用于诊断肺结核的方法与流程

本申请要求南非临时专利申请号2014/01456的优先权，其通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及诊断受试者中结核的方法。

背景技术：

结核(TB)是主要的健康问题并且是发展中世界的一种最大的杀手，据估计每年有9百万新病例和150万人死亡(85％的病例出现在亚洲和非洲)。在最近这些年，在也感染了HIV的人中，结核病急剧增多。另外，疾病的抗药性菌株逐渐增多。控制TB的扩散严重受到疾病难以诊断和治疗的限制，十分缺乏处理该疾病的新工具。

在发展中国家，用于诊断活动性TB的最广泛使用的测试依赖于在显微镜(涂片镜检)下检查患者的粘液。几乎在140年前开发的这种方法检测小于一半的所有活动性TB病例并且尤其很大程度上不能检测儿童、与HIV共同感染的疾病和具有抗药性形式的TB或其他的肺疾病的那些。分支杆菌结核(结核分枝杆菌)培养设施在资源受限地区中还未广泛地使用并且培养结果可能需要多达42天才能可用[5]。

最近开发新的TB诊断方法的活动逐渐增多，但是这些仍需要实验室、稳定的电源和熟练员工递送结果，这在偏远和农村地区是难以实现的。

高级TB免疫诊断测试，比如所谓的干扰素γ(IFN-γ)释放试验(IGRAs)，已经证实可用于诊断结核分枝杆菌感染[12-14]并且在高收入、低负担地区使用。但是，这些试验不能区分潜伏TB疾病和活动性TB并且所以不推荐在高负担地区使用[15]。已经尝试鉴定目前在IGRAs中使用的那些(ESAT-6/CFP-10/TB7.7)之外的新的抗原[16-18]，或响应目前在IGRAs中使用的抗原产生的新的宿主生物标志物[17,19-24]，但是这些研究仍在继续(参见[24])。

研究人员已经研究了用结核分枝杆菌特异性抗原刺激血液细胞之后不同的细胞因子分泌方式[24]。这些大部分是基于流式细胞术和ELISPOT的方法并且已经表明，例如产生IFN-γ和IL-2的T细胞的频率和比例的列举可能具有潜能用于TB疾病的诊断[25-28]。但是，依赖于从全血分开分离的细胞的诊断方法是麻烦的并且需要实验室能力，而这在资源受限的地区通常不现实。

先前已经显示，用结核分枝杆菌特异性抗原刺激之后全血样品中IFN-γ之外的宿主生物标志物的测量潜在地作为TB疾病的诊断形式[19,21,22,24]。但是，基于这些宿主生物标志物的测试(在Quantiferon上清液中检测的检测)需要过夜温育包含样品的Quantiferon管并且所以结果必须在从样品收集时的24小时后可用。对于基于刺激来自疑似患有新的结核分枝杆菌感染阶段依赖性抗原的TB疾病的个体的全血的方法，情况也是这样[16,20,30]。基于从全血分开外周血液单核细胞，用结核分枝杆菌特异性抗原刺激血液细胞和通过ELISPOT或流式细胞术评估产生细胞因子，尤其IFN-γ、TNF-α和IL-2的细胞的频率的诊断方法[25-28]已经显示出在诊断TB疾病中的潜能。但是，这些技术是麻烦的并且更适于研究实验室而不是常规的医院实验室，原因是需要高的技术水平，以分离细胞并且实施ELISPOT和流式细胞术。

如果基于这些方法的试验继续显示出希望，这些测试将基于大量集中的和专业的实验室并且不容易在通常具有最高TB负担的资源受限的地区实现。相应的获得测试结果的较长时间，将使得疾病诊断延迟，延迟了启动患者治疗并且从而增加了疾病在患者接触者中传播的风险。

Xpert MTB/RIF测试(Cepheid Inc，CA，USA)是本领域的重要进展，其在2个小时内产生结果，并且结合利福平抗性的检测[6]。在成年人中，测试的合并灵敏度是67-98％并且特异性是约98％[7]。但是，比如较高成本、要求稳定的电源、集中化的实验室装置、训练的实验室工作人员和耗材的短货架期的限制等[8]，阻碍了测试资源受限地区和通常高负担地区中的广泛使用。

因此，需要简单、精确和负担得起的TB测试，其可立即递送结果并且在资源受限的地区容易使用。

技术实现要素：

根据本发明的第一实施方式，提供了诊断结核的方法，该方法包括下述步骤：检测来自怀疑患有结核的受试者的未受刺激的血液样品的至少四种、至少五种或至少六种生物标志物，其中生物标志物选自c-反应蛋白(CRP)、前白蛋白、干扰素(IFN)-γ、补体因子H、载脂蛋白(APO)-A1、干扰素可诱导的蛋白质(IP)-10、补体C3、α-2-巨球蛋白、APO-CIII、APO-E、干扰素(IFN)-α2、肿瘤坏死因子(TNF)-α、表皮生长因子(EGF)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1β、可溶性CD40配体(sCD40L)、转化生长因子(TGF)-α、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素1受体拮抗物(IL-1ra)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、基质金属蛋白酶(MMP)-9、结合球蛋白、血清淀粉样蛋白A(SAA)、原降钙素(PCT)、铁蛋白、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)、纤维蛋白原和血清淀粉样蛋白A(SAA)。

