的是，对表达水平的测量是基于直接从所述基因的转录物或者从其翻译所得蛋白质获得的信号与它们所转换的信号，所述信号与RNA分子或基因产生的蛋白质数目直接相关。这个信号也可以被称为强度信号，可以通过，例如，测量所述产物的化学或物理性质的强度值来获得。间接测量包括由次级组分或生物测定系统（例如对细胞反应、配体、“标签”或酶反应产物的测量）获得的测量结果。

说明书中使用的术语“比较”，是指，但不限于，转录因子GATA-4基因在待分析生物样本（也称为问题生物样本）中的表达水平，与本说明书中其他地方描述的一个或更多期望对照试样的GATA-4基因表达水平之间的比较。参考样本可以例如与问题生物样本同时或先后进行分析。本发明的方法的步骤（c）中所述的比较，可以是计算机辅助进行的。

基因或蛋白质的表达水平能提供基因或蛋白质表达的特定数据。术语“表达水平”，是指基因表达所得的生物化学材料，即RNA或蛋白质。有时基因产物量的测量用来推断基因的活跃程度。 “基因表达谱”是指在生物样本中，对感兴趣的基因或生物标记，即GATA-4基因，产生的mRNA定量化后获得的基因表达谱。基因表达谱的制作，优选地，通过在分离生物样本中提取总RNA之前，测定从其转录的mRNA水平，其可以使用本领域中已知的试验方法。 mRNA的转录因子为了确定从GATA-4基因转录所得的mRNA水平，可以通过，例如但不限于，聚合酶链反应（PCR）扩增，逆转录和逆转录聚合酶链式反应的组合（RT -PCR），直接mRNA测序，基因表达系列分析（SAGE，SuperSAGE）；以任何机制沉积由寡核苷酸的RNA芯片；用通过光刻或任何其他原理原位合成的寡核苷酸制作的RNA微阵列；使用以任何标记法标记的GATA-4基因特异性探针进行原位杂交；通过电泳凝胶；通过转移到膜上并与特异性探针杂交；通过核磁共振或任何使用顺磁性纳米颗粒或任何其他类型的抗体功能化可检测纳米颗粒的诊断成像技术；或者通过任何其它手段。蛋白质表达谱是指，通过例如但不限于免疫印迹检测，使用蛋白质检测和/或定量得到的表达谱，所述蛋白质是从GATA-4基因转录获得的mRNA翻译产物。更优选地，所述GATA-4基因表达的定量检测，可以通过实时PCR（RT-PCR或RTqPCR）进行。扩增产物的实时检测，可通过使用分布在双链DNA中的荧光分子或通过不同类型探针的杂交来进行。

更优选地，使用Q-RT-PCR检测所述GATA-4基因表达水平。

实时定量PCR（Q-RT-PCR）是用于定量分析敏感和可重现的基因表达的技术，可用于特别是细胞和组织中的基因谱表达。任何方法均可以用于RT-PCR的结果评估，​​且可以优选为所述ΔΔCT方法。所述ΔΔCT方法详细记载于Livak和col. (Methods 2001, 25:402-408)中。（Ct =循环阈值）。当实施本发明时，ΔΔCT方法应优选为根据Livak和col. (Methods 2001, 25:402-408)来执行。所述ΔΔCT方法涉及“对照样本”和“受试者样本”。所述“来自受试者的样本”是从待测试受试者获得的样本。对于每个样本，包括靶基因（此处为感兴趣的基因）和控制内源基因（如下所述），用于试样（通常为系列稀释液）的PCR扩增。通常每个稀释浓度使用若干重复样本，以推导扩增效率。 PCR扩增效率可以定义为扩增百分比（从0到1）。在qPCR反应中，通常用软件测量每个样本的循环数，其中荧光与任意线（PCR扩增指标）橡胶，如阈值。该交叉点即为Ct值。更稀释样本的相交得到后续Ct值。为了定量特定基因的基因表达，将感兴趣基因的核酸Ct除以相同样本中的内源对照的核酸Ct，以正态化不同样本之间的数量和质量差异，并得到每个“对照样本”和“受试者样本”的相对表达（相对于内源对照）。可选地，其为一式两份，一式三份，四份，并分别以类似方式进行。ΔCT对照值可以通过从由若干个体组成的对照组的样本获得的ΔCT值计算平均值来得到，其中“受试者样本”的值与所述个体比较。对照组（其平均值被计算）由相应目的（比较）的对应个体组成。本领域技术人员将从本说明书中了解，适当的对照组用于特定目的。在一个特定的实施例中，可以在省略对照组ΔCT值确定步骤的情况下实施本发明，亦即，通过（仅）确定“受试者样本”的ΔCT值，然后将其与实施例中所示的对照的各平均值相比较来实施。

