一种用SPE‑HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法与流程

一种用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法技术领域本发明属于药物检测技术领域，具体来说，涉及到一种用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法。

背景技术：
枳实，中药名；属芸香科植物酸橙及栽培变种或甜橙的干燥幼果。酸橙，芸香科、柑橘属小乔木，枝叶密茂，刺多，徒长枝的刺长达8厘米。叶色浓绿，质地颇厚主产于四川、江西、福建、江苏等地。5～6月间采摘或采集自落的果实，自中部横切为两半，晒干或低温干燥，较小者直接晒干或低温干燥。用时洗净、闷透，切薄片，干燥。生用或麸炒用。《药品化义》：枳实专泄胃实，开导坚结，故主中脘以治血分，疗脐腹间实满，消痰癖，祛停水，逐宿食，破结胸，通便闭。枳壳是《中国药典》收录的草药，药用来源为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实。7月果皮尚绿时采收，自中部横切为两半，晒干或低温干燥。枳壳性苦、辛、酸、温，具有理气宽中、行滞消胀的功效，主治胸胁气滞，胀满疼痛，食积不化，痰饮内停，胃下垂，脱肛，子官脱垂等病症。枳壳在我国多地都有生产，以湖南和江西的产品为佳。枳实和枳壳中均含有较多的酚性化合物，如橙皮苷、圣草次苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、川陈皮素、5-去甲川陈皮素、甜橙黄酮、橘皮素、芹菜苷、野漆树苷、山奈苷、芹菜素、香叶木素、7-羟基香豆素、佛手柑内酯、佛手柑素和橙皮油素。上述酚性化合物具有良好的抗炎、抗氧化、抗癌等作用，其含量成为衡量枳实和枳壳质量的重要参考成分。由于枳实和枳壳中化学成分复杂，而上述酚性化合物的含量偏低且结构较为相似，导致在含量测定时存在较大误差。目前，对枳实和枳壳中的酚性化合物进行测定的文献较少，主要还是停留在一般的高效液相测定上，而且所检测的指标成分也较少。施学骄等曾提出星点设计-效应面法优化枳实总酚酸提取工艺，并进行了含量测定，但该法主要是针对总的酚分进行测定，没有建立对具体成分的含量测定方法。

技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供了一种用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法。本发明所述的一种用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法，所述方法具体步骤包括：A、酚性化合物的富集：取过60目筛的枳实或枳壳粉末0.4g，准确称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50mL，超声提取30min，放冷，摇匀，滤过，精密量取滤液25mL减压回收至干，用10mL水溶解，以1mL/min的流速过预先以2mL甲醇和5mL水平衡过的固相萃取小柱，然后依次用2mL30％甲醇淋洗，用10mL纯甲醇洗脱，收集纯甲醇洗脱部分定容至10mL，0.22μm微孔滤膜滤过，即得测试液；B、酚性化合物的测定：1)色谱条件：AgilentPoroshel120SB-C18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)；流动相A为甲醇，B为0.1％甲酸水溶液，采用梯度洗脱程序：0～4min，30％A；4～23min，30％～33％A；23～28min，33％～44％A；28～40min，44％A；40～44min，44％～63％A；44～48min，63％～65％A；48～50min，65％～73％A；50～56min，73％～96％A；柱温为30℃，流速0.6mL·min-1，检测波长：283nm，318nm，338nm；2)对照品制备：取各种对照品，精密称定，加甲醇分别制成含橙皮苷0.136mg·mL-1、圣草次苷0.177mg·mL-11、芸香柚皮苷0.508mg·mL-1、柚皮苷0.506mg·mL-1、新橙皮苷0.260mg·mL-1、柚皮素0.204mg·mL-1、橙皮素0.316mg·mL-1、川陈皮素0.154mg·mL-1、5-去甲川陈皮素0.150mg·mL-1、甜橙黄酮0.242mg·mL-1、橘皮素0.388mg·mL-1、芹菜苷0.246mg·mL-1、野漆树苷0.405mg·mL-1、山奈苷0.186mg·mL-1、芹菜素0.115mg·mL-1、香叶木素0.326mg·mL-1、7-羟基香豆素0.146mg·mL-1、佛手柑内酯0.169mg·mL-1、佛手柑素0.135mg·mL-1、橙皮油素0.148mg·mL-1的溶液，作为对照品储备液；3)含量测定：取供试液按上述色谱条件进行测定，并依据对照品对各对应的峰进行归属及含量计算。本发明所述的一种用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法，所述固相萃取小柱为Supel-SelectHLB小柱，Strata-X小柱，Strata-SDB-L小柱，StrataC18-E小柱中的一种。本发明所述的一种用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法，所述固相萃取小柱为Strata-X小柱。本发明所述的一种用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法，所述Strata-X小柱在用前先用质量浓度为1％的羟甘草黄烷酮乙醇溶液冲洗3倍量体积。与现有技术相比，本发明所述的用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法采用SPE对样品进行了前处理，减少了杂质成分对测定的影响，而固相萃取具有操作简便、富集率高、消耗溶剂少、成本低、集提取与分离于一体等优点。此外，本法建立的色谱条件对各待检测酚性化合物均有较好的分离度，且分析条件适宜。附图说明图1：不同萃取小柱的回收率图；图2：穿透体积效率图；图3：甲醇浓度与洗脱效果图；图4：甲醇用量与与洗脱效果图；图5：三种品种枳实和枳壳的PCA得分图；五角星-甜橙枳实，黄方块-香橙枳实，绿色倒三角-枳壳，浅蓝色圆圈-六月份采收的酸橙枳实，深蓝色圆圈-五月份采收的酸橙枳实。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明所述的用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法做进一步说明，但是本发明的保护范围并不限于此。实施例11仪器与试剂AgilentHP1100系列液相色谱仪(带自动进样器)，DAD紫外检测器，ChemStation色谱工作站，Supel-SelectHLB柱(美国Waters公司)，Strata-X小柱(美国Phenomenex公司)，Strata-SDB-L小柱(美国Phenomenex公司)，Strata-C18E小柱(美国Phenomenex公司)，TCQ-250型超声波清洗器(北京医疗设备二厂)，CP225D型电子天平(德国赛多利斯公司)。7-OH香豆素对照品(批号：MUST-14120715)、佛手柑内酯对照品(批号：MUST-14102708)均购自成都曼斯特生物科技有限公司。橙皮苷对照品(批号：K02M3C1)、柚皮苷对照品(批号：K21M4C1)、山萘苷对照品(批号：20120824)、芹菜苷对照品(批号：PJ-0603RA13)、甜橙黄酮(批号：P22D3R1)均购自上海源叶生物科技有限公司。野漆树苷对照品(批号：111919-201102)均购自中国食品药品检定研究院；芹菜素对照品(批号：1246-081013)、购自中药固体制剂制造技术国家工程研究中心。新橙皮苷对照品、橙皮素对照品、圣草次苷对照品、芸香柚皮苷对照品(批号：MUST-13041206)、橘皮素对照品、柚皮素对照品、芦丁对照品购自天津马克生物技术有限公司。川陈皮素对照品(批号：JZ14102611)、5-去甲川陈皮素(批号：JZ15041102)、佛手柑素对照品(批号：JZ14112901)、橙皮油素对照品(批号：JZ15041110)均购自南京景竹生物科技有限公司。...