本发明属于生物医学技术领域，涉及一种病原菌样本分析前预处理液及预处理方法。
背景技术：
人类健康和医学的发展史是一部与各种感染性疾病斗争的历史。目前感染性疾病(含传染病)占人类全部死因25％以上。细菌感染所致的感染性疾病占首位。2014年世界卫生组织发布全球死因数据表明，在列为全球十大死因疾病中，下呼吸道感染、HIV/AIDS、腹泻病以及结核病分列其中第4、6、7和10位，其中下呼吸道感染、腹泻病和结核病大多属于细菌性感染。病原菌的检查则是临床确诊感染性疾病的主要手段。目前对于病原菌的检测方法主要有4类：一是分离培养法，其是证实感染的“金标准”，但由于有的病原菌如肺炎支原体等，其生长周期极为缓慢，培养周期长，培养条件苛刻，甚至有时由于患者用药导致病原菌活力较差而导致培养失败出现假阴性结果等原因导致该法在临床上的应用受到了较大的限制。二是血清学方法，即采用酶联免疫法、胶体金免疫法、微量免疫荧光法和间接血凝试验等，检测被检者血清中病原菌相关抗体的水平，可间接提示病原菌感染的存在。然而，血清学试验只能提供一种回顾性的诊断，而且有时需要双份血清。另外，抗体出现的时机不易掌握，儿童、青少年与成人之间又存在特异性抗体的差异，故现有血清学方法的检测质量也受到一定限制。三是利用分子生物学技术检测病原菌DNA的存在，其中最常用的是聚合酶链式反应(PCR)，该方法快速、灵敏、特异，是目前研究病原菌感染的重要手段，但由于PCR对实验设备以及操作要求较高，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。四是直接检测病原体相关特异性抗原，以直接证实病原体的感染。该法属于直接法，其结果可信度高。目前，已公开报道的检测病原体抗原的方法主要为基于抗体-抗原反应的双抗夹心ELISA法，间接免疫荧光法，胶体金免疫层析法等。在这些方法中，以胶体金免疫层析法最为突出。免疫胶体金层析是近年来继放射免疫分析和酶联免疫分析之后发展起来的一种微量检测技术，该法利用两种抗病原菌表面特异性抗原的抗体，分别做为标记抗体及捕获抗体，利用双抗夹心的原理，结合层析技术，可对病原菌进行快速检测(5-10分钟内)。该法的难点在于制备出能捕获菌体表面抗原的特异性抗体。事实是，有时能成功找到菌体表面抗原(通常为蛋白质)的胞外结构域，但是由于菌体表面结构的复杂性，如空间位阻等原因，以其制备的抗体并不能高效的结合该抗原，从而降低了该法的检测灵敏度。因此能用此法检测的病原菌种类较少，大大限制了该法的应用。
技术实现要素：
针对背景技术中存在的这些技术问题，本发明的目的在于提供一种对病原菌样本进行分析前预处理液以及预处理方法，以提高基于“抗原-抗体”捕获反应来直接检测病原体方法(如胶体金、ELISA等)的灵敏度。本发明的技术方案是：一种病原菌样本分析前预处理液，其特征在于：所述病原菌样本分析前预处理液包括三羟甲基氨基甲烷、钙盐、磷脂酶、溶菌酶以及双蒸水；所述病原菌样本分析前预处理液以100毫升计算，所述三羟甲基氨基甲烷的含量是0.0121-0.121克；所述钙盐以钙元素计的含量是0.05-0.5克；所述磷脂酶的含量是0.003-0.03克；所述溶菌酶的含量是0.025-0.1克；所述病原菌样本分析前预处理液的pH为7.0-8.5。作为优选，本发明所采用的钙盐是可溶性钙盐。作为优选，本发明所采用的钙盐是氯化钙、硫酸钙或硝酸钙。作为优选，本发明所采用的磷脂酶是磷脂酶A1或磷脂酶A2。一种基于如上所述的病原菌样本分析前预处理液的制备方法，其特征在于：所述病原菌样本分析前预处理液以100毫升计算，其制备方法包括以下步骤：1)称取三羟甲基氨基甲烷、钙盐、磷脂酶以及溶菌酶；2)将步骤1)称取得到的原料一起溶于90ml双蒸水中；3)以盐酸调pH至7.0-8.5后再以双蒸水定容至100ml。基于如上所述的病原菌样本分析前预处理液对病原菌样本分析前进行预处理的方法，其特征在于：所述预处理方法包括以下步骤：1)采集预处理样本；2)将预处理样本与前述的预处理液进行等体积混合；3)将步骤2)得到的混合液置于50℃中反应20min，完成预处理。