如上所述，现有技术中还存在其他的可用方法，例如Northern印迹转移，或微阵列。

因此，在本发明的这一方面的另一优选实施例中，GATA-4基因表达的产物检测是通过Northern印迹转移进行的。在本发明的另一个方面中，GATA-4基因的表达产物的检测使用微阵列进行。

所述GATA-4基因，或GATA结合蛋白4（也称为ASD2; VSD1）编码锌指转录因子GATA家族的成员之一。该家庭的成员识别GATA基序，其存在于许多基因的启动子中。这种蛋白被认为调节参与胚胎发育和心肌分化及功能的基因。该基因的突变与心室间隔缺损有关。该基因位于人类染色体8（8p23.1-P22）。

在本发明的上下文中，GATA-4也由一种核苷酸或多核​​苷酸序列所限定，其构成如SEQ ID NO：1中的蛋白编码序列所示，且其中可以包括不同变体：

a）编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的核酸分子；

b）互补链可与a）的多核苷酸序列杂交的核酸分子；

c）由于遗传密码的简并性而序列不同于a）和/或b）的核酸分子；

d）编码包含与SEQ ID NO：1具有至少80％，90％，95％，98％或99％序列一致性的氨基酸序列的多肽的核酸分子，且其中由所属核酸编码的多肽表现出GATA-4蛋白的活性和结构特征。所述核酸分子中，其中之一包含在SEQ ID NO：2中。

本申请中所称的术语“诊断”，指的是区分患有或未患肝纤维化或肝硬化的患者的能力，和/或区分肝纤维化不同阶段（FL，FII，FIII）的能力。特别是，本发明的试剂盒能够区分第一阶段（F1），第二和第三阶段（FII和FIII）和肝硬化（FIV）。

在本发明中，“预后”是指一种疾病的预期发展，并且是指根据个体患有疾病的概率的评估，以及对发病、发展、演变或消退的评估，和/或疾病未来进程的预后。对于本领域技术人员而言，显而易见地，尽管所述评估优选为对100%待诊断对象正确，但也可以并非如此。但是，该术语需要统计显著部分的受试者可以被识别为患病或患病倾向。本领域技术人员可以通过使用若干公知的统计评估工具，例如，判定置信区间，确定p值，学生t检验，Mann-Whitney检验等，容易地确定受试者是否为统计学显著。优选的置信区间为至少50％>，至少60％>，至少70％>，至少80％>，至少90％>，至少95％>。 所述p值优选为0.2，0.1，或0.05。

“响应预测”是指，在本发明的上下文中，确定该患者会对一种疗法或特定治疗，包括手术治疗，产生有利或不利的响应。特别是，本申请所称的术语“预测”，是指在确定患者演变中可能有用的任何参数的个别评估。对本领域技术人员而言，显而易见，虽然对临床治疗响应的预测优选为对待诊断或评估的100%受试者正确，但并非必须如此。但是，该术语需要统计显著部分的受试者可以被识别为较高的正响应概率。本领域技术人员可以通过使用若干公知的统计评估工具，例如，判定置信区间，确定p值，学生t检验，Mann-Whitney检验等，容易地确定受试者是否为统计学显著。优选的置信区间为至少50％>，至少60％>，至少70％>，至少80％>，至少90％>，至少95％>。 所述p值优选为0.2，0.1，或0.05。所述临床响应的预测可以通过使用本领域技术人员已知的肝脏病学技术中的任何终点来完成。

