本发明属于生物技术应用领域，具体涉及骨质疏松早期预测。
背景技术：
骨质疏松(osteoporosis，OP)是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征、以骨质脆性增加为临床表现的全身性骨代谢性疾病。
骨质疏松可分为原发性和继发性两类：原发性骨质疏松是指不伴引起本病的其他疾患而发生的骨质疏松，绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松是原发性骨质疏松的主要类型；继发性骨质疏松则是指由任何影响骨代谢的疾病、药物或器官移植等引起的骨质疏松。此外，按发生部位亦可分为局限性或泛发性骨质疏松。骨质疏松发病率位于中老年骨科常见病之首，我国是骨质疏松患者最多的国家，并且随着人均预期寿命的延长，其发病率将不断上升。骨质疏松不仅是危害我国人民健康的突出公共卫生问题，其高昂的治疗费用也给社会和国家带来沉重的经济负担。因此，加深对骨质疏松发病机理的认识，寻找影响其发病的关键因子，探索可能的早期干预靶点和干预方式，将成为骨质疏松的研究热点。
双能X线骨吸收测量仪(DXA)测定骨密度是目前临床诊断骨质疏松的金标准，但此方法存在仪器携带困难、检测费用高昂等缺点，并且只能实时检测当前骨密度，不具备预测骨质疏松风险的功能，因此寻找便捷、经济的骨质疏松检测方法成为目前研究的热点。近年来随着蛋白组学技术的发展，大规模、高通量检测技术的逐渐成熟，环磷酰胺(CTX)和I型胶原氨基端前肽(PINP)等可作为骨形成和骨吸收特异性标记物的蛋白因子陆续被发现。但目前仍缺乏较理想的骨质疏松早期临床预测的特异性检测指标。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于骨质疏松症早期预测的试剂盒，可应用于临床上对骨质疏松发病风险的早期评估。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
该试剂盒包括检测盘、标准品、干扰素-γ抗体Ⅰ以及可发射荧光的二抗，所述检测盘包括盘体以及设置于盘体上的至少两个加样孔，所述加样孔的底部包被有干扰素-γ抗体Ⅱ，所述标准品为干扰素-γ水溶液，所述水溶液的浓度≥1ng/mL，所述二抗为抗干扰素-γ抗体Ⅰ的抗体。
所述标准品的用量为200μL/孔。
所述干扰素-γ抗体Ⅱ的包被量大于所述标准品能够结合的干扰素-γ抗体Ⅱ的量。
所述检测盘的长度为5cm，宽度为3cm，高度为2cm。
所述加样孔为直径为1cm、深度为1cm的圆孔。
所述荧光为绿色光。
本发明的有益效果体现在：
本发明所述用于骨质疏松症早期预测的试剂盒利用微量待测者血清与IFNg抗体结合产生荧光的原理，检测待测者是否具有罹患骨质疏松的风险，操作简单易行，成本低廉，准确性高、可靠性好，与传统骨密度检查相比，具有风险预测功效，能为临床骨质疏松风险预测提供诊断依据。
附图说明
图1为OVX组与Sham组大鼠骨密度变化对比图；
图2为阳性蛋白因子(IFNg)对比图；
图3为阴性蛋白因子对比图：a为TNFa；b为VEGF；c为IL-1b；d为IL-4；
图4为OVX组大鼠骨密度与蛋白因子(IFNg)相关性分析图；
图5为本发明所述检测盘结构示意图(对应实施例中同时使用三个检测盘的情况)；
图6为本发明绿色荧光检测结果示意图，荧光强度A孔高于B孔，待测者具有罹患骨质疏松的风险；
图7为本发明绿色荧光检测结果示意图，荧光强度A孔等于B孔，待测者不具有罹患骨质疏松的风险；
图8为本发明绿色荧光检测结果示意图，荧光强度A孔低于B孔，待测者不具有罹患骨质疏松的风险；
图中：1为盘体，2为圆孔。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
(一)骨质疏松症早期诊断标志物IFNg(干扰素-γ)的发现
本发明采用蛋白组学技术检测绝经后骨质疏松症发病早期血清中含量发生显著性变化的蛋白标志物，为便捷、经济的早期预测骨质疏松症提供可能。
1、实验动物分组
20只SD大鼠按随机表法随机分为OVX组和Sham组，每组10只。OVX组是以卵巢切除(去势)大鼠模型作为动物模型，是常用的模拟妇女绝经后骨质疏松模型；Sham组为假手术对照组，在大鼠卵巢周围切去等量脂肪作为假手术对照。所有大鼠均在室温20℃～25℃、相对湿度60％～80％的清洁环境中，分笼适应性饲养7天。
2、骨质疏松模型建立
OVX组：2％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔内注射麻醉，俯卧位固定，常规备皮、消毒，分别在腹背部肋缘下1cm、脊柱两侧各1.5cm交界处切两个约1cm切口，进入腹腔、寻找并切除双侧卵巢；术后每日肌注40WU青霉素、连续3日，预防感染。Sham组：不切除双侧卵巢、仅切除卵巢周围等体积的脂肪，其他处理与OVX组相同。
3、血清样本提取
对OVX组和Sham组各大鼠于卵巢切除术后2、4、6、8周采用内眦静脉取血法取血1.5mL存于EP管中，各批血液标本在4℃冰箱内静置4小时后离心5min(3000rpm/min)，提取血清，保存于-80℃冰箱备用。
4、显微CT检测
