一种高效液相色谱法分离与测定阿普斯特及有关物质的方法与流程

本发明属于分析化学
技术领域：
，涉及阿普斯特与有关物质的分离及检测，具体来说，涉及采用高效液相色谱法分离与测定阿普斯特及有关物质的方法。
背景技术：
：阿普斯特是一种磷酸二酯酶抑制剂，为首个被fda在2014年3月21日批准上市、用于治疗银屑病引起的关节炎(psa)的小分子药物，原研公司为celgene。阿普斯特分子式为c22h24n2o7s，化学名为n-[2-[(1s)-1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基1)-2-(甲磺酰基)乙基]-2,3-二氢-1,3-二酮-1h-异吲哚-4-基]乙酰胺，其化学结构式如下：在阿普斯特合成过程中，会产生一些相关的杂质物质如生产过程中产生的副产物或中间体或降解产物等，这些杂质可能会由于去除不完全而影响药物的纯度和质量，目前，已知的杂质物质有5种，分别为：如式ⅰ所示的有关物质1(工艺杂质/降解产物)、如式ⅱ所示的有关物质2(工艺杂质/降解产物)、如式ⅲ所示的有关物质3(工艺杂质)、如式ⅳ所示的有关物质4(工艺杂质)和如式ⅴ所示的有关物质5(工艺杂质/降解产物)，这5种有关物质的结构式如下：对于阿普斯特合成工艺中引入的上述副产物和中间体，在阿普斯特原料药中需要进行质量控制，而阿普斯特相关的降解杂质需要在阿普斯特原料药及制剂中进行质量控制，因此，实现阿普斯特及有关物质的分离和测定对阿普斯特原料及制剂的生产和贮存具有重要的意义。现有技术中，申请号为201410765717.5的发明专利公开了一种用液相色谱法分离测定阿普斯特有关物质的方法，该方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以0.1％三氟乙酸与乙腈为流动相，定量测定阿普斯特及其有关物质的含量；但是，采用申请号为201410765717.5的发明专利中公开的方法不能完全将阿普斯特及有关杂质分离，且系统基线漂移严重，该方法并不能适用于其他的有关杂质，也不能同时完全分离检测本申请中所述的五种杂质，说明目前现有技术中公开的方法不能同时适用于上述的五种杂质的检测。技术实现要素：有鉴于此，本申请发明人通过大量实验摸索了阿普斯特有关物质的质量控制方法，并严格进行方法验证，保证方法的科学严谨，满足了研发和生产的需求。因此，本发明的目的首先在于提供一种分离阿普斯特及有关物质的方法。其次，本发明的目的还在于提供一种高效液相色谱法分离与测定阿普斯特及有关物质的方法。为实现上述目的，本发明的技术方案为：分离阿普斯特及有关物质的方法，所述方法以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以乙腈和/或甲醇的水溶液为流动相。进一步，所述的方法，所述流动相中还含有体积百分浓度为0.02-0.15％的磷酸，优选体积百分浓度为0.02-0.1％，更优选体积百分浓度为0.05％。进一步，所述的方法，所述有关物质为式ⅰ、式ⅱ、式ⅲ、式ⅳ、式ⅴ中的一种或多种；式ⅰ、式ⅱ、式ⅲ、式ⅳ、式ⅴ的结构式如下所示：本发明所述的分离阿普斯特及有关物质的方法适用于上述的5种杂质的分离，可用于单独分离某一种杂质，也可同时分离这5种杂质，与现有技术相比，本发明的检测方法基线平稳，能更准确、更有效地分离阿普斯特及上述的5种有关物质，具有显著的进步性。本发明还保护一种高效液相色谱法分离与测定阿普斯特及有关物质的方法，所述高效液相色谱法分析过程中采用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以溶液a和有机溶剂b按一定比例混合为流动相进行洗脱；所述的溶液a为水，所述有机溶剂b为乙腈和/或甲醇。进一步，所述的方法，所述溶液a为体积百分浓度为0.02-0.15％的磷酸水溶液。进一步，所述的方法，优选体积百分浓度为0.02-0.1％的磷酸水溶液，更优选体积百分浓度为0.05％的磷酸水溶液。进一步，所述的方法，优选有机溶剂b为乙腈。更进一步，所述的方法，所述有机溶剂b中还含有体积百分浓度为0.02-0.15％的磷酸，优选体积百分浓度为0.02-0.1％，更优选体积百分浓度为0.05％。进一步，所述的方法，所述有关物质为式ⅰ、式ⅱ、式ⅲ、式ⅳ、式ⅴ所示的化合物中的一种或多种。进一步，所述的方法，所述的高效液相色谱法为反相液相色谱法，采用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，所述十八烷基硅烷键合硅胶颗粒粒径为3-5μm，优选粒径为5μm，色谱柱柱长为150-250mm，优选为250mm。