一种绿茶丙烯酰胺测定方法与应用与流程

本发明涉及分析检测技术领域，具体地说涉及一种绿茶丙烯酰胺测定方法与应用。

背景技术：

丙烯酰胺(Acrylamide)，化学分子式CH₂CHCONH₂，是一种易溶水的无色透明片状结晶，作为一种常见的有机合成原料，在工业上得到了广泛的应用。国际癌症研究中心(IRAC)将丙烯酰胺列为IIA类致癌物；WHO认为“致癌风险性超过10^-5的指导值为0.5ug/L”；自2002年瑞典科学家首次发现淀粉类食品在高温加工过程中会产生大量的丙烯酰胺后即引起全球广泛关注。

我国是世界茶叶大国，茶园面积、茶叶产量位居世界第一。茶叶内质成分丰富，加工工序多样，茶种类多，有研究表明，制茶过程中茶叶内质成分会发生复杂的化学变化，从而产生丙烯酰胺等潜在危害物，茶叶加工过程安全已成为食品安全领域关注的新焦点。目前，国际上多采用HPLC-MS/MS方法测定食品中丙烯酰胺含量，该方法操作简单、灵敏度较高，但不同食品基质会影响方法的检测效果。

技术实现要素：

为解决目前测定食品中丙烯酰胺含量因不同食品基质影响方法的检测效果问题，本发明提出了一种绿茶丙烯酰胺测定方法与应用，检测方法准确性、重现性、稳定性较好，适于绿茶中丙烯酰胺的实际检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种绿茶丙烯酰胺测定方法为：

(1)样品前处理：

称取粉碎后的绿茶样品依次加入甲酸、同位素标记丙烯酰胺标准溶液，混匀，在30-90℃水浴并振荡10-60min；然后依次加入乙腈、硫酸镁、氯化钠，密封振荡，离心；取上清液，水浴下氮气吹干，过滤，得到预处理样品；

所述的同位素标记丙烯酰胺标准溶液为¹³C₃-丙烯酰胺溶解于体积百分比浓度0.1％甲酸中制得，¹³C₃-丙烯酰胺的浓度为30-70ng/mL。

绿茶粉末、甲酸、同位素标记丙烯酰胺标准溶液的质量体积比为1g∶7-11mL∶0.8-1.2mL。

绿茶粉末、乙腈、硫酸镁、氯化钠的质量体积比为1g∶9-11mL∶3-5g∶0.5-1.5g。

作为优选，通过5000-12000rpm/min离心4-10min，取上清液，在30-90℃水浴下氮气吹干，经0.45μm微孔滤膜过滤。

(2)净化：采用固相萃取柱对预处理样品进行净化处理，得到待测样品；

所述的净化方法为：对固相萃取柱进行预处理后，将步骤(1)得到的预处理样品进行上样，收集透过液，过膜，得到待测样品。

(3)采用高效液相色谱串联质谱法对待测样品进行检测，通过内标法计算丙烯酰胺含量。分别将试样和系列标准品注入HPLC-MS/MS系统，记录丙烯酰胺和¹³C₃-丙烯酰胺峰面积，以丙烯酰胺和¹³C₃-丙烯酰胺的浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标作图，绘制丙烯酰胺标准曲线。由此计算样品中丙烯酰胺的含量。作为优选，每个处理进行三次重复，取其平均值进行分析。

色谱测试条件为：流动相包括体积浓度为为99.9％的水、乙腈的混合液与流动相体积浓度为0.1％的甲酸；流速为200μL/min；进样体积10μL；柱温34-36℃，其中水、乙腈的混合液中水与乙腈的体积比为99∶1。

质谱条件：离子化方式为ESI离子源；扫描方式为正电离；检测方式为多离子反应监测，碰撞能量为8eV，碰撞诱导解离电压：50V。

离子源条件：干燥气温度：325C；干燥气流速：5L/min；雾化气压力：45psi；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：3000V，其中：

本发明针对绿茶基质特性，优化样品前处理方法，以¹³C₃-丙烯酰胺为内标，采用多选择反应监测(MRM)模式，通过方法学论证，构建基于HPLC-MS/MS的绿茶丙烯酰胺定量分析方法，同时根据该分析方法在茶区茶样分析方法上进行了应用，对我国主要产茶区的10个绿茶样品进行了丙烯酰胺测定。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的检测方法准确性、重现性、稳定性较好，适于绿茶中丙烯酰胺的实际检测。

附图说明

图1为实施例丙烯酰胺标准曲线图；

图2为实施例混标中¹³C₃-丙烯酰胺、丙烯酰胺的MRM质谱图；

图3为实施例绿茶样品¹³C₃-丙烯酰胺、丙烯酰胺的MRM质谱图。

具体实施方法

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，实施例中所用原料均可市购或用常规方法制备。

实施例中丙烯酰胺标准品，纯度＞95％，(ChemService公司，美国)；¹³C₃-丙烯酰胺标准品，纯度＞99％，(ChemService公司，美国)；甲醇、乙腈(色谱纯)、甲酸(色谱纯)、正己烷、硫酸镁(MgSO₄)、氯化钠(NaCl)均购自国药集团化学试剂有限公司。准确称取0.1g丙烯酰胺标准品溶于100mL容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，于-20℃冰箱保存作为储备溶液，配制浓度为1、5、10、50和100ng/mL的丙烯酰胺标准溶液，¹³C₃-丙烯酰胺为内标，浓度为50ng/mL。