此外，根据本发明的方法，可以在该主分类中建立其他子分类，从而便于选择并建立适当的治疗方案或疗法。本领域技术人员可以理解，所述分类并不旨在对于待分析样本而言100％正确。然而，其要求有统计学显著数量的待分析样本被正确分类。所述统计学显著数量可以由本领域技术人员通过使用各种统计工具来确定，例如但不限于，通过确定置信区间，显著值P，学生检验或Fisher检验的辨别功能，Mann Whitney非参数测量，Spearman相关性，对数回归，线性回归，ROC曲线面积（AUC）。优选地，所述置信区间为至少90％，至少95％，至少97％，至少98％或至少99％。优选地，所述p值为小于0.1，小于0.05，小于0.01，小于0.005或小于0.0001。优选地，本发明允许在接受分析的特定人群或群体的对象的至少60％，最优选至少70％，进一步优选为至少80％，或甚至更优选在至少90％中正确地检测区分该疾病。

如说明书中所用的术语“个体”，是指动物，优选为哺乳动物，更优选为人类。术语“个体”不具有任何限制性，而可以是任何年龄、性别和身体状况。

所述参考量来自一组健康个体的基因组成型表达值或一组治疗前个体的基因表达。

所述参考量可以是，例如，在区分肝纤维化或肝硬化患者和健康个体的情况下，在健康个体组成的对照组中检测到的基因组成型表达或蛋白量。然而，在区分不同阶段肝纤维化患者的子类的情况下，控制组由某一肝纤维化发展阶段的患者组成。在本发明的这个方面的另一优选实施例中，从一个参考样本得到参考量。参考量可以是，例如，以已知统计技术在患有肝纤维化或不同阶段肝纤维化的个体人群的采样中获得的量的正态分布限值。在另一个优选的实施例中，从治疗前和治疗后的患者中获得的参照样本。

本发明的另一个方面涉及药物组合物的应用，所述组合物包含GATA-4基因调节剂，用于制备用于治疗以本发明的方法诊断为肝纤维化或肝硬化的个体的药物；或者可选地，涉及一种药物组合物，所述药物组合物包括GATA-4基因的调节剂，用于治疗以本发明的方法诊断为肝纤维化或肝硬化的个体。优选地，所述调节剂是所述基因的表达抑制剂。

蛋白质的定量

GATA-4蛋白量的定量可以通过任何本领域技术人员已知的技术，优选通过免疫学技术。

在更优选的实施例中，所述免疫学技术是基于沉淀反应，凝集反应，免疫标记，放射免疫测定，和放射免疫度量技术，ELISA（酶联免疫吸附测定法）或其任意组合。在另一个更优选的实施例中，所述免疫学技术包括免疫标记。在一个更优选的实施例中，所述免疫标记选自以酶标记抗体的免疫标记，以荧光染料标记抗体的荧光染料或流式细胞技术。更优选地，所述流式细胞术是流式细胞仪。

诊断试剂盒或装置，微阵列或蛋白质微阵列及其应用

本发明的另一方面涉及一种试剂盒或装置，以下称为本发明的试剂盒或装置，其包括分析GATA-4基因表达水平所需的组件。在另一个优选的实施例中，所述试剂盒可含有基于已知序列或mRNA而设计和/或能够与GATA-4基因序列杂交的寡核苷酸，用于后续PCR扩增。更优选地，所述GATA-4基因序列是核苷酸序列SEQ ID NO：2。

在另一个优选的实施例中，本发明的试剂盒或装置包括至少一种抗GATA-4抗体。在本发明这一方面的优选实施例中，所述抗体是人、人源化或合成抗体。在另一个更优选的实施例中，所述抗体是单克隆抗体。在另一个更优选的实施例中，抗体用荧光染料标记。更优选地，荧光染料选自荧光素（FITC），四甲基罗丹明及衍生物，藻红素（PE），PerCP，Cy5，Texas，别藻蓝蛋白，或其任意组合。