卵巢切除术后2、4、6、8周利用显微CT扫描两组活体大鼠股骨。扫描方法：对大鼠采用2％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔内注射麻醉，而后固定扫描。扫描结束后，选取股骨远端位置相同体积的感兴趣区域(ROI)、设定骨的阈值(阈值＝1200)，利用InveonResearchWorkplace2.2软件(Inveon，西门子公司)进行骨小梁的三维重建及相关结构参数的计算。OVX组大鼠骨密度从第4周开始逐渐减少(BMD值为396.3±4.0mg/cm2)，第8周明显降低(BMD值为335.7±4.1mg/cm2)；Sham组未见明显变化；OVX组与Sham组相比骨密度下降差异具有统计学意义(P＝0.012)，见图1。OVX组大鼠松质骨形态计量学动态参数在BV/TV(P＝0.000)、Tb.Th(P＝0.001)、Tb.N(P＝0.014)较Sham组均有降低；OVX组大鼠Tb.Sp较Sham组明显增高(P＝0.037)。
5、蛋白芯片检测以及统计学分析
所有计量数据均用表示，采用SPSS13.0软件进行方差分析，OVX组与Sham组间骨密度、松质骨形态计量学动态参数和蛋白芯片结果比较均采用单因素重复测量数据方差分析；OVX组大鼠骨密度与阳性因子采用相关性分析。P＜0.05差异具有统计学意义。蛋白芯片共检测5个蛋白分子，包括IFNg、白细胞介素1b(IL-1b)、白细胞介素4(IL-4)、肿瘤坏死因子a(TNFa)、血管内皮生长因子(VEGF)，OVX组大鼠血清中IFNg含量从第4周开始升高，到第8周升高显著，与Sham组相比有统计学差异(P＝0.001)，参见图2。所检测其他蛋白分子含量未见明显差异(P＞0.05)，参见图3。根据OVX组大鼠骨密度变化结果和IFNg变化结果做骨密度与IFNg的相关性分析，发现骨密度与血清中IFNg(P＝0.045)的含量可见显著性相关，见图4。
总之，本发明利用蛋白组学方法，检测骨质疏松模型大鼠及正常大鼠的血清学指标，发现血清中IFNg指标在OVX组与Sham组中存在显著差异。通过对4个时间点骨密度、松质骨形态计量学动态参数和蛋白芯片的数据观测发现，随着时间的推移，OVX组大鼠骨密度、BV/TV、Tb.Th和Tb.N逐渐降低；Tb.SP逐渐增大；而血清中IFNg浓度第4周开始升高；相关性分析发现OVX组大鼠骨密度变化趋势与血清中IFNg浓度变化趋势具有一定相关性。这表明IFNg与早期骨质疏松症的发生和发展有密切联系。而IFNg含量在大鼠卵巢切除术后4周开始出现变化，这表明IFNg与其他因子相比在诊断早期骨质疏松方面具有优势，能够作为骨质疏松早期诊断标志物。
(二)用于骨质疏松症早期预测的试剂盒
1、试剂盒结构与组成
试剂盒包括一个检测盘、200μL标准品(IFNg蛋白溶液，浓度为1ng/mL)、200μLIFNg检测抗体(Abcam公司)、200μLDylight488荧光绿色二抗(抗Abcam公司的IFNg检测抗体，艾美捷科技有限公司)、10mL1×washbuffer(Abcam公司)以及一个离心管。
参见图5，所述检测盘为无色透明塑料盘(材料与一般的酶标板相同)，长度为5cm，宽度为3cm，高度为2cm。其上设置有2个直径为1cm、深度为1cm的圆孔2，分别标记为A孔和B孔，每个孔内包含包被在孔底的IFNg抗体(Abcam公司，用于捕获抗原IFNg，与IFNg检测抗体相比，针对IFNg的不同抗原表位)。IFNg抗体的包被量应足够大，以便可以真实的反映血清样品中IFNg的含量。
2、利用上述试剂盒进行骨质疏松早期预测的方法，包括以下步骤：
步骤1：血清样本的制备
采用静脉采血针采集三位待测者外周静脉血1mL，1500转转速离心5分钟，分离出上层血清于三个离心管中，分别标记为1#，2#和3#；
步骤2：检测盘准备
准备3个检测盘，分别标记为1#，2#和3#(图5)；
步骤3：加载血清样品
用移液器将1#，2#和3#血清样品各吸取200μL，分别加入1#，2#和3#检测盘A孔中；
步骤4：加载标准品
用移液器向1#，2#和3#检测盘B孔中各加入200μL标准品；室温静置一小时；
步骤5：
用移液器轻柔吸走所有孔中液体(此时IFNg已被孔底的IFNg抗体结合)；用移液器向每个孔中加入300μL1×washbuffer，轻柔摇晃后，吸走1×washbuffer，此过程重复三遍；用移液器向各孔中加入100μLIFNg检测抗体(过量)，室温静置45分钟后，用移液器轻柔吸走所有孔中液体；用移液器向每个孔中加入300μL1×washbuffer，轻柔摇晃后，吸走1×washbuffer，此过程重复三遍；
步骤6：加载Dylight488荧光绿色二抗(全程避光)
向各孔中加入100μLDylight488荧光绿色二抗(过量)，室温静置半小时，用移液器轻柔吸走所有孔中液体；用移液器向每个孔中加入300μL1×washbuffer，轻柔摇晃后，吸走1×washbuffer，此过程重复三遍；
步骤7：检测绿色荧光
将1#，2#和3#检测盘小心置于荧光显微镜下，观察绿色荧光强度，1#检测盘荧光强度A孔高于B孔，则1#待测者具有罹患骨质疏松风险(图6)；2#检测盘荧光强度A孔等于B孔，则2#待测者不具有罹患骨质疏松风险(图7)；3#检测盘荧光强度A孔低于B孔，则3#待测者不具有罹患骨质疏松风险(图8)。