一种基于化学衍生的非诺贝特胆碱胆碱部分的检测方法与流程

本发明属分析化学领域，涉及化学衍生化检测方法，特别涉及一种基于化学衍生的非诺贝特胆碱胆碱部分的检测方法。

背景技术：

据报道，高血脂症的发病率随人民生活水平的显著提高而呈现出直线上升的趋势。众所周知，血脂异常会带来一系列的病理变化，进而导致动脉粥样硬化、冠心病以及心脑血管疾病的发生发展，降脂药则有助于降低这些疾病的发生率和死亡率。研究显示，血脂成分中，胆固醇和甘油三酯是引起动脉粥样硬化以及心脑血管疾病的重要危险因素，与其相反，高密度脂蛋白则能够对抗动脉硬化，将胆固醇分解并排出体外。

非诺贝特胆碱，中文名称为2-（（4-氯）苯氧基）-2-甲基丙基-2-羟基-n,n,n-三乙基苯酚乙铵盐。分子式为c22h28clno5，分子量为421.91，熔点210-212℃。结构式如下：

现有技术公开了非诺贝特胆碱是非诺贝特在体内的代谢产物非诺贝特酸和胆碱结合而形成的复盐，属于氯贝丁酸衍生物类调血脂药，其在碱性条件下溶解度明显高于非诺贝特。非诺贝特酸通过激活过氧化物酶增殖体激活受体α（ppar-α）及pparγ，进而调节血脂代谢，降低低密度脂蛋白和甘油三酯、增加高密度脂蛋白，实现对血脂水平的调控。临床治疗实践中对于一些高血脂患者，通常采用非诺贝特酸类与他汀类联合用药的方式来改善其血脂水平。

目前针对非诺贝特胆碱的含量测定主要是集中在非诺贝特酸根部分，对于其胆碱部分的检测鲜有报道。在实际非诺贝特胆碱生成的工艺过程中，非诺贝特酸和氯化胆碱的比例对于非诺贝特胆碱的生成是一个非常重要的影响因素。因而胆碱部分的含量测定，对于非诺贝特胆碱合成的工艺控制及非诺贝特胆碱原料药的质量标准研究具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、准确的基于化学衍生的非诺贝特胆碱胆碱部分的检测方法。

为实现该目的，本发明的技术方案为：

一种基于化学衍生的非诺贝特胆碱胆碱部分的检测方法，以高效液相色谱仪为检测仪器，使用色谱柱为c8填料，5μm粒径，4.6×150mm规格；流动相为0.05mol/l磷酸二氢钠溶液水溶液（ph2.5）（c）、乙腈（d），等度洗脱条件为0-15min70%c+30%d；流速为1.0ml/min，柱温为30℃；进样量为20μl；检测波长为208nm；采用3,5-二硝基苯甲酰氯为衍生化试剂，衍生化试剂与非诺贝特胆碱摩尔比值为1.8~3.0，衍生时间为1~3h，衍生温度为40~70℃，衍生化溶剂体积为2.5~10ml。

进一步地，所述检测仪器为高效液相色谱仪。

进一步地，样品处理采用化学衍生法。

进一步地，化学衍生化试剂为3,5-二硝基苯甲酰氯，衍生化试剂与非诺贝特胆碱摩尔比为1.8~3.0，优选2.4为衍生化试剂与非诺贝特胆碱摩尔比值。

进一步地，衍生时间为1~3h，优选1h为衍生化时间。

进一步地，衍生温度为40~70℃，优选50℃为衍生温度。

进一步地，衍生化溶剂体积为2.5~10ml，优选5ml为衍生化溶剂体积。

本发明技术方案的有益效果为：

该法是一种基于化学衍生的非诺贝特胆碱胆碱部分的检测方法，快速、灵敏、准确、分离度好，对于非诺贝特胆碱合成的工艺控制及非诺贝特胆碱原料药的质量标准研究具有重要意义。

附图说明

图1是非诺贝特胆碱衍生化测定色谱图，其中，

a：空白溶剂衍生化色谱图；b：衍生化试剂3,5-二硝基苯甲酰氯衍生化色谱图；c：非诺贝特胆碱工作标准品衍生化色谱图；d：非诺贝特胆碱样品衍生化色谱图。

图2是非诺贝特胆碱胆碱部分含量测定标准曲线。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步的详细描述。