更优选地，其包括将步骤（b）中检测出的量与参考量比较所必需的装置。

此试剂盒可含有通过任何以上描述的方法分析GATA-4基因表达水平所必需的所有试剂。该试剂盒还可以包括，但不限于，缓冲剂，活性剂，防止污染的试剂，蛋白质降解抑制剂等。此外，所述试剂盒可以包括其实施和优化所需的所有载体和容器。优选地，该试剂盒也包含进行任何本发明的方法的说明书。

在（a）的情况下，提供了一种适合用于RQ-PCR的试剂盒，其是基因表达的灵敏且可再现的定量技术，所述试剂盒除试剂盒的寡核苷酸外，宜为还包括多T（poly-T）寡核苷酸引物。所述试剂可以可选地包括在试剂盒中。

Northern转移涉及使用电泳按大小来分离RNA样本，以及随后以与（部分）感兴趣的RNA靶序列互补的一种或多种寡核苷酸（杂交探针）进行检测。

也可能将寡核苷酸（多个）固定在（优选固体）表面上的斑点只不过。在实施例之一中，该试剂盒包括微阵列，或本发明的微阵列。RNA微阵列是固体基底（通常是载玻片或硅薄膜中的小区）上的阵列，其可评估大量可以通过固定在固体基底上的斑点中的特异性探针进行检测的不同RNA。每个点包含特定核酸序列，典型的是DNA序列，来作为探针（或指示物）。虽然点的数量不受到任何局限，但在优选的实施例中，可以定制微阵列以用于本发明的方法。在一个实施例中，这种定制的阵列包括50个点或更少，如30点或更少，包括20点或更少。因此，本发明的另一个方面涉及包含基于基因的已知序列或mRNA所设计和/或能够与GATA-4基因序列杂交的寡核苷酸的微阵列。更优选地，GATA-4基因序列是核苷酸序列SEQ ID NO：2。

本发明的另一个方面涉及微阵列，下文称为本发明的微阵列，包括：基于已知序列或GATA-4基因的mRNA而设计的寡核苷酸或单信道微阵列。更优选地，GATA-4基因的序列是核苷酸序列SEQ ID NO：2。

因此，举例而言，寡核苷酸序列使用以光刻法用单核苷酸连续伸长的生长链构建在芯片表面上。因此，该寡核苷酸是通过核苷酸选择性激活法经3'端锚定，以光不稳定试剂，通过经光掩模的光选择性入射加以保护。光掩模可以是物理的或虚拟的。

因此，寡核苷酸探针可以是10至100个核苷酸，最优选20到70之间个核苷酸，且更优选为24和30个核苷酸之间。为了基因表达的定量分析，优选为每个基因使用约40个寡核苷酸。

在固体基底（例如，玻璃）上的原位合成，可以通过喷墨技术进行，这需要较长的探针来完成。载体可以是，但不限于，NC或尼龙（加载）的过滤器或膜、硅或覆盖有氨基硅烷，聚赖氨酸，醛或环氧的显微镜玻璃载玻片。探针是芯片的每一个样本。目标是待分析样本：信使RNA，总RNA，PCR的片段等。

本发明的另一个方面涉及一种蛋白质微阵列，以下称为本发明的蛋白质微阵列，其包含抗GATA-4抗体。探针是附着到玻璃载玻片的抗体，空白对照是血清或组织样本。

本发明的另一个方面涉及使用所述试剂盒或装置，微阵列，或本发明的微阵列，用于获得对肝纤维化或肝硬化诊断有用的数据。

本发明的另一个方面涉及一种计算机可读存储​​介质，包括能够使计算机执行本发明的方法（本发明的第一个或第二种方法）中的任何步骤的软件指令。

本发明的另一个方面涉及包括能够使计算机执行本发明的方法的任何步骤的软件指令的传播信号。

术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合形式，可以是核糖核苷酸（RNA或RNA）和脱氧核糖核苷酸（DNA或DNA）。术语“氨基酸序列”，“肽”，“寡肽”，“多肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物形式，可以是编码或非编码，经过化学或生物化学修饰。

