一种用半粒测定水稻直链淀粉和支链淀粉含量的方法与流程

本发明属于食品检测技术领域，特别涉及一种用半粒测定水稻直链淀粉和支链淀粉含量的方法。

背景技术：

食用稻米胚乳中的最主要成分是淀粉，约为80％。稻米淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，直链淀粉长1，030个葡萄残基，为直链状分子，很少分枝；支链淀粉则是高度分枝的葡萄糖苷链，支链平均长度约为20个葡萄糖残基。20世纪60年代中期始，胚乳中的直链淀粉含量(AC)是评价稻米蒸煮食用品质优劣的最重要指标之一(Juliano等，1965)，直链淀粉含量高，米饭硬而蓬松；反之则软而粘(Radhika等1993，Ong等，1995)。但随育成品种遗传组成的多样化，直链淀粉含量相似(尤其是中高直链淀粉含量)而米饭质地相去甚远的现象日益普遍。80年代中期，Takeda等与Juham合作，对用比色法测定具相似AC品种的米饭质地差异的原因进行了系列研究。他们首先发现，高AC和低AC二类品种，其支链淀粉对碘的亲和性存在差异：低AC品种的支链淀粉与碘的亲和性都很小；而高AC的品种之问，支链淀粉与碘的亲和性存在较大差异。这一结果表明，用碘比色法测得的AC实际上是由二部分组成，即真正的AC以及总分支链淀粉的含量。为了与直链淀粉的真实含量相区别，Takeda等于1987年提出“表观直链淀粉含量(Apparent anrylose content，AAC)”这一新概念，从而 将用碘比色法测得的AC与稻米淀粉中实际的AC区别开来。从化学组成看，AAC实际上由两部分组成，即真正的直链淀粉和部分支链淀粉的长链B。已有研究表明，籼米中的直链、支链淀粉含量和比例对其出饭率、食用品质及贮藏与加工的方式有着决定性的影响。因此，寻求一种能同时测定籼米中直链淀粉和支链淀粉含量的方法，来作为评定大米蒸煮品质的检测指标具有重要意义。

现我国推荐的测定稻米AC值的标准方法有3种，即国际标准ISO 6647-2007《稻米直链淀粉含量测定第2部分常规方法》、国家标准GB/T 15683-2008《大米直链淀粉含量的测定》及农业部标准NY/T 2639-2014《稻米直链淀粉的测定-分光光度法》，这些标准其实测定的还是表观直链淀粉含量。蔡一霞等2006年(中国农业科学，2006，39(6)：1122-1129)用Sephadex G75层析柱分析了稻米中支链淀粉分支链的链长分配，此方法用碱无机试剂纯化淀粉，且是手工过柱洗脱，易造成直支成分的损失以及各收集成分的不稳定性和成分之间的完全分离清晰性。且通常的测定方法均要求样品有一定的量，如，100g糙米经碾精磨粉而成；而在实际田间中间试验小样往往只收了几十粒，甚至几粒，还要留种，且这么少量很难碾精，这很难对样品理化性状进行测试。且直链淀粉和支链淀粉含量之比的获得，通常是用的如旋光法和水解总糖测定法来测定总淀粉含量，然后用总淀粉含量减去直链淀粉含量得到支链淀粉含量，后得到直/支链淀粉含量之比。这些方法不仅要求有一定量(仅总淀粉测定需要的量是2.0g-2.5g,重复两次则需要4.0g-5.0g)，且步骤繁锁，水解法还涉及加热滴定，这些 因素易导致测定不易操作，数据重复性差等。蒋卉等2013(粮食与饲料工业，2013，2：22-25)报道采用双波长测直链淀粉和支链淀粉，一则是没有脱脂，而脂肪对淀粉碘蓝比色有干扰；二是需要在四个波长对样品进行比色，步骤法多，操作繁锁，且也需要一定的样品量。基于如此，因此本发明采用半粒法，即保留下来的具有胚芽部分的半粒可以继续发芽种植；且简化淀粉提取过程，以防止无机(碱)或有机二甲基二砜对淀粉的破坏，用异淀粉酶分离直、支淀粉，用凝胶色谱分离。此凝胶色谱分离中采用了磷酸体系缓冲液和TSK Gel 3000PWxl和4000PWxl串联柱子，而在多糖聚合物的测定中均采用单柱子，串联柱子不仅扩大了多糖聚合物的分子量，从3000PWxl的范围是6万，扩到4000PWxl的70万，且分离效果好。在cereal chemistry 2009((86(5):492-498))中报道用的单柱子Ultrahydrogel 250(waters)，其中直链淀粉和支链淀粉的出峰虽能分开，但直链淀粉出峰还没有走平时出现支链峰，因此出峰面积的积分比较难积准，影响数据重复性。而我们此研究中采用TSK Gel 3000PWxl和4000PWxl串联柱子，结果表明直、支分离和支链淀粉的长、中短链之间效果好，数据重复好，易操作；且测定的是真正的直链淀粉和支链淀粉含量，并非比色法中所测定的表观直链淀粉。

