针头式固相萃取过滤器的制作方法

本发明涉及物质分离技术领域，特别是涉及一种针头式固相萃取过滤器。

背景技术：

色谱分析前的样品前处理是至关重要的步骤，目前固相萃取(Solid-phase extraction,SPE)是十分重要的方法，可将目标组分浓缩富集，达到样品纯化的目的。与传统液液萃取相比，可提高回收率，更有效地将目标组分与杂质干扰物分离，被广泛应用于医药、食品、环境、化工等领域。

经固相萃取洗脱的组分需除去大颗粒方可进入液相色谱等分析仪器检测分析。滤膜分离在生物、化学分析领域的应用最为引人注目。针头式过滤器结构简单，成本低廉，而且过滤效果好，普遍适用性强，在实验室中广泛使用，作为小体积样品的过滤处理装置。

目前现有的针头式过滤器的结构为：在壳体内腔中设置滤膜，在壳体的上下两侧分别设置与壳体内腔相连通的注射器乳头接口和针栓接口，因此仅做过滤用，不具备固相萃取功能。

固相萃取与膜过滤的分步操作，增加了耗材成本与前处理的复杂度。现有技术的固相萃取柱体积较大，消耗填料和溶剂较多，萃取操作成本较高。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种结构简单、使用方便的针头式固相萃取过滤器。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种针头式固相萃取过滤器，包括壳体，在壳体的上下两侧分别设置与壳体内腔相连通的注射器乳头接口和针栓接口；

在壳体内腔中从上至下依次设置上筛板、固相萃取填料、下筛板和滤膜；

所述上筛板和下筛板上分别设有孔径为95～105μm(较佳为100μm)的筛孔。

作为本发明的针头式固相萃取过滤器的改进：所述固相萃取填料的粒径为110～130μm(较佳为120μm)，固相萃取填料为-C18、-C8、硅胶、氧化铝、Florisil、硅藻土、活性炭、Diol(二醇基)中的至少一种。

作为本发明的针头式固相萃取过滤器的进一步改进：滤膜为尼龙。

作为本发明的针头式固相萃取过滤器的进一步改进：滤膜的过滤孔径为0.5μm。

作为本发明的针头式固相萃取过滤器的进一步改进：注射器乳头接口和针栓接口均为标准直插口或标准螺纹口。

本发明实际使用时，注射器乳头接口与标准注射器乳头相连接，针栓接口与注射器针栓相连。

本发明的针头式固相萃取过滤器，是将固相萃取与膜过滤有效结合，解决了现有技术中存在的固相萃取、膜过滤步骤繁琐、传统固相萃取柱体积较大、使用填料较多、洗脱液消耗较多、操作成本较高等问题。

本发明的针头式固相萃取过滤器的使用方法，具体为依次进行以下步骤：

一、样品制备：精确称量样品，用有机溶剂水溶液提取，高速离心15min后取上清液，将沉淀物重复提取操作2次，合并上清液并减压蒸干，再加入少量有机溶剂水溶液复溶。

二、填料活化：使用有机溶剂水溶液对填料层(固相萃取填料)进行活化处理，使用3mL注射器将有机溶剂水溶液从注射器乳头接口注入至壳体内腔，有机溶剂水溶液依次流经上筛板、固相萃取填料、下筛板和滤膜后，从针栓接口处被排出壳体外。有机溶剂水溶液流经填料层的速度约为0.1～2mL/min。将流出液收集并丢弃，达到针头式固相萃取过滤器活化与清洗的目的。

三、上样：取3mL注射器抽取适量样品溶液，以0.1～2mL/min的速度注入针头式固相萃取过滤器，目标组分被吸附在填料上，杂质直接随样品溶液流出针头式固相萃取过滤器并丢弃。

四、淋洗：向针头式固相萃取过滤器以0.1～2mL/min的速度注入3mL淋洗液，所述的淋洗液为超纯水(含0～10％甲醇或乙腈)，目的是为了洗去与目标组分共吸附的杂质。

五、洗脱：向针头式固相萃取过滤器加入1～3mL洗脱剂，所述洗脱剂为甲醇或乙腈(含0～30％超纯水)，流速为0.1～2mL/min，收集洗脱液。

在发明过程中，发明人发现由于针头式过滤器与固相萃取柱在实验操作中均会产生较强压力，两者压力叠加后会造成溶液滞留的问题；同时，过滤实验溶剂单一，而固相萃取实验溶剂体系复杂，会造成滤膜溶解的问题；这两个原因使得固相萃取在与滤膜的联用困难，因此市面上暂时没有相关产品。因此，本发明采用粒径为110～130μm填料(例如，-C18，粒径为120μm时，比表面积约500m²/g)，使常压下溶剂能自然流出固相萃取填料，滤膜材料采用尼龙，相比传统的聚四氟乙烯滤膜(仅适用于有机溶剂)和混合纤维素酯(仅适用于水)，尼龙膜与无机和有机溶剂均可兼容；滤膜孔径采用0.5μm，相比常规0.45与0.22μm滤膜压力更小。本发明结合以上技术改进点使固相萃取与微孔滤膜联用。

本发明具有如下技术优势：

1、首次将固相萃取与膜过滤结合在一个装置中，大大简化操作步骤，节约溶剂、填料及操作成本。

2、遵循样品制备、填料活化、上样、淋洗和洗脱步骤，简单易培训，且无需特殊仪器设备，实用性强，适合实验室广泛使用。

3、本发明的方法稳定、高效，通过调节不同的填料和膜材料，可适用于不同的样品与溶剂，适用范围广，效果好。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为实施例1的针头式固相萃取过滤器的剖面结构示意图；