整个说明书和权利要求书任意的词语“包括”及其变型，不旨在排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。对于本领域技术，可以从本发明的描述和实施中得到本发明的其它目的，优点和特征。下面的实施例和附图仅提供作为说明，且并不意图限制本发明。

附图说明

图1：健康患者（正常）、纤维化I型（F1）、纤维化型II-III型（FII-Ⅲ）和肝硬化的人肝活组织天狼红染色的石蜡组织切片的组织学分析。天狼星红染色的胶原纤维反映出的纤维化和肝硬化程度显示为暗灰色/黑色。

图2：健康患者（正常）、纤维化I型（F1）、纤维化型II-III型（FII-Ⅲ）和肝硬化的人肝活组织天狼红染色的石蜡组织切片的免疫组化分析。星状细胞的细胞核中的GATA-4免疫检测观察为肝细胞之间的肝窦空格中的黑点。

图3：健康患者（FO）、纤维化I型（F1）、纤维化型II-III型（FII-Ⅲ）和肝硬化的人肝活检中的GATA4阳性细胞定量分析。

图4：健康患者（正常）、纤维化I型（F1）、纤维化型II-III型（FII-Ⅲ）和肝硬化的人肝活检中的肝组织GATA-4基因的信使RNA肝组织水平定量分析。

具体实施方式

现在将通过本发明人的实验对本发明进行说明，其证实了本发明的方法在获得对肝纤维化鉴别诊断有用的数据的特异性和效力。

方法

从人肝采集和准备样本

通过楔活检或移植肝切除获得人肝样本。样本收集自：

10位健康患者，通过常规活检获得；

5例不明原因肝纤维化的患者。根据METAVIR系统对纤维化进行了分类：

肝纤维化阶段（1例）

轻度或残留类门脉纤维化（4例）

肝硬化前期门脉纤维化，Ⅲ期（6例）

7例肝硬化样本，其中3例为酒精病因，2例为病毒病因引起的丙型肝炎病毒。

所有样本均在10％中性福尔马林中大致固定36小时。将固定的样本包埋在石蜡中，并切成5微米厚的切片用于后续的组织学和免疫组织化学分析。肝组织切片固定在预先用2％的3-氨基丙基 - 三乙氧基 - 木聚糖（APES）（Sigma Aldrich公司，目录号A3648）木聚糖化的载玻片上，并在60℃下培养12小时。

组织学分析

根据以下实验方案，以不同浓度二甲苯和乙醇洗涤数次以脱蜡，然后染色：

1. 样本浸入二甲苯：10分钟；

2. 样本浸入100％乙醇：5分钟；

3. 样本浸入90％乙醇：5分钟；

4. 样本浸入70％乙醇：5分钟；

5.用蒸馏水洗涤样本：10分钟；

6. 样本浸入维格特的铁苏木精（HT1079，Sigma Aldrich公司）8分钟；

7.用自来水（非蒸馏水）连续洗涤样本10分钟；

8. 样本浸入天狼星红苦味酸溶液一小时。天狼星红苦味酸溶液制备如下：0.5克天狼星红（​​直接红80，365548号，Sigma Aldrich公司商品号）加入500ml苦味酸（目录号P6744，Sigma Aldrich公司）；

9.以酸性水（酸性水通过将5ml乙酸加入995毫升蒸馏水制得）洗涤两次，各5秒钟；

10. 通过依次通过70％乙醇5分钟，90％乙醇5分钟和100％乙醇5分钟，来进行组织脱水；

11. 样本浸入二甲苯中5分钟；

12. 封固样本：添加DPX封固介质（目录编号HT1079，PROLABO），并盖上盖玻片。

用带DFC500相机的Leica AF6000显微镜，以偏振光和10x镜头拍照。

免疫组织化学分析

在上述方案的步骤5中获得的脱蜡样本，根据以下方案进行免疫组织化学分析：

1. 样本浸入10mM的柠檬酸盐溶液（pH 6）并在高压釜中于121℃加热40分钟以揭露表位（10mM柠檬酸钠，S-4611，Sigma Aldrich公司）。要得到pH6的柠檬酸，使用的是C-0759（Sigma Aldrich公司）。