技术实现要素：

本发明提供一种用半粒测定水稻直链淀粉和支链淀粉含量的方法，该方法样品用量少，简化了淀粉纯化步骤，且可以用有胚的半粒米留种，数据稳定，重复性好。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用半粒测定水稻直链淀粉和支链淀粉含量的方法，该方法包括如下步骤：

步骤1：稻米粉制备：取单粒稻谷手工脱壳后用刀片刮去种皮和糊粉层，得到精米，然后将其横切成两个半粒，取没有胚芽部分的半粒用碾磨棒碾磨成精米粉；

步骤2：精米粉脱除脂肪和可溶性糖

称取步骤1得到精米粉与100％色谱纯甲醇混匀并于100℃加热10分钟后于10,000g离心5分钟后收集沉淀物，此步骤重复2-3次，并合并沉淀物；精米粉与甲醇的用量比为0.6mg/1.0ml；

步骤3:糊化淀粉和直、支链分离

步骤4:凝胶渗透色谱仪器参数

采用TSK gel pwxl 3000和pwxl 4000串联双柱，采用0.1mol/L磷酸氢二钠和0.05mol/L磷酸二氢钠为缓冲液，流速为1.0ml/min,柱温箱为40℃和采用示差检测器；

步骤5：根据直链淀粉和支链淀粉的两成分出峰面积之比而直接得到直链淀粉/支链淀粉含量之比。

上述方法包括样品制备，淀粉纯化，淀粉糊化和直、支链酶解分离，凝胶渗透仪分离柱子、流动相和流速、温度的建立及含量的定量积计算。本发明所提出的方法具有样品量少，简便，快速，准确和高效，且能用保留胚芽的半粒留种发芽，能对水稻中间试验小材料的筛选或是遗传研究等 应用均有很好的应用价值。

现有的检测方法中，精米粉脱除脂肪和可溶性糖时采用的试剂是乙醇或水饱和正丁醇溶液，而本发明采用100％色谱纯甲醇，目的是减低损伤淀粉比率，提高脱脂效果；对于样品的前处理，发明人并没有像常规方法那样对样品用NaOH或二甲基亚砜脱蛋白，这样可以避免对淀粉的预糊化或损伤，尽量保持原淀粉特性，从而提高数据重复性。本发明步骤4中选用的色谱柱是TSK gel G3000pwxl和pwxl 4000串联双柱，和磷酸缓冲液为流动相，与其报道的Ultrahydrogel单柱子相比，具有柱效高，直链淀粉和支链淀粉的分离度好，出峰稳定和数据重复性好。

作为优选，糊化的方法是沸水浴5-10分钟或50℃烘箱2-3小时或室温过夜至溶液清澈。

作为优选，醋酸钠溶液的加入量为糊化后得到产物重量的120-130倍。

作为优选，步骤3的具体过程为：取沉淀物加入0.25mol/L NaOH溶液中，沉淀物与NaOH溶液的比例为50mg：1.0ml，糊化完全，混匀后加入适量pH＝4.0的0.5mol/L醋酸钠溶液，再入适量异淀粉酶(酶活大于250U)于40℃反应2hr以上，直至反应完全；然后，沸水加热5分钟，10,000g离心5-10分钟，取上清液；加入适量离子交换树脂AG501-X8，于50℃水浴摇床30min,后16000g离心10分钟，过0.45μm PVDF小柱，保持40℃后进行凝胶渗透色谱进样测定。

本发明采用半粒法，即保留下来的具有胚芽部分的半粒可以继续发芽种植；简化淀粉提取过程，以防止无机(碱)或有机二甲基二砜对淀粉的 破坏，用异淀粉酶分离直支淀粉，结果表明直、支分离效果好，数据重复好。

本发明利用凝胶渗透色谱仪，快速微量简化法测定水稻米粉直链淀粉/支链淀粉含量的比率,克服以往需要的较大量的样品量和手工过分析柱收集或淀粉与非淀粉成分分离纯化过程中预糊化对淀粉的损失，或双波长法测定的非真正的直链淀粉含量，或单柱无法完全分离直链淀粉和支链淀粉。本发明提供了半粒法，且简化淀粉纯化步骤，用异淀粉酶分离直、支淀粉，采用了磷酸缓冲液和TSK Gel PWxl串联双柱。该方法快速高效，数据重复性好,且可以用保留的带有胚芽的半粒发芽种植，对水稻的试验小材料的筛选选育或是水稻品质改良或是水稻品质遗传研究均有很好的应用前景。