优选地，生物标志物选自CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1、IP-10、SAA、铁蛋白、纤维蛋白原、TGF-α、TPA、VEGF、PCT和TNF-α。

至少两种、至少三种、至少四种或至少五种生物标志物可选自CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1和/或IP-10并且其他生物标志物可选自SAA、铁蛋白、纤维蛋白原、TGF-α、TPA、VEGF、PCT和/或TNF-α。

更优选地，生物标志物可选自由CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1和IP-10组成的组，。

甚至更优选地，该方法可包括检测样品的下述6种生物标志物：CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1和IP-10。

捕获试剂可用于结合每种生物标志物。捕获试剂可以是抗体、亲合体、锚蛋白重复蛋白、犰狳重复蛋白、核酸适配体、修饰的核酸适配体、肽、修饰的肽、碳水化合物配体、合成配体或合成聚合物。

一种或多种指示物可用于指示什么时候出现每种捕获试剂和生物标志物的结合。指示物可以是热量指示物、电化学指示物、发色指示物、光指示物、荧光指示物或放射性标记的指示物。

可检测样品中生物标志物的水平以便确定受试者是否患有TB。例如，对于下述生物标志物，与样品中生物标志物的水平相当的测量信号高于相同生物标志物的阈值水平可以是结核疾病的指示物：IFN-α2、CRP、IFN-γ、IL-1ra、IP-10、TGF-α、TNF-α、VEGF、补体因子H、补体C3、PCT、SAA、铁蛋白、纤维蛋白原、TPA或MMP-9。

另一方面，对于下述生物标志物，与样品中生物标志物的水平相当的测量信号低于相同生物标志物的阈值水平可以是结核疾病的指示物：APO-A1、APO-CIII、前白蛋白或MMP-2。

阈值生物标志物的水平可相当于未患有结核的受试者中相同生物标志物的水平。

血液样品可以是全血、血液血浆或血液血清，其来自已经离心的全血或来自允许凝结的血液。

结核可以是肺结核。

根据本发明的第二实施方式，提供了用于根据上述方法诊断结核的装置，该装置包括：

用于从受试者接收血液样品的工具；

用于结合至少四种上面列举的生物标志物的捕获试剂，前提是样品中存在生物标志物；和

指示捕获试剂什么时候结合生物标志物的至少一种指示物。

根据权利要求20至22中任一项所述的装置，其包括用于测量检测的生物标志物的水平的测量工具。

装置可以是手持现场装置，并且可进一步包括放大工具，其用于增加所述生物标志物的检测的灵敏度，比如上转发光技术。

装置可以是现场装置，比如手持装置，和更具体地是侧流装置。

根据本发明的第三实施方式，提供了用于根据上述方法诊断来自受试者的血液样品中的结核的试剂盒，该试剂盒包括：

从患者接收样品的工具；

至少一种用于结合至少四种上面列举的生物标志物的捕获试剂；和

指示捕获试剂什么时候结合生物标志物的至少一种指示物。

试剂盒可进一步包括如上述的装置。

附图说明

图1显示来自肺结核病例的和无TB疾病个体的血清样品中检测的宿主生物标志物的水平以及在初步研究中显示这些生物标志物在诊断TB疾病(无论是否HIV感染)的准确性的接受者操作特征(ROC)图。散射点图中的误差棒指示中值和四分间距。分析物的代表性图的ROC曲线下面积(AUC)≥0.70；

图2显示了初步研究中在前20个一般化辨别分析(GDA)预测性模型中的分析物的频率，其将研究参与者精确分类为TB疾病或无TB疾病(n＝148名研究参与者)。列表示每个分析物包括在前20个辨别模型中的次数。未根据HIV感染状态对研究参与者分层；

图3是接受者操作特征(ROC)曲线，其显示6-标志物生物特征在诊断活动性TB疾病的准确性，如在验证研究中获得(n＝703名研究参与者)；

图4显示了验证研究中前20个一般化辨别分析(GDA)预测性模型中分析物的频率，其将研究参与者精确分类为TB疾病或无TB疾病(n＝703名研究参与者)。列表示每个分析物包括在前20个辨别模型中的次数。未根据HIV感染状态或种族对研究参与者分层；和

图5显示了验证研究中分析物在多标志物预测性模型中用于将研究参与者分类为TB疾病或无TB疾病的重要性(n＝703名研究参与者)，如通过随机深林分析技术所揭示。列表示分析物在多标志物模型中的重要性。