实施例1

1.仪器和试药

1.1分析仪器

岛津lc-10ad型高效液相色谱仪，spd-a紫外检测器，cto-10a柱温箱；hh-2恒温水浴锅（国华电器有限公司）。

1.2试验药品

非诺贝特胆碱工作标准品（以胆碱计含量为101.4%，上海邦成化工有限公司）；3,5-二硝基苯甲酰氯（cas号99-33-2，纯度99%，东京化成工业株式会社）；十二水和磷酸氢二钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

甲醇、乙腈（色谱纯，美国merck公司），纯水为millipore去离子水。

2.试验方法与结果

2.1样品衍生化过程

称取非诺贝特胆碱75mg与3,5-dnb100mg，加入5ml乙腈，55℃衍生1h（每15min手动震摇一次）；取出，冷却至室温，加入2.5ml去离子水，静置5min，转移至25ml容量瓶中，以乙腈定容；以流动相稀释100倍，进样分析。

2.2色谱条件

色谱柱：diamonsilc8（2），5μm，250×4.6mm；流动相：0.05mol/l磷酸二氢钠溶液水溶液（ph2.5）（c）、乙腈(d)，等度洗脱条件为0-15min70%c+30%d；流速为1.0ml/min，柱温为30℃；进样量为20μl；检测波长为208nm。

2.3定量限和检测限的确定

称取非诺贝特胆碱37.5mg，加入相应当量的3,5-二硝基苯基酰氯，按照“2.1样品衍生化过程”项处理，并对所得样品溶液进行逐级稀释，得到系列稀释液，进样检测。当样品溶液的主峰的信噪比（s/n）在10至20范围内时，该非诺贝特胆碱的浓度即为定量限（进样6次，rsd不得过3.0%）；当主峰的信噪比（s/n）在3至5范围内时，该非诺贝特胆碱的浓度即为检测限。结果，该方法定量限为150ng/ml、检测限为75ng/ml。

2.4建立标准曲线

称取非诺贝特胆碱工作标准品37.5、45、75、90、150mg，分别加入相应量的3,5-二硝基苯基酰氯，按照“2.1样品衍生化过程”项处理、分析。以非诺贝特胆碱工作标准品的质量（x）为横坐标，以峰面积（y）为纵坐标，得到标准曲线y=26705x-6993（r²=0.9999），如图2所示。

2.5准确度考察

向低（60mg）、中（75mg）、高（90mg）3个水平非诺贝特胆碱工作标准品中加入对应的3,5-二硝基苯基酰氯，按照“2.1样品衍生化过程”项处理，每个水平平行处理3份，进样分析。结果低、中、高3个水平的相对回收率分别为100.83%±0.12%、100.88%±0.13%、100.43%±0.59%，rsd%分别为0.12%、0.13%、0.59%。相对回收率和rsd%值均在规定范围内，说明所述检测方法准确、可靠。

2.6精密度考察

向75mg非诺贝特胆碱样品中加入对应的3,5-二硝基苯基酰氯，按照“2.1样品衍生化过程”项处理，平行处理6份。75mg非诺贝特胆碱工作标准品，按照“2.1样品衍生化过程”项处理，平行处理2份。于同一天内进样测定，计算天内精密度；同样的方法连续测定3天，计算天间精密度；由不同的分析人员进行测定，计算中间精密度。结果日内精密度为102.16%±0.79%，rsd%为0.78%；日间精密度为101.94%±0.56%，rsd%为0.55%；中间精密度为102.00%±0.69%，rsd%为0.68%。精密度和rsd%值均在规定范围内，表明所述检测方法准确、可靠。

2.7衍生化溶液放置稳定性测试研究

称取非诺贝特胆碱样品75mg，向其中加入对应的3,5-二硝基苯基酰氯，按照“2.1样品衍生化过程”项处理，进样检测，记录室温及4℃下的初始峰面积及两个放置条件下2、4、6、8、12、24h的峰面积。结果，室温及4℃条件下，衍生化溶液放置24h后，峰面积的rsd%分别为0.47%和0.67%，表明在这两种条件下衍生化溶液放置24h内稳定性良好，含量未见明显降低，表明该方法稳定性好。

以上实施例仅为本发明的技术思想的说明，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内。