外周血及其单核细胞中的甲硫氨酸氨肽酶过表达作为结肠直肠癌筛查、诊断和预后的标记物的制作方法

本申请要求于2009年4月29日申请的申请号为61/173,842的名称为“在外周血和外周血单核细胞中的甲硫氨酸氨肽酶过表达作为用于结肠直肠癌筛查、诊断和预后的标记物”的美国临时专利申请的优先权，其内容通过引用并入本文。

背景技术：

结肠直肠癌(CRC)在加拿大[1]是癌症死亡的第三大原因，CRC从前恶性腺瘤性息肉缓慢发展而得到。由于癌症发展缓慢，存在一个相当大的窗口期，在此窗口期期间，该癌症或其前期病变(腺瘤性息肉)都可以被检测到。这就允许在前恶性和早期恶性阶段进行治疗。超过90％的被诊断为局限性结肠直肠癌的患者存活超过五年。然而，CRC病例中的大多数在确诊时已是晚期[2,3]。虽然CRC是第三最致命的癌症，但是，如果如果在早期就治疗则会有90％的生存几率。尽管如此，每年全球超过60万人死于CRC[4]。这些数据表明存在一种对用于早期检测CRC的可靠的筛查方法的紧急的未满足的需求，该方法作为基于群体的CRC筛查方法可以很容易地被实现。

有效的筛查策略

筛查即个体的识别，在形成实际症状之前识别出谁存在发展为CRC的风险，最常见的CRC筛查试验包括大便潜血试验(FOBT)，粪便免疫试验(FIT)，乙状结肠镜检查和结肠镜检查[5-7]。由于低灵敏度或测试的侵入性，用于筛查的这些测试的依从率是有限的[8,9]。例如，虽然FOBT是成本有效和相对安全的，但是，假阳性率高，这是因为如药物和饮食等因素可能影响结果。为了FOBT筛查，患者必须在家收集粪便样品并将其送至实验室用于分析。低依从率的原因是粪便样品收集的不愉快的感觉。例如，在加拿大马尼托巴省进行的第一轮CRC筛查期间，50-75岁之间的目标人群的服从率仅为15％，而在加拿大的安大略省，服从率为为29.3％，然而，45.6％的目标人群仍然逾期筛查[10]。乙状结肠镜检查和结肠镜检查既昂贵又具有侵入性，并且结果和过程的风险取决于主治内窥镜医师的专业知识[11]。

广泛可用的生物标记癌胚抗原(CEA)具有有限的灵敏度和特异性[12,13]。在基于群体的筛查过程中，血液检查可能比大便或内窥镜检查更容易被接受。成本效益好的血液检测可鉴定CRC高风险的患者，并且提高患者对更强烈的和侵入性的诊断过程的依从性。

蛋白酶解和甲硫氨酸氨肽酶(MetAP)

蛋白酶解是一种重要的蛋白质修饰，对于细胞的正常功能是必需的，并且蛋白酶解的改变已涉及各种癌症。新生多肽的最常见的处理事件是发生在几乎每一种蛋白质上的氨基末端修饰。氨肽酶属于金属蛋白酶家族并且它们的功能是从肽或蛋白质的未封闭的N末端去除氨基酸。

蛋白质合成由起始密码子启动，其在真核生物中是甲硫氨酸，而在原核生物中为甲酰甲硫氨酸。甲硫氨酸氨肽酶(MetAP)催化甲硫氨酸从新合成的蛋白质的N末端去除[7]。甲硫氨酸的去除对进一步N-末端修饰是必不可少的，所述进一步N-末端修饰例如为乙酰化和豆蔻酰化[14,15]。在人类中，MetAP以两种亚型存在：分别由MetAPI和MetAP2基因所编码的MetAPI和MetAP2。在底物特异性和表达控制中，这两种亚型在结构上彼此不同，因此，它们在功能上不是冗余的。MetAPI构成性地被表达，而MetAP2与细胞增殖相关。MetAPI在细胞分裂方面具有潜在作用，如MetAPI的抑制作用导致海拉细胞以及HT-1080细胞系凋亡的诱导。MetAPI的新亚型，即MetAPI D已被确定。MetAPI D已被证明在CRC患者中过表达，并且其抑制作用导致细胞生长减少[16,17]。MetAP2除了具有氨肽酶催化活性之外，还具有正如Gupta等人之前所证明的额外功能[18]。具体地，它通过保护真核起始因子2的α-亚基(elF2)免于磷酸化来调节翻译[19]。elF2a的磷酸化导致减少的翻译起始。MetAP2表达与细胞生长相关，并且非分裂细胞未显示此蛋白质的免疫检测水平。MetAP2已显示参与不同类型肿瘤的生长[20]。MetAP2切割新生c-Src的甲硫氨酸，从而暴露其N-末端甘氨酸残基用于豆蔻酰化。