发明详述

本文描述了用于诊断结核(TB)的方法和用于实施该方法的装置。该方法包括下述步骤：检测来自受试者的未受刺激的血液样品中至少四种生物标志物的组，该生物标志物选自补体C3、补体因子H、α-2-巨球蛋白、载脂蛋白(APO)-A1、载脂蛋白APO-CIII、载脂蛋白APO-E、前白蛋白干扰素(IFN)-γ、干扰素(IFN)-α2、干扰素可诱导的蛋白质(IP)-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α、表皮生长因子(EGF)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1β、可溶性CD40配体(sCD40L)、转化生长因子(TGF)-α、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素1受体拮抗物(IL-1ra)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、基质金属蛋白酶(MMP)-9、结合球蛋白、c-反应蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、原降钙素(PCT)、铁蛋白、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)、纤维蛋白原和血清淀粉样蛋白A(SAA)。该组可称为生物特征组。

组可包括来自上述列表的大于四种生物标志物，以便提供更综合的测试并且减少假阴性结果，比如包括五种、六种、七种或甚至更多种上面列举的生物标志物。

如本文所使用，术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(包括s)”、“包括(including)”、“包含(contains)”、“包含(containing)”和其任何变型旨在覆盖非排他性囊括并且不排除其他未具体提到的要素。

术语“标志物”和“生物标志物”替换使用，意思是靶分子，其指示或是个体中正常过程或异常过程的信号或个体中疾病或其他病况的信号。更具体而言，“标志物”或“生物标志物”是解剖学、生理学、生物化学或分子参数，其与存在无论正常的或异常的具体生理学状态或过程相关。生物标志物可包括小分子、肽、蛋白质和核酸。

生物标志物一般描述为与指示或是个体中正常过程或没有疾病或其他病况的生物标志物的表达水平或值相比，过表达、低表达或差异表达。因此，生物标志物的“过表达”、“低表达”或“差异表达”可也称为与“正常”或“对照”表达生物标志物的水平的差异。

在一种实施方式中，生物标志物可选自CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1、IP-10、SAA、铁蛋白、纤维蛋白原、TGF-α、TPA、VEGF、PCT和TNF-α。

在另一实施方式中，生物标志物组中的至少两种、至少三种、至少四种或至少五种生物标志物可选自CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1和/或IP-10的任何一种，并且组中的其他生物标志物可选自SAA、铁蛋白、纤维蛋白原、TGF-α、TPA、VEGF、PCT和/或TNF-α的任何一种。

在仍另一实施方式中，组中的生物标志物可选自CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1和/或IP-10的任何一种。

在仍进一步的实施方式中，生物标志物组包括下述六种生物标志物：CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1和IP-10。

在本发明的仍进一步的实施方式中，CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1和IP-10的组中的一种或多种生物标志物可用下述生物标志物的任何一种替换：SAA、铁蛋白、纤维蛋白原、TGF-α、TPA、VEGF、PCT和/或TNF-α。

捕获试剂用于特异性结合每种生物标志物，并且指示物将指示什么时候出现捕获试剂和每种生物标志物的结合。捕获试剂通常是抗体，但是其他可能的捕获试剂的例子包括亲合体、锚蛋白重复蛋白、犰狳重复蛋白、核酸适配体、修饰的核酸适配体、肽、修饰的肽、碳水化合物配体、合成配体和合成聚合物。指示物可以是热量指示物、电化学指示物、发色指示物、光指示物、荧光指示物或放射性标记的指示物。

可检测样品中生物标志物的水平以便确定受试者是否患有TB。可基于通常在没有活动性TB的患者或无TB的受试者中生物标志物的水平确定截取值或阀值，并且当检测受试者是否患有TB时，样品中检测的生物标志物的水平可与截取值水平比较。换句话说，方法将检测组中的生物标志物相对于无TB的受试者是否是低表达或过表达。一般而言，组中的所有生物标志物必须在样品中过表达或低表达(取决于在表2中的显示)，以便为方法提供阳性TB诊断。

血液样品可以是全血、血浆或血清，者取决于方法将如何实施。例如，在一种实施方式中，允许血液样品凝结并且接着分析血清，以检测生物标志物。在可选的实施方式中，不允许血液样品凝结(例如可将抗凝剂添加至样品)并且通过例如离心机将血液细胞和/或凝结因子从样品分离。接着，可分析血浆，以检测生物标志物。在另一实施方式中，全血样品，比如来自刺破手指的，可被直接分析。

TB通常是肺结核。

本发明的方法可使用检测和指示样品中存在生物标志物的诊断装置进行。装置具有用于从受试者接收样品的工具，比如样品放置在其上或其中的上样区或接收区。捕获试剂和指示物存在于装置中，并且一旦样品已经上样至或接受在装置中，样品与捕获试剂接触，如果存在生物标志物则与生物标志物结合。指示物将通知结合已经出现。装置通常是现场装置，比如侧流装置。正在开发手持装置，其能够基于侧流试验，使用上转发光技术进行TB诊断[31-34]。

