本发明涉及一种检测方法，特别涉及一种土壤硝态氮检测方法。
背景技术：
土壤硝态氮是植物能直接吸收利用的氮素，是土壤主要氮素形态。土壤硝态氮难以被土壤颗粒吸附，是土壤氮素转化、迁移过程中最活跃的氮素形态，很多研究都表明，土壤硝态氮含量可以反映土壤供氮能力，能够有效指导生产中合理施用氮肥。因此，土壤硝态氮一直是土壤学和环境科学的一个研究热点(巨晓棠，张福锁，中国北方土壤硝态氮的累积及其对环境的影响[J],生态环境,2003,12(1):24-28)。
土壤硝态氮测定的经典方法有酚二磺酸法，可是此方法操作繁琐，检测效率低，难以适用于批量样品检测((鲍士旦.土壤农化分析[M].北京:中国农业出版社,2000.49～50)，(United States Department of Agriculture,Natural Resources Conser-vation Service,National Soil Survey Center.Soil Survey Laboratory Methods Manual(SSIRNo.42Version3.0).Washington,1996.293～297,637～638。))行标提出流动分析仪法所用仪器昂贵，操作技术要求高，在国内其使用不广泛。流动分析仪的校准要求高，易受多种因素影响，其测定结果的准确性和重复性欠佳。((李酉开.紫外分光光度法测定硝酸盐[J].土壤学进展,1983(6):44～56.)(Norman R J,Edberg J C,Stucki J W.Determination of nitrate in soil extract by dual-wavelength ultraviolet spectrophotometry.Soil Sci.Soc.Am.J.,1985,49:1182～1185)(森林土壤氮的测定LY/Y1228-2015[S].北京：中国标准出版社，2016.11～13)(涂成,黄威,陈安磊等.测定土壤硝态氮的紫外分光光度法和镉柱还原法比较[J].土壤,2016,48(1):147-151))。近期有研究提出以紫外分光光度法测定硝态氮，即在波长210nm、275nm处分别测定吸光值ABS，ABS210-f*ABS275的差值通过硝态氮的标准曲线计算硝态氮的含量，此方法较酚二磺酸法简单快捷，紫外分光光度计价格低，在实验室使用较普及。但紫外分光光度法涉及的校正因数f与待测土壤的有机质含量及土壤类型有关，各类土壤有机质含量、土壤性质与校正因数f的定量关系尚待摸索研究。目前有关研究提出的f值是许多土壤测定结果的统计平均值，f值为估测值，其可靠性取决于被测土壤的多少，测定的土壤越多，可靠性越大。不同文献所述f值在2.0-3.60之间，差异较大，由此得出硝态氮含量相差较明显，这难以在实验室以紫外分光光度法检测批量土壤样品硝态氮含量时给予可行的参考指导((朱兆良,文启孝.中国土壤氮素[M].南京:江苏科学技术出版社，1994.1-303.)(易小琳,李酉开,韩琅丰.紫外分光光度法测定土壤硝酸盐[J].土壤通报,1983(6):35-40.)(宋歌，孙波，教剑英，测定土壤硝态氮的紫外分光光度法与其他方法的比较[J].土壤学报，2007，44(2):288-292)(陈岩，土壤硝态氮三种测定方法介绍比较[J].内蒙古水利，2011(5):164-166))。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现要素：
本发明针对上述技术问题，为农林业土壤硝态氮含量测定提供了一种准确、高效的检测方法，在使用紫外分光光度计的条件下，克服了现今硝态氮检测方法需要确定不同类型土壤校正因数f，并在两个不同波长下分别测定才能得出硝态氮含量的问题。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种土壤硝态氮检测方法，包含以下操作步骤：
(1)将预处理后的土壤样品加入硫酸钙溶液，振荡后静置至分层，取上清液进行过滤，即得滤液；