MetAP2已经被证明在血管生成方面发挥关键作用。血管生成是特别重要的，由于其对实体瘤和癌症的发展是必要的。多个实验室已经证明了，MetAP的抑制作用导致了肿瘤生长的消退和血管生成[21,22]，MetAP2已经被鉴定为血管生成抑制剂的分子靶标，如烟曲霉素和卵假散囊菌素，其可结合至MetAP2并抑制其氨肽酶活性[21,23]。MetAP2被认为在癌症中具有作用(Wang等人，2008年)。以前的报告显示了，MetAP2在结肠癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌和肝癌中的过表达[24,25]。如由Tucker等人所报道的，MetAP2在癌症中的作用方面，存在一些可用的信息，Tucker等人提出了：MetAP2异位表达引起细胞转化并促进细胞增殖，由于MetAP2抑制剂可减少细胞转化[26]。然而，MetAP2在荷瘤宿主的免疫反应细胞中的表达还不清楚。最近，我们已经确定NMT2亚型在CRC患者的PBMC中过表达。由于MetAP2是豆蔻酰化的上游事件，因此，我们的兴趣是研究CRC患者血液中的MetAP2的状态。没有关于MetAP2介入CRC患者的外周血、PB C和T细胞的报道。在此，这是MetAP2存在于外周血、PBMC和T细胞中的首次报道。这项研究表明，与健康对照组相比，MetAP2在CRC患者的外周血和PBMC中过表达了。

MetAP2和CRC

以前的研究使用IHC技术调查了MetAP2在源自CRC患者的肿瘤中的表达。MetAP2也已被报道显示出在息肉里的中度染色。据认为这种染色揭示了作为分子事件的一部分的MetAP2是上调的，所述分子事件发生在结肠组织的恶性形成期间[15]。Tucker等人也使用IHC技术研究了MetAP2在CRC样品的恶性腺瘤中的表达[26]。这些样品显示了MetAP2中至强的染色性。Kanno等人发表的研究报道了MetAP2在生发中心B细胞中更高的表达以及它们的肿瘤配对物[27]。所述生发中心是B淋巴细胞增殖和通过抗原刺激经历终末分化的位点。

技术实现要素：

根据本发明的第一方面，提供了一种筛查结肠直肠癌(CRC)的方法，包括：

检测甲硫氨酸氨肽酶2(MetAP2)在非肿瘤样品中的水平，所述非肿瘤样品来自存在发展为CRC风险的个体；并且

确定MetAP2水平是否高于阈值，

其中，高于阈值的MetAP2水平指示该个体被进一步用于CRC检查。

高于阈值的MetAP2水平可能表明该个体患有CRC。

所述非肿瘤样品可为外周血或中性粒细胞或外周血单核细胞(PBMC)或淋巴细胞。

所述阈值可对应于一个健康个体的MetAP2水平。

附图说明

图1：8名癌症受试者和7名对照受试者的染色MetAP2的平均IHC分数。CRC样品的平均IHC分数为205±57.56，而对照样品的平均IHC分数为8.57±3.78。图表上的条呈现数据的标准偏差。

图2：对于ID0023的CRC患者的外周血的免疫组织化学分析。用抗MetAP2抗体孵育PB细胞(棕色阳性染色)。黑色箭头指向阳性染色的淋巴细胞，灰色箭头指向阳性染色的中性粒细胞。(20×)

图3：对于ID0023的CRC患者的外周血的免疫组织化学分析。用抗MetAP2抗体孵育PB细胞。黑色箭头指向阳性染色的淋巴细胞，灰色箭头指向阳性染色的中性粒细胞。(40×)

图4：对于ID0006的对照组健康受试者的外周血的免疫组织化学分析。用抗MetAP2抗体孵育PB细胞。黑色箭头指向阴性染色的淋巴细胞。(40×)

图5：对于ID0006的对照组患者的外周血的免疫组织化学分析。用抗MetAP2抗体孵育PB细胞。这是如图4所示的ID0006的对照组受试者的不同视野。灰色箭头指向弱阳性染色的中性粒细胞。(40×)

图6：在CRC患者和健康受试者中的甲硫氨酸氨肽酶2(MetAP2)基因的表达谱。通过使用来自BioRad的已验证的PCR引物而进行定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)，MetAP2基因在外周血单核细胞中的表达在CRC患者(A17和A19)和健康受试者(C27和C4)中被测定。这些引物是MetAP2特异性的。MetAP2基因在CRC患者中的表达约为健康受试者的两倍。