在一种实施方式中，装置可以是浸渍棒，其可浸入血液样品或血液样品可放置在其上，与许多家用妊娠测试试剂盒类似。捕获试剂包括在浸渍棒上，并且当它们结合组中的生物标志物时，与对照信号一起产生信号。

也可提供试剂盒用于实施本发明，并且可包括下述的一个或多个：

用于从患者收集样品的工具(比如针)；

用于从受试者接收血液样品的托盘；

用于特异性结合生物标志物的捕获试剂；

用于指示捕获试剂什么时候已经结合生物标志物的指示物；

用于结合至少两种上述生物标志物的捕获试剂；

如上述的装置；和/或

用于实施上述诊断的方法的说明。

不像其他商业上用的方法，本发明的方法可区分活动性和潜伏的结核，这对于确定受试者的治疗是重要的。活动性结核是在具有活动性TB疾病的临床和放射学特征的受试者中这样的疾病状态：其中生物流体或组织对于结核分枝杆菌，涂片镜检或培养是阳性的，或其中可通过核酸扩增试验检测到结核分枝杆菌；通常存在原发性症状。潜伏的结核感染是潜在有活力的结核分枝杆菌出现在人组织中，但是个体是无症状的，并且没有活动性疾病的临床放射学特征。

下面将通过非限制性实施例更详细地描述本发明。

实施例

材料和方法

分两个阶段进行研究。在项目的初步/发现阶段，在南非开普敦和埃塞俄比亚的亚的斯亚贝巴的周边健康中心，招募了148名出现了需要调查TB疾病的症状的个体。这些个体招募为正在进行的EDCTP-资助的非洲欧洲结核联盟(AE-TBC)研究(www.ae-tbc.eu)的一部分，其目标是鉴定用于在六个非洲国家的七个不同地理位置诊断结核疾病的生物标志物。在项目的第二(验证)阶段，评估了来自五个位置的参与项目(南非的斯坦陵布什大学、冈比亚的MRC机构、乌干达的麦克雷雷大学、马拉维的卡隆加预防研究(KPS)和纳米比亚大学(UNAM))的718名研究参与者。

研究中包括的所有参与者以提示肺结核疾病的症状出现在各自的偏远健康护理地区。这些包括持续性咳嗽持续>2周以及下述的至少一种：发热、萎靡、最近体重减轻、盗汗、密切接触TB患者、咳血、胸痛或食欲下降。招募至研究的所有参与者18岁或更大并且同意签署用于参与研究，包括用于HIV检测的知情同意书。排除下述患者：如果他们还未居住在研究团体中大于3月、严重的贫血(HB<10g/l)、正在进行抗TB治疗、在之前的90天已经接受抗TB治疗或如果他们在过去60天施用了喹诺酮或氨基糖苷类抗生素。招募时，在收集血液和主要研究需要的其他样品之前，每个参与者完成病例报告表格。参与该项目的不同单位的健康研究伦理委员会批准了该研究。

样品收集和诊断测试

在参与研究的所有位点，使用协调的方案收集和处理样品。简言之，将血液样品收集至4ml普通BD管(BD Biosciences)并且在环境条件下运输至实验室。接着，以2500rpm使管离心10分钟，其后收获血清，等分试样并且冷冻(-80℃)直到使用。从所有参与者收集痰样品并且使用MGIT方法(BD Biosciences)培养。对所有阳性MGIT样品进行PCR实验，以确认结核分枝杆菌复合生物体的分离。分类为TB病例的所有个体具有阳性结核分枝杆菌复合物物种的痰培养物和/或与TB一致的其他临床特征，包括典型的胸腔X-射线。在“无TB”组中的个体具有阴性痰涂抹和培养物并且没有其他提示TB的信号，包括阴性胸腔X-射线。所有的非TB病例都不用各自国家的TB控制程序治疗TB。