(2)分别等量取步骤(1)所得滤液两份，一份加入氧化剂，在波长210nm处测定吸光值(ABS1)；另一份加入氧化剂和锌粉，加热进行还原反应，冷却后，在波长210nm处测定吸光值(ABS2)，由两次吸光值的差值，即ABS1和ABS2的差值可通过公式Ⅰ计算出土壤硝态氮的含量；其中，两份滤液中加入的氧化剂的量是相同的。
优选的是，步骤(1)中所述的预处理后的土壤样品为土壤样品采集后除去树根、石砾等杂物，研磨过10mm筛，土壤颗粒密封，存放于-16～20℃环境中，预处理后的土壤样品在10天内须完成检测。
优选的是，步骤(1)中硫酸钙溶液的用量为按照每5g～10g预处理后的土壤样品加25ml～50mL硫酸钙溶液。
优选的是，步骤(1)中所述的硫酸钙溶液质量浓度为0.5～2.0g/L。优选的是，步骤(2)中所述的氧化剂为水溶液中电离产生的阳离子完全是H+，阴离子不是NO3-类对硝态氮检测产生干扰的化合物。
优选的是，步骤(2)中所述的氧化剂体积浓度为5％～20％，用量为0.5～3ml。
优选的是，步骤(2)中所述的氧化剂为硫酸或盐酸。
优选的是，步骤(2)中所述的还原反应为在温度60～120℃下反应5～20min。
优选的是，步骤(2)中所述的还原反应为在温度90～110℃下反应10～15min。
优选的是，步骤(2)中加入0.1～0.8g锌粉。步骤(2)中分别等量抽取两份滤液，一份加氧化剂，然后定容至25ml，测定吸光值；另一份加入氧化剂和0.1～0.8g锌粉进行还原反应后，定容至25ml，再进行测定吸光值，两份中加入的氧化剂的量是相等的。
本发明检测结果直接采用以下计算公式计算得出硝态氮含量:
公式Ⅰ：土壤硝态氮含量(mg/kg)＝[(ABS1-ABS2)×k+b]×V1×V2/V3/(m鲜×(1+k水分)；
其中，ABS1：仅加氧化剂未加锌粉待测液在波长210nm处测定的吸光值；ABS2：加入氧化剂和锌粉待测液在波长210nm处测定的吸光值；
k:回归方程(标准曲线)的斜率；
b：回归方程(标准曲线)的截距；
V1：待测液的定容体积(ml)；
V2：浸提液体积(ml)；
V3：浸提液抽取体积(ml)；
k水分：水分系数，k水分＝(m鲜-m干)/m干；
m干：烘干土重量(g)；
m鲜：鲜土重量(g)。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明检测方法无需引入校正因素f，无需考虑土壤类型、土壤有机质等因素对检测结果的影响，测定过程无需调换波长，在210nm一个波长下即可完成土壤硝态氮的测定，检测结果准确可靠，精确度高，操作简单；本发明方法适用于批量样品检测，检测效率高。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。下列各实施例中，本发明方法简称为锌快速还原法。实施例中采用的氧化剂硫酸体积浓度为5％～20％，用量为0.5～3ml；采用的氧化剂盐酸体积浓度为5％～20％，用量为0.5～3ml。
1、土壤样品：来自于中国林科院热带林业实验中心伏波实验场人工林的6个样；
2、酚二磺酸试剂：称取25g苯酚(C6H5OH，分析纯)放入500ml锥形瓶中，加入225ml浓硫酸(H2SO4，分析纯)混匀，瓶口稍盖，于沸水浴中加热6h，即得酚二磺酸试剂；试剂贮于密闭的棕色瓶中，冷却后会析出结晶，使用时需重新加热溶解；
3、硫酸钙：(CaSO4·2H2O，分析纯)，所需各浓度的硫酸钙溶液，加去离子水配制即可；
4、碳酸钙(CaCO3，分析纯)购买于南宁汇鑫化玻仪器有限公司；
5、硝态氮标准溶液：称取105℃烘干2小时后的硝酸钾(KNO3，分析纯)0.722g溶于去离子水，定容至1L，配制出100mg/L硝态氮溶液，抽取50ml,定容100ml，得50mg/L硝态氮溶液；
6、1:1浓氨水：浓氨水(NH3.H2O，分析纯)与去离子水体积比为1：1均匀混合，即得1:1浓氨水；
7、锌粉(分析纯)购买于南宁汇鑫化玻仪器有限公司；