采用所述的色谱柱进行分离时，色谱柱适用的柱温范围为30-40℃，优选为40℃。进一步，所述的方法，当采用所述流动相进行洗脱时，流动相的流速为0.5-1.5ml/min，优选为1.0ml/min。进一步，所述的方法，洗脱后采用紫外检测器进行检测，dad检测器和vwd均适用。优选所述高效液相色谱法分析过程中，流动相洗脱后采用紫外检测器进行检测，检测波长为230±5nm。进一步，所述的方法，以溶液a和有机溶剂b按一定比例混合为流动相进行梯度洗脱，所述梯度比例为：0min，溶液a与有机溶剂b的体积比为80:20；10min，溶液a与有机溶剂b的体积比为80:20；35min，溶液a与有机溶剂b的体积比为25:75；45min，溶液a与有机溶剂b的体积比为25:75；46min，溶液a与有机溶剂b的体积比为80:20；52min，溶液a与有机溶剂b的体积比为80:20。进一步，所述的方法，所述高效液相色谱法分析过程中，对照品或待测样品均需先溶解，在本发明中，采用乙腈与0.01m的kh2po4的混合液为溶媒溶解或稀释对照品或待测样品，所述混合液的ph为3.5±0.2，优选采用磷酸调节ph。进一步，优选混合液中乙腈与0.01m的kh2po4的体积比为50：50。本发明所述的方法，在一个具体实施方式中，按照以下方法实现：取阿普斯特、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5对照品各适量，用乙腈：0.01mkh2po4(磷酸调ph＝3.5)＝50：50溶解，配制成每1ml含阿普斯特300μg，含有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4和有关物质5各3μg的系统适用性溶液。取阿普斯特对照品，用乙腈：0.01mkh2po4(磷酸调ph＝3.5)＝50：50溶解，配制成每1ml含1.5μg的对照品溶液。取待测样品(阿普斯特或含阿普斯特药物组合物)适量，用乙腈：0.01mkh2po4(磷酸调ph＝3.5)＝50：50溶解，配制成每1ml含阿普斯特300μg的供试品溶液，分别取系统适用性溶液、供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，按本发明色谱条件(色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，柱长为250mm，检测波长为230nm，以0.05％磷酸溶液和0.05％磷酸乙腈为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱的比例如表1所示，流动相的流速为1.0ml/min，色谱柱柱温箱温度为40℃，进样体积为20μl)进行测定，按带校正因子的自身自身对照法计算供试品中各已知杂质的含量，按自身对照法计算供试品中其他单个杂质的含量，总杂质为各已知杂质与其他单个杂质之和。表1梯度洗脱溶液a与有机溶剂b的体积时间(min)01035454652溶液a(％)808025258080有机溶剂b(％)202075752020本发明的有益效果：本发明的分离阿普斯特及有关物质的方法基线平稳，能更准确、更有效地检测分离上述的5种有关物质，而申请号为201410765717.5的方法基线漂移严重且不能完全分离检测出上述5种有关物质。本发明的一种高效液相色谱法分离与测定阿普斯特及有关物质的方法，该方法对上述的5种有关物质均能适用，可以同时对其中的一种或多种有关物质进行分离检测，与现有技术相比，提高了分离检测的效率。与现有技术相比，检测结果更准确，从而能更精准的确保阿普斯特原料及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。附图说明图1为实施例1和实施例2中系统适用性溶液的hplc图；图2为实施例1中测定阿普斯特有关物质hplc图；图3为实施例2中测定阿普斯特片有关物质hplc图；图4为对比实施例1中系统适用性溶液hplc图；图5为对比实施例1中有关物质2溶液hplc图；图6为实施例3中采用本发明方法测定阿普斯特酸降解溶液hplc图；图7为对比实施例2中采用申请号为201410765717.5方法测定阿普斯特酸降解溶液hplc图；图8为实施例3中采用本发明方法测定酸降解溶液中rrt0.97峰的收集液hplc图；图9为对比实施例2中保留时间为25.303min峰的[m+h]质谱图；图10为对比实施例2中保留时间为25.303min峰的[m-h]质谱图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。以下实施例中，本发明的方法采用的仪器及色谱条件如下：(1)高效液相色谱仪：lc-2010(岛津)；检测器：uv；色谱工作站：lcsolution。