Luminex多通道免疫试验

在研究的第一阶段中，评估来自所有研究参与者的血清样品中之前在刺激的上清液中测试的生物标志的水平，包括干扰素(IFN)-γ、IFN-α2、干扰素可诱导的蛋白质(IP)-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α、表皮生长因子(EGF)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1β、可溶性CD40配体(sCD40L)、转化生长因子(TGF)-α、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素1受体拮抗物(IL-1ra)、基质金属蛋白酶(MMP)-2，和MMP-9和新的宿主生物标志物，包括补体C3、补体因子H、α-2-巨球蛋白、载脂蛋白(APO)-A1、APO-CIII、APO-E和前白蛋白。在第二阶段中，评估在验证研究中包括的所有研究参与者的血清样品上的另外的生物标志物，即结合球蛋白、c-反应蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、原降钙素(PCT)、铁蛋白、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)、纤维蛋白原和血清淀粉样蛋白A(SAA)。这使用Milliplex试剂盒(Merck Millipore,St.Charles,Missouri，USA)或Bio Plex试剂盒(Bio Rad实验室，Hercules，CA，USA)在Bio-Plex^TM平台(Bio-Rad实验室，Hercules，CA，USA)上进行。用于MMP-2和MMP-9的样品在优化实验之后预先稀释1:100，用于铁蛋白、纤维蛋白原、SAA、PCT、TPA的样品稀释1:100并且用于CRP、A2M、结合球蛋白和SAP的样品稀释1:10000，如制造商推荐的(Bio Rad)。进行实验的实验室员工对于研究参与者的临床分组不知情。根据制造商的说明进行试验(Merck Millipore和Bio Rad)并且质量控制试剂的所有分析物的水平在制造商推荐的范围内。Bio-Plex Manager^TM软件6.1用于磁珠采集和分析。

统计分析

对于非参数数据分析，通过Mann-Whitney U检验，评估具有TB疾病和没有活动性TB的分析物水平之间的差异。通过接受者操作特征(ROC)曲线分析来研究个体生物标志物的诊断准确性。基于Youdens Index方法选择最佳截取值和相关的灵敏度和特异性。在初步研究中，通过留一交叉验证的进行最佳亚组一般化辨别分析(GDA)，或在验证研究中，通过训练和测试组方法评估分析物组合的预测性能力。在验证研究中，第二多标志物分析程序(随机深林)用于研究血清生物特征的准确性。如果p-值<0.05，则认为组之间的差异是显著的。使用GraphPad prism，版本5.00(GraphPad软件，San Diego，California，USA)和Statistica(Statsoft，Ohio，USA)分析数据。

结果

总共148名参与者包括在初步研究中。这些参与者中，72名(49％)是男性和76名(51％)是女性。所有初步研究参与者的平均年龄是34.7±12.3并且22名(15％)研究参与者是感染HIV的。使用制造商推荐的截取值(≥0.35IU/ml)，这些研究参与者的总共92名(63％)是Quantiferon阳性的。确认了51名(34.5％)研究参与者具有TB疾病，88名(59.5％)无TB，而9名(6.0％)具有不确定的诊断(使用目前的标准实验室和临床方法，可能无法分类为TB或无TB疾病)。具有不确定诊断的9名个体不再进一步分析。

验证研究包括总共718名研究参与者。来自15名个体的样品由于下述原因而不进行最终的分析：10名研究参与者怀孕或临床和研究团队之间具有不一致的数据，可能由于人实验室错误，和5名研究参与者是可疑的TB病例(使用目前可用的诊断工具，可能无法明确分类为TB或无TB)。703名合格研究参与者中，358名(51％)是男性并且173名(25％)是感染HIV的。所有研究参与者的平均年龄是36±11.8，374名(55％)是QFT阳性并且使用制造商的截取值(≥0.35IU/ml)，28名(4％)是QFT不确定的。

在研究的第一阶段单个生物标志物在诊断TB疾病中的表现(n＝148名研究参与者)

FN-α2、IFN-γ、IL-1ra、IP-10、TGF-α、TNF-α、VEGF、补体因子H、补体C3和MMP-9的中值水平显著高于TB病例，而APO-A1、APO-CIII、前白蛋白和MMP-2的水平在无TB疾病的个体中更高。这与研究参与者的HIV感染状态无关。最精确的单个分析物，如通过AUC>0.80确定的，包括IFN-γ、IL-1ra、IP-10、TNF-α、APO-A1和前白蛋白。在研究中评估的所有生物标志物的中值水平和诊断准确性的测量显示在表1中，而代表性ROC图显示在图1中。

在研究的验证阶段单个生物标志物在诊断TB疾病中的表现(n＝703名研究参与者)

IL-1ra、TGF-α、IP-10、TNF-α、IFN-α2、IFN-γ、VEGF、MMP-9、补体因子H、结合球蛋白、CRP、SAP、PCT、铁蛋白、TPA、纤维蛋白原和SAA的中值水平在TB病例中显著更高，而前白蛋白和两个载脂蛋白(APO-A1和APO-CIII)的水平在非TB病例中显著更高。MMP-2(p＝0.09)和A2M(p＝0.14)的浓度；在非TB病例中都高，差异不显著。(表2)。

表1:初步研究：来自具有肺结核或无TB疾病的个体的血清样品中检测的分析物的中值水平(n＝148)、四分间距(在括号中)，和TB疾病诊断的准确性。

CFH＝补体因子H，CC3＝补体C3，A2MG＝α2巨球蛋白；AUC＝ROC曲线下面积

感染HIV的个体和未感染的个体都包括在分析中。为EGF、IFN-α2、IFN-γ、IL-1ra、IP-10、MIP-1β、sCD40L、TGF-α、TNF-α和VEGF显示的值是以pg/ml计。所有其他分析物水平是以ng/ml计。