本发明的有益效果为：本发明的原理是利用含溶菌酶及磷脂酶的预处理液对病原菌样本进行酶促溶菌预处理，充分暴露病原菌表面抗原，消除抗体结合的空间位阻，提高抗体识别并结合抗原的效率，从而大大提高基于“抗原-抗体”反应来检测病原体的方法的灵敏度。将有利于提高基于抗原-抗体反应的快速检测试剂盒(如胶体金免疫层析试剂盒)的检测灵敏度，从而实现对人类病原菌的快速检测；应用范围广，其对革兰氏阳性及阴性菌的处理均有效；临床样本经本方法处理后，检测灵敏度大大提高，从而在提高病原菌的检出率的同时降低了临床取样的质量要求；预处理液中的溶菌酶、磷脂酶能杀灭病原菌，有利于保护工作环境及检测人员健康。具体实施方式以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。本发明使用或采用的各种材料的来源1.三羟甲基氨基甲烷、氯化钙、硝酸钙、硫酸钙、盐酸均购自国药集团化学试剂有限公司；2.磷脂酶A1购自Novozymes，产品名称为LecitaseUltraA1，比活力为10000U/ml；3.磷脂酶A2购自sigmaaldrich，产品编号为P6534，活性大于600units/mg蛋白；4.溶菌酶购自sigmaaldrich；产品编号为62970，活性为～100000U/mg；5.人流感嗜血杆菌菌株：购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号为ATCC53781。6.人肺炎链球菌亚型菌株Sp23F：购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号为ATCC700669。7.人肺炎支原体：购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号为ATCC15531。一种病原菌样本分析前预处理液，该病原菌样本分析前预处理液包括三羟甲基氨基甲烷、钙盐、磷脂酶、溶菌酶以及双蒸水；病原菌样本分析前预处理液以100毫升计算，三羟甲基氨基甲烷的含量是0.0121-0.121克；钙盐以钙元素计的含量是0.05-0.5克；磷脂酶的含量是0.003-0.03克；溶菌酶的含量是0.025-0.1克；病原菌样本分析前预处理液的pH为7.0-8.5。其中，钙盐是可溶性钙盐，例如氯化钙、硫酸钙或硝酸钙；磷脂酶是磷脂酶A1或磷脂酶A2。一种基于如上所述的病原菌样本分析前预处理液的制备方法，病原菌样本分析前预处理液以100毫升计算，其制备方法包括以下步骤：1)称量三羟甲基氨基甲烷、钙盐、磷脂酶以及溶菌酶；2)将步骤1)称取得到的试剂溶于90ml双蒸水中；3)以盐酸调pH至7.0-8.5后再以双蒸水定容至100ml。基于如上记载的病原菌样本分析前预处理液对病原菌样本分析前进行预处理的方法，该预处理方法包括以下步骤：1)采集预处理样本；预处理样本例如可以是拭子，痰液等含有病原菌样本；2)将预处理样本与预处理液进行等体积混合；3)将步骤2)得到的混合液置于50℃中反应20min，完成预处理。实施例1本发明所述预处理液的配制方法为：称取三羟甲基氨基甲烷0.0121克、钙元素含量为0.05克的氯化钙、磷脂酶A10.003克、溶菌酶0.025克，溶解于90ml双蒸水中，并以盐酸调pH为7.0后再以双蒸水定容为100ml，最终pH仍为7.0。实施例2本发明所述预处理液的配制方法为：称取三羟甲基氨基甲烷0.121克、钙元素含量为中0.25克的硝酸钙、磷脂酶A20.03克、溶菌酶0.1克，溶解于90ml双蒸水中，并以盐酸调pH为7.5后再以双蒸水定容为100ml，最终pH为7.4。实施例3本发明所述预处理液的配制方法为：称取三羟甲基氨基甲烷0.070克、钙元素含量为0.45克的硫酸钙、磷脂酶A20.015克、溶菌酶0.070克，溶解于90ml双蒸水中，并以盐酸调pH为8.5后再以双蒸水定容为100ml，最终pH为8.4。