实施例中Agilent 6460 Triple Quad LC-MS三重串联四极杆液质联用仪，Agilent Zorbax SB C₁₈柱(150mm×2.1mm，3.5μm)；SPE固相萃取柱Cleanert PCX(60mg，天津博纳艾杰尔有限公司)，利用Mass hunter液质工作站软件(Agilent公司，美国)采集相关数据。

实施例1

(1)称取1g粉碎后的绿茶样品于50mL离心管中，依次加入9mL体积浓度为0.1％甲酸、1mL50ng/mL内标液(¹³C₃-丙烯酰胺溶解于0.1％甲酸中)，混匀，于30℃下水浴振荡20min；然后加入10mL乙腈、4g硫酸镁、1g氯化钠，密封迅速剧烈振荡1min，于5000r/min离心10min，取上清液8ml，在40℃水浴下氮气吹干；取1ml超纯水溶解试管壁上的残余物，经0.45μm的微孔滤膜过滤。

(2)将步骤(1)得到的预处理样品进行上样，对固相萃取柱进行预处理后，收集透过液，经0.22μm膜过滤，待测。

(3)通过HPLC-MS/MS分析检测

色谱条件：流动相为水-乙腈(99∶1，V/V)混合液，体积浓度为99，9％，体积浓度为0.1％的甲酸；流速为200μL/min；进样体积10μL；柱温35C。

质谱条件：离子化方式：ESI离子源；扫描方式：正电离；扫描离子对：丙烯酰胺(m/z 72-55)，¹³C₃-丙烯酰胺(m/z 75.2-58.1)。检测方式：多离子反应监测(MRM)，碰撞能量：8eV，碰撞诱导解离电压：50V。离子源条件：干燥气温度：325C；干燥气流速：5L/min；雾化气压力：45psi；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：3000V。

分别将试样和系列标准品注入HPLC-MS/MS系统，记录丙烯酰胺和¹³C₃-丙烯酰胺峰面积，以丙烯酰胺和¹³C₃-丙烯酰胺的浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标作图，绘制丙烯酰胺标准曲线。由此计算样品中丙烯酰胺的含量。每个处理进行三次重复，取其平均值进行分析，数据用表示。

实施例2

(1)称取1g粉碎后的绿茶样品于50mL离心管中，依次加入7mL体积浓度为0.1％甲酸、0.8mL30ng/mL内标液(¹³C₃-丙烯酰胺溶解于0.1％甲酸中)，混匀，于90℃下水浴振荡10min；然后加入9mL乙腈、5g硫酸镁、0.5g氯化钠，密封迅速剧烈振荡1min，于7000r/min离心7min，取上清液8ml，在90℃水浴下氮气吹干；取1ml超纯水溶解试管壁上的残余物，经0.45μm的微孔滤膜过滤；

(2)将步骤(1)得到的预处理样品进行上样，对固相萃取柱进行预处理后，收集透过液，经0.22μm膜过滤，待测。

(3)通过HPLC-MS/MS分析检测

色谱条件：流动相为水-乙腈(99∶1，V/V)，混合液，体积浓度为99,9％，体积浓度为0.1％的甲酸；流速为200μL/min；进样体积10μL；柱温34C。

质谱条件：离子化方式：ESI离子源；扫描方式：正电离；扫描离子对：丙烯酰胺(m/z 72-55)，¹³C₃-丙烯酰胺(m/z 75.2-58.1)。检测方式：多离子反应监测(MRM)，碰撞能量：8eV，碰撞诱导解离电压：50V。离子源条件：干燥气温度：325C；干燥气流速：5L/min；雾化气压力：45psi；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：3000V。

分别将试样和系列标准品注入HPLC-MS/MS系统，记录丙烯酰胺和¹³C₃-丙烯酰胺峰面积，以丙烯酰胺和¹³C₃-丙烯酰胺的浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标作图，绘制丙烯酰胺标准曲线。由此计算样品中丙烯酰胺的含量。每个处理进行三次重复，取其平均值进行分析，数据用表示。

实施例3

(1)称取1g粉碎后的绿茶样品于50mL离心管中，依次加入11mL体积浓度为0.1％甲酸、1.2mL70ng/mL内标液(¹³C₃-丙烯酰胺溶解于0.1％甲酸中)，混匀，于50℃下水浴振荡60min；然后加入11mL乙腈、3g硫酸镁、1.5g氯化钠，密封迅速剧烈振荡1min，于12000r/min离心4min，取上清液8ml，在50℃水浴下氮气吹干；取1ml超纯水溶解试管壁上的残余物，经0.45μm的微孔滤膜过滤。