2. 加热后，将样本在室温下放冷，蒸馏水洗涤​​两次，并在以蒸馏水稀释的3％过氧化氢中培养10分钟，以封闭内源性过氧化物酶的活性。

3. 用以磷酸盐缓冲盐水液（PBS，目录号P5368，Sigma Aldrich公司）稀释的3％驴血清（目录号D9663，Sigma Aldrich公司），并加入0.2％ Triton X-100（目录号A4975，AppliChem）在室温下封闭样本1小时。

4. 封闭培养后，将样本用单克隆小鼠抗GATA-4抗体（G-4，Sc-25310，Santa Cruz Biotechnologies公司）的1:50稀释液在4℃下培养过夜。该抗体在PBS中稀释+ 3％NGS + 0.2％ Triton X-100。

5. 用抗体培养后，以PBS将样本洗涤3次，每次5分钟，用小鼠生物素化二抗（产品目录编号BA-2020，Vector Laboratories公司）的PBS + 3 ％NGS + 0.2％Triton X-100的1：300稀释液，在室温下培养1小时。

6. 然后，将样本用PBS洗涤三次，每次5分钟，最后用蒸馏水洗涤，并用Vectastain Elite ABC免疫过氧化物酶（产品目录编号PK-6100，Vector Laboratories公司）培养，按照制造商的说明进行操作；

7. 根据过氧化物酶底物DAB试剂盒（目录号SK-4100，Vector Laboratories公司）的说明书，用PBS洗涤三次，并用二氨基联苯胺（DAB）显现。

8. 试样依次在90％乙醇，70％乙醇，100％乙醇和二甲苯中通过5分钟，以脱水，然后用DPX封固，以带DFC500照相机的Leica AF6000显微镜以10倍，20倍和40倍进行拍照。

在经过免疫组织化学技术分析的活组织切片中进行GATA4阳性细胞的定量分析

此前通过免疫组化技术检测GATA4的所有肝活组织切片的照片，使用软件MetaMorph 7.1进行处理。使用软件MetaMorph 7.1的阈值功能，选择性地检测标记GATA4阳性细胞的二氨基联苯胺（DAB）的正像素。GATA4阳性面积获取为DAB阳性像素和完整图像像素数目之间的比率。星号表示正常患者和肝硬化患者中的GATA-4表达水平之间的统计显著性（非成对样本的学生t检测中p = 0.05）。

信使RNA定量分析

使用mirVana miRNA分离试剂盒（Ambion公司，目录编号1560）从健康患者（F0）、纤维化I型、纤维化型L​II-III或肝硬化患者的肝脏活组织样本获取总RNA。在所有情况下，使用10-13个20微米厚的新鲜肝脏样本切片。从5例健康患者（F0），2例肝纤维化Ⅰ型，1例纤维化型II-III和5例肝硬化患者采集活组织样本。用QUANTITEC逆转录试剂盒（Qiagen，目录号205313）进行逆转录反应。为了进行聚合酶链反应，用Taqman基因表达主混合物（Applied Biosystem，产品号436016）和商售Taqman探针进行GATA-4基因（GATA-4 Hs00171403_m1 Applied Biosystem）的扩增和乙肌动蛋白（Hs03023880_g1 Applied Biosystem）内参基因的扩增。聚合酶链反应在热循环仪Real Time PCR 700 (Applied Biosystem)中进行。星号表示正常患者和肝硬化患者中的GATA-4表达水平之间的统计显著性（非成对样本的学生t检测中p = 0.05）。 在三次独立试验中，每一样本一式三份地进行GATA-4表达水平的量化。