(2)色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，硅胶颗粒粒径为5μm，色谱柱柱长250mm，直径为4.6mm。(3)质谱仪：api3000；工作站：analyst1.4.2；离子源：esi。(4)流动相溶液a：0.05％磷酸溶液；有机溶剂b：0.05％磷酸乙腈。(5)检测条件流动相：溶液a和有机溶剂b按照下表所示的体积比例进行混合作为流动相进行梯度洗脱；流动相流速：1.0ml/min；柱温箱温度：40℃；洗脱后检测器检测波长：230nm；进样量：20μl。时间(min)01035454652溶液a(％)808025258080有机溶剂b(％)202075752020实施例1阿普斯特原料药有关物质的测定取阿普斯特、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5对照品各适量，用乙腈：0.01mkh2po4(磷酸调ph＝3.5)＝50：50(体积比)溶解，配制成每1ml含阿普斯特300μg，有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4和有关物质5各3μg的系统适用性溶液。取阿普斯特原料药适量，用乙腈：0.01mkh2po4(磷酸调ph＝3.5)＝50：50(体积比)溶解，配制成每1ml含阿普斯特300μg的供试品溶液。精密量取上述供试品溶液适量，用乙腈：0.01mkh2po4(磷酸调ph＝3.5)＝50：50(体积比)溶解并配制成每1ml含1.5μg的对照溶液。分别取系统适用性溶液、对照溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图1、和图2。按带校正因子的主成分自身对照法计算供试品中各已知杂质的含量，按自身对照法计算供试品中其他单个杂质的含量，总杂质为各已知杂质与其他单个杂质之和。计算公式如下：式中：ax——各杂质峰峰面积，mau；ar——0.5％对照溶液主峰峰面积，mau；fx——已知杂质校正因子；∑ax—各杂质峰峰面积总和，mau。实施例2阿普斯特制剂(阿普斯特片)中有关物质的测定取阿普斯特、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5对照品各适量，用乙腈：0.01mkh2po4(磷酸调ph＝3.5)＝50：50(体积比)溶解，配制成每1ml含阿普斯特300μg，有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4和有关物质5各3μg的系统适用性溶液。取阿普斯特片研细，取适量，用乙腈：0.01mkh2po4(磷酸调ph＝3.5)＝50：50(体积比)适量超声处理30分钟(随时振摇)，配制成每1ml含阿普斯特300μg的供试品溶液。精密量取上述供试品溶液适量，用乙腈：0.01mkh2po4(磷酸调ph＝3.5)＝50：50(体积比)溶解并配制成每1ml含1.5μg的对照溶液。分别取系统适用性溶液、对照溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图1和图3。按带校正因子的主成分自身对照法计算供试品中各已知杂质的含量，按自身对照法计算供试品中其他单个杂质的含量，总杂质为各已知杂质与其他单个杂质之和。计算公式如下：式中：ax——各杂质峰峰面积，mau；ar——0.5％对照溶液主峰峰面积，mau；fx——已知杂质校正因子；∑ax—各杂质峰峰面积总和，mau。对比实施例1按照现有技术(申请号为201410765717.5)中公开的方法进行测定，色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶(hypersilbdsc18)，柱长150mm，直径4.6mm(耐酸柱)，十八烷基硅烷键合硅胶颗粒粒径为5μm。流动相为a相与b相的混合。a相：0.1mol/l三氟乙酸溶液；b相：乙腈。按照下表所示的体积比例进行混合作为流动相进行梯度洗脱。时间(min)030354050溶液a(％)9040409090有机溶剂b(％)1060601010检测波长：220nm。进样量：20μl。柱温箱温度：25℃。检测时间：主峰的2倍保留时间。取阿普斯特、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5对照品各适量，用乙腈溶解，配制成每1ml含阿普斯特300μg，有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4和有关物质5各3μg的系统适用性溶液，取该溶液注入液相色谱仪，按申请号为201410765717.5的色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图4。