8、浓硫酸(H2SO4，分析纯)，所需各浓度的硫酸，加去离子水配制即可；；
9、浓盐酸(HCl，分析纯)；
10、天平(感量0.01g)；
11、天平(感量0.0001g)；
12、往复振荡机；
13、紫外分光光度计；
14、722分光光度计；
15、水浴锅；
16、瓷蒸发皿；
17、烘箱；
18、去离子水。
上述所提及苯酚(C6H5OH，分析纯)、浓硫酸(H2SO4，分析纯)、浓盐酸(HCl，分析纯)、硫酸钙(CaSO4·2H2O，分析纯)、硝酸钾(KNO3，分析纯)和浓氨水(NH3.H2O，分析纯)皆购买于南宁汇鑫化玻仪器有限公司。
实施例1
锌快速还原法检测土壤样品中的硝态氮
分别称取采集所得的6个样品，各称取200g新鲜土壤样品除去树根、石砾等杂物，分别研磨过10目筛网，过筛后所得颗粒分别存放于聚丙烯塑料袋中密封，并放在冰箱中存放，保持温度为4℃以下，即得6个预处理后的土壤样品。
6个预处理后的土壤样品分别进行如下操作：称取10g预处理后的土壤样品置于100mL有刻度的离心管中，加入2g/L硫酸钙溶液50mL。加盖密封后在180HZ振荡30min后静置至土壤悬液明显分层，倒上清液过滤，即得样品滤液，备用。在另一干净100mL有刻度的离心管中仅加入2g/L硫酸钙溶液50mL，同样在180HZ振荡30min后过滤，即得空白滤液，备用。抽取样品滤液两份，每份为5mL，分别放入比色管中，并标记为A组和B组。A组中的样品滤液加入氧化剂1mL体积浓度为10％的硫酸溶液，加去离子水定容25mL，摇匀待测；同时取上述备用的空白滤液5ml，同样加入氧化剂1mL10％的硫酸溶液，加去离子水定容至25ml作为A组的空白对照。B组中样品滤液加入氧化剂1mL体积浓度为10％的硫酸溶液和0.1g的锌粉，置于100℃烘箱中保温10min，比色管置于自来水中浸泡或冲淋冷却，加去离子水定容至25mL并摇匀，待测；同时取上述备用的空白滤液5ml，同样加入氧化剂1mL体积浓度为10％的硫酸溶液和0.1g的锌粉，置于100℃烘箱中保温10min，自来水中浸泡或冲淋冷却，加去离子水定容至25mL并摇匀作为B组空白对照。以A组空白对照参比调零，A组待测液在210nm处测定吸光值；以B组空白对照参比调零，B组待测液在210nm处测定吸光值，A组测得的吸光值记为ABS1，B组测得的吸光值记为ABS2，由两次吸光值的差值(ABS1-ABS2)通过公式Ⅰ即可计算出土壤硝态氮的含量。上述实验每个样品重复5次检测，取平均值。
实施例2
锌快速还原法检测土壤样品中的硝态氮
分别称取采集所得的6个样品，各称取200g新鲜土壤样品除去树根、石砾等杂物，分别研磨过10目筛网，过筛后所得颗粒分别存放于聚丙烯塑料袋中密封，并放在冰箱中存放，保持温度为0℃以下，即得6个预处理后的土壤样品。
6个预处理后的土壤样品分别进行如下操作：称取5g预处理后的土壤样品置于100mL有刻度的离心管中，加入0.5g/L硫酸钙溶液25ml。加盖密封后在180HZ振荡30min后静置至土壤悬液明显分层，倒上清液过滤，即得样品滤液。另以一份仅加入0.5g/L硫酸钙溶液25mL，同样在180HZ振荡30min后过滤，得空白滤液。抽取样品滤液两份，每份为5mL，分别放入比色管中，并标记为A组和B组。A组中的样品滤液加入氧化剂3mL体积浓度为5％的硫酸溶液，加去离子水定容25mL，摇匀待测；同时取上述备用的空白滤液5ml，同样加入氧化剂3mL体积浓度为5％的硫酸溶液，加去离子水定容至25ml作为A组的空白对照。B组中样品滤液加入氧化剂3mL体积浓度为5％的硫酸溶液和0.8g的锌粉，置于60℃烘箱中保温20min，比色管置于自来水中浸泡或冲淋冷却，加去离子水定容至25mL并摇匀，待测；同时取上述备用的空白滤液5ml，同样加入氧化剂3mL体积浓度为5％的硫酸溶液和0.8g的锌粉，置于60℃烘箱中保温20min，比色管置于自来水中浸泡或冲淋冷却，加去离子水定容至25mL并摇匀作为B组空白对照。以A组空白对照参比调零，A组待测液在210nm处测定吸光值；以B组空白对照参比调零，B组待测液在210nm处测定吸光值，A组测得的吸光值记为ABS1，B组测得的吸光值记为ABS2，由两次吸光值的差值(ABS1-ABS2)通过公式Ⅰ即可计算出土壤硝态氮的含量。上述实验每个样品重复5次检测，取平均值。