具体实施方式

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有相同的含义，如本发明所属于的本领域普通技术人员通常理解的那样。虽然，与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料都可用于本发明的实施或测试中，优选的方法和材料现在被进行详细描述。下文所提到的所有公开文本均通过引用而被并入本文。

我们之前的研究表明，NMT被过表达并且在CRC患者的外周血单核细胞(PBMC)中是活跃过度的。NMT以NMT1和NMT2存在。最近，我们已经证明了，与健康对照受试者相比，其实是NMT2亚型在CRC患者的PBMC中过表达。我们的兴趣是发现，此改变的NMT2在CRC患者的PBMC中的过表达是否也与MetAP2表达的改变相关，由于它是NMT2的上游目标。我们的目标是研究MetAP2在CRC患者的外周血和PBMC中的表达，并研究其是否能用作CRC筛查、诊断或预后的标记物。

为了研究MetAP2在CRC患者的PBMC中的表达水平，一种已验证的单克隆抗-MetAP2抗体(可购买自美国的圣克鲁斯生物技术有限公司)被用于确定MetAP2表达谱。免疫组织化学(IHC)技术被用于确定MetAP2在CRC患者的外周血涂片中的表达。IHC分析不仅提供了MetAP2表达方面的信息，而且实现了MetAP2在该血涂片里的各种细胞中的定位。IHC分数或者H分数被给予MetAP2在来自CRC患者的外周血涂片中的表达水平，并且与来自健康的对照受试者的血涂片相比较。IHC分数通过强度(以0-3等级划分)与阳性细胞百分比(0-100％)相乘而被计算出来，所以得出最小的IHC＝0而最大的IHC＝300。我们的研究揭示了MetAP2在非肿瘤组织中与健康受试者相比的过表达，所述非肿瘤组织例如为CRC患者的外周血，PBMC，中性粒细胞和淋巴细胞。

因此，其能够用作CRC的筛查、诊断或预后的生物标记物，正如本文所讨论的那样。

使用IHC技术以评估MetAP2在CRC肿瘤组织中的表达已被早期的研究所实施。MetAP2显示了在来自CRC患者的息肉里的中度染色，表明了以下事实：作为分子事件的一部分的MetAP2是上调的，所述分子事件发生在结肠组织的恶性形成期间[15]。Tucker等人[26]也使用IHC技术以确定MetAP2在结肠直肠肿瘤样品的恶性腺瘤中的表达，并且他们的研究显示了MetAP2中至强的染色。

本研究是显示了MetAP2在CRC患者的外周血，中性粒细胞，PBMC和淋巴细胞中的过表达的第一次调查研究。

我们还调查了外周血细胞内细胞的类型，其显示出强度染色的模式。我们研究的结果表明，MetAP2在来自CRC患者的外周血的淋巴细胞和中性粒细胞中显示出阳性的染色。在我们的研究中，如本文所述，我们通过提供IHC分数量化了MetAP2的表达，

如本领域技术人员会理解的，MetAP2在CRC患者的外周血和PBMC中的过表达是令人惊讶的。MetAP2在如外周血等非肿瘤组织或如PBMC、中性粒细胞和淋巴细胞等免疫反应细胞中的过表达建立了其在CRC发病和发展方面的潜在作用。尽管不希望受到特定理论或假设的约束，值得注意的是，鉴于以下事实：PBMC通常由70％T细胞组成，有可能的是，MetAP2在CRC患者的PBMC中高比例的过表达意味着在大量的潜在不同抗原特异性的T细胞中而非只特异于CRC的T细胞中的这种酶的过表达。MetAP2在CRC驱动的克隆扩增的CRC特异性T细胞中专有地过表达，可能不是最受欢迎的情况，虽然这种可能性目前不能排除。