图4和实施例1中图1相比，检出已知杂质峰的个数为4个，有1个已知杂质有关物质2未检测出。另外再取有关物质2对照品适量，用乙腈：0.01mkh2po4(磷酸调ph＝3.5)＝50：50(体积比)溶解，配制成每1ml含有关物质2为20μg的溶液，取该溶液注入液相色谱仪，按申请号为201410765717.5的色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图5。由图5可知，即使提高进样液中有关物质2的浓度，按照申请号为201410765717.5的色谱条件进行检测，有关物质2仍未能检出。由此可见，本发明的方法能同时检测出有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4和有关物质5，而申请号为201410765717.5方法却不能检出有关物质2。实施例3阿普斯特酸降解后有关物质的检测取阿普斯特适量，置量瓶中，加入1mol/l盐酸溶液2.0ml，80℃水浴放置1h，取出，冷却，加1mol/l氢氧化钠溶液2.0ml中和后，加入乙腈：0.01mkh2po4(磷酸调ph＝3.5)＝50：50(体积比)混合液40ml，超声处理10分钟(随时振摇)，取出，放冷，加乙腈：0.01mkh2po4(磷酸调ph＝3.5)＝50：50(体积比)混合液定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，取该供试品溶液注入高效液相色谱仪，按本发明色谱条件进行分析，记录色谱图，结果见图6。对比实施例2按照现有技术(申请号为201410765717.5)中公开的方法进行阿普斯特酸降解后有关物质的检测，色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶(hypersilbdsc18)，柱长150mm，直径4.6mm(耐酸柱)，十八烷基硅烷键合硅胶颗粒粒径为5μm。流动相a相：0.1mol/l三氟乙酸溶液；b相：乙腈。a相与b相按照下表所示的体积比例进行混合作为流动相进行梯度洗脱。时间(min)030354050溶液a(％)9040409090有机溶剂b(％)1060601010检测波长：220nm；进样量：20μl；柱温箱温度：25℃；检测时间：主峰的2倍保留时间。取实施例3中制备的供试品溶液注入高效液相色谱仪，按本实施例的色谱条件进行检测，记录色谱图，结果图7。取实施例3中制备的供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，按本发明色谱条件的色谱条件进行检测，收集最大降解杂质rrt0.97的色谱峰溶液，取该收集液20μl，注入液相色谱仪中，按照本发明的色谱条件进行检测，记录色谱图，结果见图8，并收集保留时间为25.303min的色谱峰溶液，采用api3000ms，esi离子源的正离子、负离子模式进行分析，结果见图9、10。由图6和图7可知，图6中检出杂质峰个数更多，图7中酸降解杂质有关物质2未检出。由图8可知，rrt0.97实际为酸降解峰，申请号为201410765717.5不能检测出这个降解杂质。由图9和图10可知，保留时间为25.303min峰的分子量为418.46，和有关物质2的分子量一致。由实施例3和对比实施例2的结果可知，利用本发明色谱条件对阿普斯特酸降解后的有关物质进行检测，能将有关物质2有效检测出，申请号为201410765717.5方法分离杂质能力不如本发明的方法，不能有效检测出有关物质2，本发明的方法检测结果更准确。综上所述，与现有技术相比，本发明的一种高效液相色谱法分离与测定阿普斯特及有关物质的方法：首先，对本发明中所述的5种有关物质均能适用，可以同时对其中的一种或多种有关物质进行分离检测，与现有技术相比，提高了分离检测的效率；其次，利用本发明色谱条件检测阿普斯特酸降解杂质，能更准确、更有效地将有关物质2和其他降解杂质有效分离开，申请号为201410765717.5方法却不能检测出有关物质2，能更精准的确保阿普斯特原料及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。因此，本发明色谱条件带来了有益的效果，具有显著的进步性。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页12