表2:验证研究：来自具有肺结核或无TB疾病的个体的血清样品中检测的分析物的中值水平(n＝703)、四分间距(在括号中)，和TB疾病诊断的准确性。

CFH＝补体因子H，A2M＝α2巨球蛋白；CRP＝C-反应蛋白；SAP＝血清淀粉样蛋白P；SAA＝血清淀粉样蛋白A；PCT＝原降钙素；TPA＝组织血纤维蛋白溶酶原激活剂；prealb＝前白蛋白，hapto＝结合球蛋白；Fibrin＝纤维蛋白原；AUC＝ROC曲线下面积。感染HIV的个体和未感染的个体都包括在分析中。为IFN-α2、IFN-γ、IL-1ra、IP-10、TGF-α、TNF-α、VEGF、铁蛋白、PCT和TPA显示的值是以pg/ml计。所有其他分析物水平是以ng/ml计。在一般化辨别分析之前，从训练数据产生AUC。

血清多标志物模型在TB疾病诊断中的用途

当为所有初步研究参与者(无论HIV感染状态)获得的数据拟合至一般化辨别分析模型时，当生物标志物以五种组合使用时，实现了TB疾病的最佳预测。包括IFN-γ、TNF-α、前白蛋白、补体C3和MMP-2的模型确定TB疾病，在训练样品组中灵敏度是86％(43/51)和特异性是90.9％(80/88)，并且在留一交叉验证之后，灵敏度是86％(43/51)和特异性是89.8％(79/88)。在辅助验证之后，对于TB病例，模型的预测准确性是84％(置信区间，74-86％)并且对于没有活动性TB疾病的个体，模型的预测准确性是93％(置信区间，89-95％)。最经常出现在前20个GDA模型中精确地将研究参与者分类为活动性TB疾病或没有活动性TB疾病的分析物包括前白蛋白、IFN-γ、补体C3和TNF-α(图2)。在项目的该阶段包括的148名个体是从南非和埃塞俄比亚的亚的斯亚贝巴招募的。

在验证阶段更大的研究中评估在该项目的初始阶段鉴定的最有希望的标志物和新的宿主标志物(n＝703)，其在5个非洲国家进行(南非、冈比亚、乌干达、马拉维和纳米比亚)。当对所有703名研究参与者获得的数据拟合至一般化辨别分析模型时，如在初步研究中进行的，当标志物以六种组合时，实现TB疾病的最佳预测。无论HIV感染状态或种族，用于TB疾病诊断的最精确的生物特征是CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1和IP-10的组合。该6-标志物生物特征的AUC(获得自训练数据集)是0.91。训练样品集中(n＝480)生物特征的灵敏度是86％，特异性是85％。测试数据集中(n＝207)生物特征的准确性是89％，置信区间：78至95％76％并且特异性是76％(置信区间：68-83％)，阳性预测值是61.1％和阴性预测性值是94.0％。该生物特征的ROC曲线显示在图3中，并且每种宿主标志物在前20个GD生物标志物组合中出现的次数显示在图4中。

当使用另一多标志物分析程序(随机深林)分析研究的验证阶段产生的数据时，获得生物特征的类似的准确性，从而指示生物特征的强健性。训练样品集中6-标志物生物特征的灵敏度是84％并且特异性是86％。在测试样品集中，灵敏度是89％并且特异性是73％。辨别模型中对于TB和无TB疾病，无论HIV感染状态或种族最重要的分析物，如随机深林分析技术所揭示的，与用一般化辨别分析获得的类似(图5)。

讨论

申请人已经显示可通过从疑似患有TB的个体简单收集血液，使血液凝结数分钟并且然后测量血清中宿主生物标志物的组合的水平来诊断TB疾病。该诊断方法的优势是容易获得研究需要的样品类型(血清，收集至干燥管，而不要求任何添加剂)，应用该测试适合所有患者类型，包括儿童，并且生物标志物可容易并入测流装置。因此，可容易进行测试，甚至在最偏远的地区。结果，使用多种分析策略，指示6标志物的组合能够诊断TB疾病，灵敏度高达89％(置信区间，78-95％)并且特异性是76％(置信区间，68-83％)。使用851个来自从非洲的6个不同位点招募的TB嫌疑病人的样品的这些研究的结果，其中个体具有与不同的传播结核分枝杆菌相关的不同遗传背景，指示基于这些生物标志物的诊断测试可能明显有助于TB疾病的诊断并且在进一步研究(如果需要的话)之前，可至少用作偏远地区的TB的筛选测试。