根据本发明的一个方面，提供了一种筛查结肠直肠癌(CRC)的方法，包括：

检测甲硫氨酸氨肽酶2(MetAP2)在非肿瘤样品中的水平，所述非肿瘤样品来自存在发展为CRC风险的个体或者有患CRC风险的个体；并且

确定MetAP2水平是否高于阈值，

其中，高于阈值的MetAP2水平指示该个体被用于CRC检查，

例如，可以进一步对该个体进行CRC筛查，或者可实施额外的测试以确认该个体患有CRC。

根据本发明的另一方面，提供了一种筛查结肠直肠癌(CRC)的方法，包括：

检测甲硫氨酸氨肽酶2(MetAP2)在非肿瘤样品中的水平，所述非肿瘤样品来自存在发展为CRC风险的个体或者有患CRC风险的个体；并且

确定MetAP2水平是否高于阈值，

其中，高于阈值的MetAP2水平指示该个体患有CRC。

在一些实施例中，非肿瘤样品为外周血、中性粒细胞、外周血单核细胞(PBC)和/或淋巴细胞。

在一些实施例中，所述阈值对应于一个健康个体的MetAP2水平。如本领域技术人员会理解的，此对照水平不需要每次都确定或重复。

具有发展为结肠直肠癌风险的个体可以是年龄超过50岁的任何个体和/或可以是具有结肠直肠癌家族史的个体或者被认为具有较高可能性发展为此疾病的个体。

如本领域技术人员会理解的，此方法可被用于筛查具有高于阈值水平的MetAP2水平的个体和结果为其应该用其他严格的方法进行结肠直肠癌检查的个体。然而，所述方法也可被用于根据其外周血样品或外周血单核细胞中的MetAP2水平诊断或识别具有结肠直肠癌的个体。

类似地，所述方法可被用于结肠直肠癌的预后，以特别高的MetAP2水平，可以指示特别侵袭性的癌症阶段。

如本领域技术人员会理解的，用于结肠直肠癌的筛查外周血样品的能力表示出相对于现有技术的显著改善，其正如本文所述，现有技术往往遭受低的依从率。具体地，筛查外周血样品的能力意味着可在为高血脂、糖尿病以及其它疾病所进行的日常或年度血液检测过程中筛查个体的结肠直肠癌。

用于筛查个体患有CRC或有发展为CRC风险的血液中生物标记物的识别是有吸引力的，由于其不但会提升依从率，而且会降低诊断后生活似是而非的恶化。如上所述，MetAP2已被研究并已在实体瘤组织中得到了识别；然而，之前并没有MetAP2在人血液中存在方面的报道。对MetAP2在造血中的重要作用的报道已在斑马鱼模型中得到证实[28]；然而，之前并没有研究报道过人血细胞或任何血细胞前体或者它们的血系中的MetAP。本文是证明MetAP2存在于人外周血，PBMC，嗜中性粒细胞和淋巴细胞(特别是T淋巴细胞)中的首次报道。

MetAP2也被证明是造血干细胞启动和增殖所必需的[28]。作者证明了，通过使用烟曲霉素治疗和吗啉代基因敲除，MetAP2活性能够显著减少斑马鱼发育中确定的造血和扰动的血管生成。研究还发现这些处理方法减少了造血干内的MetAP2水平和在富集的CD34+细胞中的祖细胞(HSPC)活性，这表明MetAP2在造血方面的重要作用。从这些观察结果，可以得出以下结论：MetAP2可在维持HSPC活性中发挥细胞自主作用。MetAP2在血细胞中的过表达可表明造血细胞中的MetAP2活性/表达在CRC中被改变并且在外周血和/或PBMC中是反映的。然而，HSPC中在MetAP2活性/表达方面改变的可能性是CRC的发展和/或进展不能排除的原因。

以前的研究调查了人结肠癌细胞系中的NMT和MetAP2之间的关系。Colo320、Colo201和Colo205中高水平的NMT和MetAP2由Selvakumar等人所观察到[24]。酶的表达和活性随细胞密度而变化(培养皿中细胞的汇合或细胞数)。对于NMT和MetAP，更高的酶活性和表达在低细胞密度(10％)下被观察到，而Src表达水平在低密度细胞中大大降低。该结果被解释为一种指示，作为分子事件的早期阶段的一部分的NMT和MetAP上调，所述分子事件发生在癌蛋白的过度产生期间。

并没有MetAP2在血液中表达方面的报道。我们的研究显示，MetAP2血液中的表达可作为一种新的潜在分子标记物，用于以验血的形式筛查CRC。用于CRC检测的验血还可相较于现有的非特异性测试提升依从率。

来自8个癌症患者和7个健康个体的外周血样品的PBMC对MetAP2染色。结果分别列于表1和表2中。如淋巴细胞和单核细胞等PBMC里的不同类型的细胞没有差别评分，这些分数仅代表所有PBMC以及中性粒细胞的平均值。

对来自CRC患者与对照患者的样品的血液实施IHC分数的独立样本t检验。对于CRC患者(平均值＝205，标准偏差＝57.56983)和健康对照(平均值＝8.57，标准偏差＝3.78)的IHC分数的显著差异，t＝6.27×10^-7，p＜0.001被观察到。来自CRC患者的血液样品中的MetAP2的IHC分数表明相对于健康对照24倍之高的表达。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实施例进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

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