实施例4以申请号为201410406527.4发明名称为“人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用”的说明书中第【0117】段至【0158】段所公开的内容制备人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡。取培养的人流感嗜血杆菌(革兰氏阴性菌)，将其用生理盐水稀释为0.5×104CFU/ml、1×104CFU/ml、2×104CFU/ml、4×104CFU/ml、6×104CFU/ml、8×104CFU/ml等不同的浓度。于各个稀释度样本中分别取出0.25ml的菌液与等量的由实施例1所制备的预处理液混合，于50℃反应20min后将反应液滴于检测卡的样品垫上按申请号为201410406527.4的说明书中第【0159】段至【0161】段所公开的方法进行检测；同时于各个稀释度样本中取出0.25ml菌液与等体积的生理盐水混合作为对照试验，同时于50℃反应20min，后进行检测。结果发现，经预处理液预处理后，该检测卡对于人流感嗜血杆菌的检测下限为2×104CFU/ml，而对于只经生理盐水处理的对照样品，其检测下限则为4×104CFU/ml，由此可见，配合使用实施例1所述的预处理液可使该免疫层析检测卡的灵敏度提高1倍左右。实施例5以申请号为201410405212.8发明名称为“人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用”的说明书中第【0128】段至【0170】段所公开的内容制备人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡。取培养的人肺炎链球菌(革兰氏阳性菌)，将其用生理盐水稀释为0.5×104CFU/ml、1×104CFU/ml、2×104CFU/ml、4×104CFU/ml、6×104CFU/ml、8×104CFU/ml等不同的浓度。于各个稀释度样本中分别取出0.25ml的菌液与等量的由实施例2所制备的预处理液混合，于50℃反应20min后将反应液滴于检测卡的样品垫上按申请号为201410405212.8的说明书中第【0171】段至【0173】段所公开的方法进行检测；同时于各个稀释度样本中取出0.25ml菌液与等体积的生理盐水混合作为对照试验，同时于50℃反应20min，后进行检测。结果发现，经预处理液预处理后，该检测卡对于人肺炎链球菌的检测下限为2×104CFU/ml，而对于只经生理盐水处理的对照样品，其检测下限则为6×104CFU/ml，由此可见，配合使用实施例2所述的预处理液可使该免疫层析检测卡的灵敏度提高2倍左右。实施例6以公开号为CN104198703A发明名称为“人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用”的说明书中第【0134】段至【0194】段所公开的内容制备人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒。取培养的人肺炎支原体，将其用生理盐水稀释为0.5×104CFU/ml、1×104CFU/ml、2×104CFU/ml、4×104CFU/ml、6×104CFU/ml、8×104CFU/ml、16×104CFU/ml、24×104CFU/ml等不同的浓度。于各个稀释度样本中分别取出0.25ml的菌液与等量的由实施例3所制备的预处理液混合，于50℃反应20min后将反应液滴于检测卡的样品垫上按公开号为CN104198703A的说明书中第【0195】段至【0197】段所公开的方法进行检测；同时于各个稀释度样本中取出0.25ml菌液与等量的生理盐水混合作为对照试验，同时于50℃反应20min，后进行检测。结果发现，经预处理液预处理后，该检测卡对于人肺炎支原体的检测下限为8×104CFU/ml，而对于只经生理盐水处理的对照样品，其检测下限则为24×104CFU/ml，由此可见，配合使用实施例3所述的预处理液可使该免疫层析检测卡的灵敏度提高2倍左右。