在该研究中，据申请人了解从未在血清样品中用于TB诊断目的研究的新生物标志物(补体C3、补体因子H、α-2-巨球蛋白、载脂蛋白-A1、载脂蛋白-CIII、载脂蛋白–E、前白蛋白、铁蛋白、纤维蛋白原、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂和原降钙素)显示为用于TB疾病的候选诊断生物标志物。这些研究在来自“TB嫌疑病人”的血清样品上进行并且不是通常倾向于过高评估诊断准确性的病例对照研究。尽管新的生物标志物单独显示在TB疾病诊断中的潜能，但是观察指示如果生物标志物结合其他确定的生物标志物，比如IFN-γ、IP-10、TNF-α、CRP、SAA等使用则实现最高的诊断准确性。

设想根据本发明的试验，采用血清中可直接测量的宿主标志物将比用结核分枝杆菌抗原刺激血液或血液细胞之后需要过夜培养的试验更快和更容易进行，并且将对患者造成更大的影响，因为明显缩短诊断需要的时间。

参考文献

1.World Health Organisation.Global Tuberculosis Report 2012.2012.Ref Type:Report

2.Murray CJ,DeJonghe E,Chum HJ,Nyangulu DS,Salomao A,Styblo K:Cost effectiveness of chemotherapy for pulmonary tuberculosis in three sub-Saharan African countries.Lancet 1991,338:1305-1308.

3.Apers L,Mutsvangwa J,Magwenzi J,Chigara N,Butterworth A,Mason P et al.:A comparison of direct microscopy,the concentration method and the Mycobacteria Growth Indicator Tube for the examination of sputum for acid-fast bacilli.Int J Tuberc Lung Dis 2003,7:376-381.

4.Chegou NN,Hoek KG,Kriel M,Warren RM,Victor TC,Walzl G:Tuberculosis assays:past,present and future.Expert Rev Anti Infect Ther 2011,9:457-469.

5.Hanna BA,Ebrahimzadeh A,Elliott LB,Morgan MA,Novak SM,Rusch-Gerdes S et al.:Multicenter evaluation of the BACTEC MGIT 960system for recovery of mycobacteria.J Clin Microbiol 1999,37:748-752.

6.Boehme CC,Nabeta P,Hillemann D,Nicol MP,Shenai S,Krapp F et al.:Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance.N Engl J Med 2010,363:1005-1015.

7.Steingart KR,Sohn H,Schiller I,Kloda LA,Boehme CC,Pai M et al.:Xpert(R)MTB/RIF assay for pulmonary tuberculosis and rifampicin resistance in adults.Cochrane Database Syst Rev 2013,1:CD009593.

8.Trebucq A,Enarson DA,Chiang CY,Van DA,Harries AD,Boillot F et al.:Xpert((R))MTB/RIF for national tuberculosis programmes in low-income countries:when,where and how？Int J Tuberc Lung Dis2011,15:1567-1572.

9.Marais BJ,Pai M:New approaches and emerging technologies in the diagnosis of childhood tuberculosis.Paediatr Respir Rev 2007,8:124-133.

10.Chegou NN,Walzl G,Bolliger CT,Diacon AH,van den Heuvel MM:Evaluation of adapted whole-blood interferon-gamma release assays for the diagnosis of pleural tuberculosis.Respiration 2008,76:131-138.

11.Munk ME,Arend SM,Brock I,Ottenhoff TH,Andersen P:Use of ESAT-6and CFP-10antigens for diagnosis of extrapulmonary tuberculosis.J Infect Dis 2001,183:175-176.

12.Hesseling AC,Mandalakas AM,Kirchner HL,Chegou NN,Marais BJ,Stanley K et al.:Highly discordant T cell responses in individuals with recent exposure to household tuberculosis.Thorax 2009,64:840-846.

13.Mandalakas AM,Hesseling AC,Chegou NN,Kirchner HL,Zhu X,Marais BJ et al.:High level of discordant IGRA results in HIV-infected adults and children.Int J Tuberc Lung Dis 2008,12:417-423.

14.Mandalakas AM,Detjen AK,Hesseling AC,Benedetti A,Menzies D:Interferon-gamma release assays and childhood tuberculosis:systematic review and meta-analysis.Int J Tuberc Lung Dis 2011,15:1018-1032.

15.World Health Organization and the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease.Guidance for national tuberculosis and HIV programmes on the management of tuberculosis in HIV-infected children:Recommendations for a public health approach.2010.Ref Type:Report

16.Chegou NN,Black GF,Loxton AG,Stanley K,Essone PN,Klein MR et al.:Potential of novel Mycobacterium tuberculosis infection phase-dependent antigens in the diagnosis of TB disease in a high burden setting.BMC Infect Dis 2012,12:10.

17.Goletti D,Carrara S,Mayanja-Kizza H,Baseke J,Mugerwa MA,Girardi E et al.:Response to M.tuberculosis selected RD1 peptides in Ugandan HIV-infected patients with smear positive pulmonary tuberculosis:a pilot study.BMC Infect Dis 2008,8:11.