其中，1、上筛板；2、固相萃取填料；3、下筛板；4、滤膜；5、壳体；6、注射器乳头接口；7、针栓接口。

图2为使用针头式固相萃取过滤器进行前处理的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱的色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：以下结合附图详细说明本发明的具体实施方式，使本领域的技术人员更清楚地理解如何实践本发明。应当理解，尽管结合其优选的具体实施方案描述了本发明，但这些实施方案只是阐述，而不是限制本发明的范围。

实施例1、一种针头式固相萃取过滤器，如图1所示，包括壳体5，在壳体5的上下两侧分别设置与壳体5内腔相连通的注射器乳头接口6和针栓接口7；在壳体5内腔中从上至下依次设置上筛板1、固相萃取填料2、下筛板3和滤膜4；即，上筛板1、固相萃取填料2、下筛板3和滤膜4为无间隙的层层相叠。

上筛板1、下筛板3上分别设置孔径为100μm的筛孔。上筛板1正对注射器乳头接口6，而滤膜4正对针栓接口7。注射器乳头接口6和针栓接口7均为标准直插口或标准螺纹口。该十八烷基氯硅烷C18是粒径为120μm的填料，比表面积约500m²/g。

实际使用时，可采取如下尺寸：

上筛板1、下筛板3均为聚乙烯PE材料(厚度1mm)，固相萃取填料2为十八烷基氯硅烷C18(厚度2.5mm)、滤膜4为尼龙材料(厚度约0.5mm，孔径0.5μm)。

整个针头式固相萃取过滤器的外部尺寸为：直径15mm，厚度10m(不计接口)。

上筛板1、固相萃取填料2、下筛板3和滤膜4的直径均＝壳体5内径(13mm)。

实验1、应用实施例1的针头式固相萃取过滤器对虾头组织中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的富集净化。

一、样品制备：精密称定研磨好的虾头样品0.1g，用氯仿-甲醇(2：1，体积比)混合液3mL冰浴超声提取30min，加入超纯水1mL并以12,000rpm/min高速冷冻离心5分钟。使用200mL移液枪转移下清液，向余下的上清液和固形物中加入2mL氯仿，根据上述操作重复提取两次。合并下清液并用氮气吹干，加入1mL甲醇复溶，得粗提物。

二、填料活化：针头式固相萃取过滤器使用前预先分别用3mL甲醇、50％甲醇水溶液、乙腈进行活化和平衡。

三、上样：用移液枪取粗提物100μL后上样，并以1mL/min流速通过针头式固相萃取过滤器。

四、淋洗：向针头式固相萃取过滤器以1mL/min的速度注入3mL淋洗液(5％乙腈水溶液)，洗去与磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺共吸附的杂质。

五、洗脱：用90％乙腈1mL进行洗脱，流速为1mL/min，收集洗脱液后用氮气吹干，并用200μL乙腈复溶后准备质谱分析。

六、液相色谱/质谱检测：使用安捷伦1100液相色谱系统，选用YMC Triart diol HILIC色谱柱(4.6mm×250mm,3μm)；流动相为A：含53mM甲酸的乙腈溶液，B：含53mM甲酸水溶液；流速为200μL/min；流动相梯度系统为0–15min：2％A(98％B),15–60min：从2％A到40％A,60–70min：40％A,70–80min：从40％A到2％A。质谱采用美国AB Sciex公司的QSTAR三重四级杆/飞行时间质谱，扫描范围从m/z 450到950；正负离子模式下离子喷雾电压分别为5.5和4.5kV。离子源温度为450℃；雾化气和气帘气分别为35和20psi。去簇电压和碰撞电压分别为100和40V。磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的谱图如图2所示。

结果

本实验以标准品浓度范围0.5－200μg/mL进行梯度稀释进样(即，以此替代步骤一的粗提物)，标准品含量为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，以y＝a+bx线性拟合，磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的R²均大于0.99。分别以3倍和10倍信噪比(S/N)确定目标分析物的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，测得磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的检出限分别为0.12和0.23μg/mL，定量限为0.37和0.71μg/mL。对空白肌肉组织样品添加水平分别为LOQ和20倍LOQ，每个浓度设置3个样品，按拟定实验方法测定，计算精密度、回收率见表1。精密度小于6.1％，表明仪器精密度良好；磷脂回收率为82.3％～90.7％，满足分析测试需要。

表1、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的定量参数

综上可见，本发明的针头式固相萃取过滤器可以有效的对虾头中的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺富集净化，单支针头式固相萃取过滤器的成本低廉，并且回收率高，精密度好。与现有的商品化固相萃取柱相比，将固相萃取与膜过滤结合在一个装置中，大大简化操作步骤，节约溶剂、填料及操作成本。

实施例2、将实施例1中的固相萃取填料2由十八烷基氯硅烷C18分别改成辛烷基硅烷键合硅胶C8、硅胶、氧化铝、Florisil、硅藻土、活性炭、Diol(二醇基)；粒径仍为120μm，其余等同于实施例1。

以所得的针头式固相萃取过滤器如同实验1进行检测，磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的定量参数如表2所述。

表2

对比例1、将实施例1中的十八烷基氯硅烷C18由“粒径120μm，比表面积约500m²/g”改成常规的“粒径45μm填料，比表面积约480m²/g”，其余等同于实施例1。

对比例2、将实施例1中的滤膜4的孔径由0.5μm改成常规的0.45μm；其余等同于实施例1。

以上述2个对比例所得的针头式固相萃取过滤器如同实验1进行检测，磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的定量参数如表3所述。

表3

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。