一种饲料可消化碳水化合物总量的仿生消化测定方法与流程

文档序号:11860044阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种饲料可消化碳水化合物总量的仿生消化测定方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)样品的制备:采样,再将采样的饲料样品用植物粉碎机或研钵将样品粉碎至过60目筛,封入样品袋密封存放,做试样备用;

2)制备胃和小肠的缓冲液和模拟消化液及其他试剂;

3)单胃动物仿生消化系统预热:预热时间为60~90min;

4)上样:将单胃动物仿生消化系统中的模拟消化管清洗干净、烘干,并用翻口硅胶塞将其一端塞严;称取步骤2)制备好备用的0.25g~1.00g饲料试样,并加入单胃动物仿生消化系统的模拟消化管中,同时测定饲料试样的干物质含量;

5)胃模拟消化处理:向单胃动物仿生消化系统中胃缓冲液进入的第一根模拟消化管(对照样)中加入10ml去离子水,其他添加分析试样的模拟消化管中分别加入10ml胃模拟消化液;通过单胃动物仿生消化系统控制软件设置胃模拟消化参数,开始进行胃模拟消化处理;

6)小肠模拟消化处理:胃阶段消化结束后,通过模拟消化液加液管向小肠缓冲液进入的第一根模拟消化管中分两次添加6.0ml和1.6ml去离子水,其他添加分析试样的模拟消化管中分别依次添加6.0ml小肠缓冲液和1.6ml小肠模拟消化液;通过单胃动物仿生消化系统控制软件设置小肠模拟消化参数,开始进行小肠模拟消化处理;

7)消化残渣处理:待饲料试样经胃和小肠模拟消化结束后,将玻璃消化管内的消化液,经稀释处理后,通过滤膜过滤,滤液备用;对照组的消化液直接滤膜过滤,备用;

8)采用DNS比色法测定对照样和分析试样中的还原糖含量,并计算得出饲料中的可消化碳水化合物总量。

2.如权利要求1所述饲料可消化碳水化合物总量的仿生消化测定方法,其特征在于,步骤1)中,所述饲料样品为猪饲料、鸡饲料或鸭饲料。

3.如权利要求1或2所述饲料可消化碳水化合物总量的仿生消化测定方法,其特征在于,步骤2)中,所述胃缓冲液的制备方法:称取1~3g氯化钠、0.25~5g氯化钾和1~2g山梨酸钾,放入500mL烧杯中,加入400mL去离子水溶解,并用2mol/L的盐酸(HCL)在39℃~42℃下调节溶液的pH至3.0,冷却后将上述溶液转入500mL容量瓶,并用去离子水定容;

所述胃模拟消化液的制备方法:根据Wirnt R描述的胃蛋白酶活性测定方法,测定胃蛋白酶中胃蛋白酶的活性;然后,根据模拟胃液中胃蛋白酶的浓度为737.5~1550U/ml,称取184.38KU~387.5KU的胃蛋白酶溶解于250ml 、pH2.0~ 3.0的胃缓冲液中(39℃或41°C下标定pH),缓慢搅拌直至溶解,勿在加热板上加热模拟胃液,或配制时过热;临用前配制。

4.如权利要求1或2所述饲料可消化碳水化合物总量的仿生消化测定方法,其特征在于,步骤2)中,所述小肠缓冲液的制备方法:称取0.5~5g无水磷酸氢二钠,2.0~3g无水磷酸二氢钠,PBS最终浓度为0.05M,0.2~2g山梨酸钾,青霉素12万U;放入100mL烧杯中,加入40mL去离子水溶解,并用1mol/L的磷酸或1mol/L的氢氧化钠在39℃~42℃下调节溶液的pH至6.30~6.50;冷却后将上述溶液转入50mL容量瓶,并用去离子水定容;

所述小肠模拟消化液的制备方法:根据Dahlqvist A描述的α-淀粉酶活性测定方法,Wirnt R描述的胰蛋白酶活性测定方法,Wirnt R 描述的糜蛋白酶活性测定方法,测定试剂级淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶中相应消化酶的活性;然后,根据模拟肠液中这三种消化酶的活性,分别称(量)取淀粉酶41.41KU~97.12KU,胰蛋白酶9.54KU~26.32KU,糜蛋白酶1.62KU~9.44KU溶解于17~20ml 去离子水中,并缓慢搅拌直至溶解(肠液酶粉剂提供的消化酶活性为50%以上);勿在加热板上加热,或配制时过热;临用前配制。

5.如权利要求1或2所述饲料可消化碳水化合物总量的仿生消化测定方法,其特征在于,步骤5)和6)中,所述添加分析试样的模拟消化管的数量≥3根。

6.如权利要求5所述饲料可消化碳水化合物总量的仿生消化测定方法,其特征在于,步骤5)和6)中,所述添加分析试样的模拟消化管的数量为4~6根。

7.如权利要求1或2所述饲料可消化碳水化合物总量的仿生消化测定方法,其特征在于 ,步骤5)中,所述胃模拟消化参数为:温度39~42℃;蠕动泵转速188rpm/min,消化时间4~6 h。

8.如权利要求1或2所述饲料可消化碳水化合物总量的仿生消化测定方法,其特征在于,步骤6)中,所述小肠模拟消化参数:温度39~42°C,蠕动泵转速188rpm/min,小肠消化时间为8~16 h。

9.如权利要求1或2所述饲料可消化碳水化合物总量的仿生消化测定方法,其特征在于,步骤6)中,DNS比色法测定试样中的还原糖含量,包括以下步骤:①绘制标准曲线:吸取去离子水4ml于25ml刻度试管中,加入DNS试剂5ml,沸水浴5min,自来水冷却至室温,去离子水定容至25ml(直接加16ml去离子水),制成标准空白样;分别吸取10mg/ml的葡萄糖溶液1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml、6.00ml、和7.00ml,分别用去离子水定容至100ml,配制成浓度为0.10mg/ml~0.70mg/ml的葡萄糖标准溶液;分别吸取上述浓度的葡萄糖标准液各2ml(2个平行),加到25ml刻度试管中,再加入2.0ml去离子水,混匀,加入5.0ml DNS试剂,混匀,沸水浴5min,自来水冷却至室温,加16ml去离子水,摇匀;以标准空白样为对照调零,在540nm处测吸光度OD值;以葡萄糖浓度为Y轴,吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线y=aX+b;

②对照样和分析试样中还原糖测定:取步骤7)制备的消化液5ml于试管中,然后再加入5ml去离子水,进行2倍稀释;再取2ml稀释后的消化液加到25ml刻度试管中,然后再加2ml去离子水,振荡混匀,加入5mlDNS,混匀,沸水浴5min;

自来水冷去至室温,加16ml去离子水,混匀,分光光度计540nm处测OD值,得到对照样的OD(对照)和分析试样的OD(试样)

10.如权利要求1或2所述饲料可消化碳水化合物总量的仿生消化测定方法,其特征在于,步骤8)中,所述可消化碳水化合物总量的计算公式为:

可消化碳水化合物总量(mg/g DM) = 【(a×OD(试样)+b)×2×200-(a×OD(对照)+b)×17.6】/(w×DM)

式中:a为标准曲线回归系数;

b为标准曲线回归常数;

OD测定为分析试样测定管的吸光度值;

OD空白为对照样管的吸光度值;

W为每个重复测定管饲料样品重量;

DM为饲料样品的干物质含量。

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