18.Sartain MJ,Slayden RA,Singh KK,Laal S,Belisle JT:Disease state differentiation and identification of tuberculosis biomarkers via native antigen array profiling.Mol Cell Proteomics 2006,5:2102-2113.

19.Chegou NN,Black GF,Kidd M,van Helden PD,Walzl G:Host markers in Quantiferon supernatants differentiate active TB from latent TB infection:preliminary report.BMC Pulm Med 2009,9:21.

20.Chegou NN,Essone PN,Loxton AG,Stanley K,Black GF,van der Spuy GD et al.:Potential of host markers produced by infection phase-dependent antigen-stimulated cells for the diagnosis of tuberculosis in a highly endemic area.PLoS ONE 2012,7:e38501.

21.Chegou NN,Detjen AK,Thiart L,Walters E,Mandalakas AM,Hesseling AC et al.:Utility of host markers detected in quantiferon supernatants for the diagnosis of tuberculosis in children in a high-burden setting.PLoS ONE 2013,8:e64226.

22.Frahm M,Goswami ND,Owzar K,Hecker E,Mosher A,Cadogan E et al.:Discriminating between latent and active tuberculosis with multiple biomarker responses.Tuberculosis(Edinb)2011,91:250-256.

23.Kellar KL,Gehrke J,Weis SE,Mahmutovic-Mayhew A,Davila B,Zajdowicz MJ et al.:Multiple cytokines are released when blood from patients with tuberculosis is stimulated with Mycobacterium tuberculosis antigens.PLoS ONE 2011,6:e26545.

24.Novel N.Chegou,Jan Heyckendorf,Gerhard Walzl,Christoph Lange,Morten Ruhwald.Beyond the Interferon-gamma horizon:Biomarkers for immunodiagnosis of infection with M.tuberculosis.Eur Respir J.2013.Ref Type:In Press

25.Biselli R,Mariotti S,Sargentini V,Sauzullo I,Lastilla M,Mengoni F et al.:Detection of interleukin-2 in addition to interferon-gamma discriminates active tuberculosis patients,latently infected individuals,and controls.Clin Microbiol Infect 2010,16:1282-1284.

26.Millington KA,Innes JA,Hackforth S,Hinks TS,Deeks JJ,Dosanjh DP et al.:Dynamic relationship between IFN-gamma and IL-2 profile of Mycobacterium tuberculosis-specific T cells and antigen load.J Immunol 2007,178:5217-5226.

27.Sargentini V,Mariotti S,Carrara S,Gagliardi MC,Teloni R,Goletti D et al.:Cytometric detection of antigen-specific IFN-gamma/IL-2 secreting cells in the diagnosis of tuberculosis.BMC Infect Dis2009,9:99.

28.Sester U,Fousse M,Dirks J,Mack U,Prasse A,Singh M et al.:Whole-blood flow-cytometric analysis of antigen-specific CD4 T-cell cytokine profiles distinguishes active tuberculosis from non-active states.PLoS ONE 2011,6:e17813.

29.Khutso G.Phalane,Magdalena Kriel,Andre G.Loxton,Angela Menezes,Kim Stanley,Gian D.van der Spuy et al..Differential Expression of Host Biomarkers in Saliva and Serum Samples from Individuals with Suspected Pulmonary Tuberculosis.Mediators of Inflammation 2013,Article ID 981984.2013.Ref Type:Journal(Full)

30.Leyten EM,Lin MY,Franken KL,Friggen AH,Prins C,van Meijgaarden KE et al.:Human T-cell responses to 25 novel antigens encoded by genes of the dormancy regulon of Mycobacterium tuberculosis.Microbes Infect 2006,8:2052-2060.

31.Corstjens PL,Chen Z,Zuiderwijk M,Bau HH,Abrams WR,Malamud D et al.:Rapid assay format for multiplex detection of humoral immune responses to infectious disease pathogens(HIV,HCV,and TB).Ann N Y Acad Sci 2007,1098:437-445.

32.Corstjens PL,Zuiderwijk M,Tanke HJ,van der Ploeg-van Schip JJ,Ottenhoff TH,Geluk A:A user-friendly,highly sensitive assay to detect the IFN-gamma secretion by T cells.Clin Biochem2008,41:440-444.

33.Corstjens PL,van LL,Zuiderwijk M,Kornelis D,Tanke HJ,Deelder AM et al.:Up-converting phosphor technology-based lateral flow assay for detection of Schistosoma circulating anodic antigen in serum.J Clin Microbiol 2008,46:171-176.

34.Corstjens PL,de Dood CJ,van der Ploeg-van Schip JJ,Wiesmeijer KC,Riuttamaki T,van Meijgaarden KE et al.:Lateral flow assay for simultaneous detection of cellular-and humoral immune responses.Clin Biochem 2011,44:1241-1246.