附图说明

图1是水稻样本9311的直链和支链淀粉图；

图2是水稻品种泰国香米的直链和支链淀粉图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

一种用半粒测定水稻直链淀粉和支链淀粉含量的方法，具体步骤为：

步骤1:稻米粉的前处理：取单粒稻谷(水稻样本9311)用手工脱壳，糙米用刀片刮去种皮、糊粉层，然后精米横切成两个半粒；取没有胚芽部分的半粒用碾磨棒碾磨成精米粉。

步骤2：精米粉脱除脂肪和可溶性糖

精米粉称样量为100mg入10ml离心管，加入60ml 100％色谱纯甲醇，于沸水浴10分钟，12,000g离心5分钟，倒去悬浮液。沉淀物重复此步骤3次。

步骤3：糊化淀粉和直、支链分离

称20mg沉淀物于2ml离心管后加入0.4ml 0.25mol/L NaOH溶液,50℃烘箱2小时。混匀后加入80μl 1.0mol/L醋酸钠溶液(pH＝4.0)，再加入20μl异淀粉酶(酶活大于250U)于40℃恒温水浴摇床反应2hr。然后，沸水加热5分钟，去异淀粉酶活，10,000g离心5分钟，取上清液；加入0.3g左右离子交换树脂AG501-X8，于50℃水浴摇床30min,后16000g离心10分钟，过0.45μm PVDF小柱，保持40℃后进行步骤4的凝胶渗透色谱进样测定。

步骤4:凝胶渗透色谱仪器参数

采用TSK gel3000PWxl和4000PWxl柱子，采用0.1mol/L磷酸氢二钠和0.05mol/L磷酸二氢钠为缓冲液和0.02％叠氮化钠，流速为1.0ml/min,柱温箱为40℃和示差检测器。

步骤5：根据直链淀粉(第一出峰)面积与支链淀粉的长链(第二出峰) 和支链淀粉的中短链(第三峰)总出峰面积之比，即为直链淀粉含量/支链淀粉含量之比。

图1是水稻样本9311的直链和支链淀粉图，其中第一峰，保留时间在14.65min为直链淀粉；第二和第三峰均为支链淀粉部分，保留时间分别为18.20min和19.8min,分别为支链淀粉的长链和中短链部分。其中重复1的直链淀粉面积为8350，支链淀粉长链峰面积为9600，支链淀粉中短链峰面积为44031，8350/(9600+44031)＝15.6％。重复二中的直链淀粉峰面积为8758，支链淀粉长链和中短链的峰面积分别为9561和42316，8758/(9561+42316)＝16.8％，直/支比率绝对差为1.2％，重复性好。具体见表1。

表1样品9311的直链淀粉及支链淀粉的比例

实施例2：

一种用半粒测定水稻直链淀粉和支链淀粉含量的方法，包括如下步骤：

步骤1:稻米粉的前处理：取单粒稻谷用手工脱壳，糙米用刀片刮去种皮、糊粉层，然后精米横切成两个半粒；取没有胚芽部分的半粒用碾磨棒碾磨成精米粉。

步骤2：精米粉脱除脂肪和可溶性糖

精米粉称样量为50mg入10ml离心管，加入30ml 100％色谱纯甲醇，于沸水浴10分钟，12,000g离心5分钟，倒去悬浮液。沉淀物重复此步骤3次。

步骤3：称10mg沉淀物于2ml离心管后加入0.2ml 0.25mol/L NaOH,50℃烘箱2小时。混匀后加入80μl 0.5mol/L醋酸钠(pH＝4.0)，再加入20μl异淀粉酶(酶活大于250U)于40℃恒温水浴摇床反应2hr。后，沸水加热5分钟，去异淀粉酶活，10,000g离心5分钟，取上清液；加入0.2g左右离子交换树脂AG501-X8，于50℃水浴摇床30min,后16000g离心10分钟，过0.45μm PVDF小柱，保持40℃后直接进样测定。

步骤4:凝胶渗透色谱仪器参数

采用TSK gel3000PWxl和4000PWxl串联柱子，采用0.1mol/L磷酸氢二钠和0.05mol/L磷酸二氢钠为缓冲液和0.02％叠氮化钠，流速为1.0ml/min,柱温箱为40℃和示差检测器。

步骤5：根据直链淀粉(第一出峰)面积与支链淀粉的长链(第二出峰)和支链淀粉的中短链(第三峰)总出峰面积之比，即为直链淀粉含量/支链淀粉含量之比。

图2是水稻品种泰国香米的直链和支链淀粉图，其中第一峰，保留时间在14.00min为直链淀粉；第二和第三峰均为支链淀粉部分，保留时间分别为19.00min和20.8min,分别为支链淀粉的长链和中短链部分。其中重复1的直链淀粉面积为6968，支链淀粉长链峰面积为10872，支链淀粉中短链峰面积为47884，6968/(10872+47884)＝11.9％。重复二中的直链淀 粉峰面积为8054，支链淀粉长链和中短链的峰面积分别为11683和64746，8054/(11683+64746)＝10.5％，直/支比率绝对差为1.4％，重复性好。具体见表2。

表2泰国米的直链淀粉及支链淀粉的比例

最后应该说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照了上述事例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或局部替代，其均应涵盖在本发明的权利要去范围中。