(2)将步骤(1)得到的预处理样品进行上样，对固相萃取柱进行预处理后，收集透过液，经0.22μm膜过滤，待测。

(3)通过HPLC-MS/MS分析检测

色谱条件：流动相为水-乙腈(99∶1，V/V)混合液，体积浓度为99,9％，体积浓度为0.1％的甲酸；流速为200μL/min；进样体积10μL；柱温36C。

质谱条件：离子化方式：ESI离子源；扫描方式：正电离；扫描离子对：丙烯酰胺(m/z 72-55)，¹³C₃-丙烯酰胺(m/z 75.2-58.1)。检测方式：多离子反应监测(MRM)，碰撞能量：8eV，碰撞诱导解离电压：50V。离子源条件：干燥气温度：325C；干燥气流速：5L/min；雾化气压力：45psi；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：3000V。

分别将试样和系列标准品注入HPLC-MS/MS系统，记录丙烯酰胺和¹³C₃-丙烯酰胺峰面积，以丙烯酰胺和¹³C₃-丙烯酰胺的浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标作图，绘制丙烯酰胺标准曲线。由此计算样品中丙烯酰胺的含量。每个处理进行三次重复，取其平均值进行分析，数据用表示。

实施例1～3以系列标准溶液进样，记录丙烯酰胺和¹³C₃-丙烯酰胺峰面积，以丙烯酰胺和¹³C₃-丙烯酰胺浓度比对应相应的峰面积比进行线性回归分析，得到丙烯酰胺的标准曲线，回归方程为：y＝1.1219×x+0.02750，R²＝0.9999，丙烯酰胺含量在1～100ng/mL范围呈现良好的线性关系，符合定量要求，如图1所示。丙烯酰胺混标及绿茶样品的MRM质谱图见图2、图3，由图可知，标样和样品中，丙烯酰胺标准品保留时间均为2.83min，内标¹³C₃-丙烯酰胺保留时间均为2.83min，保留时间一致。

应用例1：重现性试验

精密称取5份样品，质量分别是：1.0012、1.0031、1.0055、1.0016、1.0013g，通过样品前处理和进样分析，计算得出5份样品的丙烯酰胺含量分别为26.90、25.67、26.89、28.72、25.07ng/g，平均值为26.65ng/g，RSD＝5.26％(n＝5)，表明该方法重现性较好。

应用例2：基质效应与回收率

(1)回收率试验

向绿茶样品中加入不同浓度的丙烯酰胺标准溶液，设置低、中、高三个加标量为2、50、80ng/mL，按照已确定的样品前处理方法进行提取，采用HPLC-MS/MS法测定丙烯酰胺含量，每个样品重复测定3次，计算加标回收率，结果见表1。由此可知，低、中、高3个浓度水平下的加标回收率均大于70％，相对标准偏差均小于6.0％。

(2)基质效应试验

对照组1设置为以甲醇作为溶剂配制混标；对照组2为取绿茶样品，测定其丙烯酰胺含量；实验组为取绿茶样品，加入不同浓度的丙烯酰胺标准溶液后分析测定，设置丙烯酰胺标准品终浓度分别为2、50、80ng/mL，¹³C₃-丙烯酰胺内标浓度为20ng/mL。以每个样品重复测定3次，计算基质效应，结果见表1。由此可知，低、中、高3个浓度水平下的加标回收率均大于84％，相对标准偏差均小于6.0％，具有准确、可靠的特点，适于茶叶中丙烯酰胺的实际检测。

表1 回收率和基质效应

应用例3：LOD和LOQ

HPLC-MS/MS方法的检测限根据对空白基质的测定确定信噪比，以3倍信噪比计算定性检出限，10倍信噪比计算定量检测限，平行测定3次，取平均值，得出该方法的定性检出限(LOD)为1.0ng/g，定量检出限(LOQ)为10.0ng/g。

应用例4：茶区茶样分析

对全国主要产茶区的绿茶进行抽样检测，发现绿茶中普遍含有丙烯酰胺。表2显示了十种绿茶样品中丙烯酰胺的检测结果，样品中丙烯酰胺含量为5.17～26.65ng/g，平均含量为10.86ng/g，其中样品5、样品6、样品8超过平均水平，各绿茶品种间差异较大。样品8是取自江苏的绿茶样品，其丙烯酰胺检出值相对偏高(26.65ng/g)，比样品4(1.53ng/g)高近17倍，丙烯酰胺的含量存在这么大的差异，原因可能为绿茶加工过程中过热处理所致。

表2 十种绿茶样品中丙烯酰胺含量

从测定结果来看，绿茶中普遍存在丙烯酰胺，个别品种含量较高。为确保茶叶质量安全，须进一步加强对丙烯酰胺生成规律的监测，研究绿茶加工过程中丙烯酰胺减量化技术。

本发明结果表明：丙烯酰胺在1～100ng/mL浓度范围内线性良好，相关系数R²＝0.9999；LOD和LQD分别为1.0ng/g、10.0ng/g；当标准品添加水平为2～80ng/mL时，回收率为71.58～77.11％，基质效应为84.73～95.52％，相对标准偏差(RSD)均小于6.0％，该方法具有准确、可靠的特点，适于茶叶中丙烯酰胺的实际检测。