实施例3
锌快速还原法检测土壤样品中的硝态氮
分别称取采集所得的6个样品，各称取200g新鲜土壤样品除去树根、石砾等杂物，分别研磨过10目筛网，过筛后所得颗粒分别存放于聚丙烯塑料袋中密封，并放在冰箱中存放，保持温度为-16℃以下，即得6个预处理后的土壤样品。
6个预处理后的土壤样品分别进行如下操作：称取8g预处理后的土壤样品置于100mL有刻度的离心管中，加入1g/L硫酸钙溶液38mL。加盖密封后在180HZ振荡30min后静置至土壤悬液明显分层，倒上清液过滤，即得样品滤液。另以一份仅加入1g/L硫酸钙溶液38mL，同样在180HZ振荡30min后过滤，得空白滤液。抽取样品滤液两份，每份为5mL，分别放入比色管中，并标记为A组和B组。A组中的样品滤液加入氧化剂0.5mL体积浓度为20％的硫酸溶液，加去离子水定容25mL，摇匀待测；同时取上述备用的空白滤液5ml，同样加入氧化剂0.5mL体积浓度为20％的硫酸溶液，加去离子水定容至25ml作为A组的空白对照。B组中样品滤液加入氧化剂0.5mL体积浓度为20％的硫酸溶液和0.8g的锌粉，置于120℃烘箱中保温5min，比色管置于自来水中浸泡或冲淋冷却，加去离子水定容至25mL并摇匀，待测；同时取上述备用的空白滤液5ml，同样加入氧化剂0.5mL体积浓度为20％的硫酸溶液和0.8g的锌粉，置于120℃烘箱中保温5min，比色管置于自来水中浸泡或冲淋冷却,加去离子水定容至25ml作为B组空白对照。以A组空白对照参比调零，A组待测液在210nm处测定吸光值；以B组空白对照参比调零，B组待测液在210nm处测定吸光值，A组测得的吸光值记为ABS1，B组测得的吸光值记为ABS2，由两次吸光值的差值(ABS1-ABS2)通过公式Ⅰ即可计算出土壤硝态氮的含量。上述实验每个样品重复5次检测，取平均值。
实施例4
锌快速还原法检测土壤样品中的硝态氮
分别称取采集所得的6个样品，各称取200g新鲜土壤样品除去树根、石砾等杂物，分别研磨过10目筛网，过筛后所得颗粒分别存放于聚丙烯塑料袋中密封，并放在温度为20℃以下，即得6个预处理后的土壤样品。
6个预处理后的土壤样品分别进行如下操作：称取10g预处理后的土壤样品置于100mL有刻度的离心管中，加入1.3g/L硫酸钙溶液50mL。加盖密封后在180HZ振荡30min后静置至土壤悬液明显分层，倒上清液过滤，即得样品滤液。另以一份仅加入1.3g/L硫酸钙溶液50mL，同样在180HZ振荡30min后过滤，得空白滤液。抽取样品滤液两份，每份为5mL，分别放入比色管中，并标记为A组和B组。A组中的样品滤液加入氧化剂0.8mL体积浓度为15％的盐酸溶液，加去离子水定容25mL，摇匀待测；同时取上述备用的空白滤液5ml，同样加入氧化剂0.8mL体积浓度为15％的盐酸溶液，加去离子水定容至25ml作为A组的空白对照。B组中样品滤液加入氧化剂0.8mL体积浓度为15％的盐酸溶液和0.2g的锌粉，置于90℃烘箱中保温15min，比色管置于自来水中浸泡或冲淋冷却，加去离子水定容至25mL并摇匀，待测；同时取上述备用的空白滤液5ml，同样加入氧化剂0.8mL体积浓度为15％的盐酸溶液和0.2g的锌粉，置于90℃烘箱中保温15min，比色管置于自来水中浸泡或冲淋冷却，加去离子水定容至25ml作为B组空白对照。以A组空白对照参比调零，A组待测液在210nm处测定吸光值；以B组空白对照参比调零，B组待测液在210nm处测定吸光值，A组测得的吸光值记为ABS1，B组测得的吸光值记为ABS2，由两次吸光值的差值(ABS1-ABS2)通过公式Ⅰ即可计算出土壤硝态氮的含量。上述实验每个样品重复5次检测，取平均值。
实施例5
锌快速还原法的标准液制备及测定
抽取硝态氮标准液(50mg/L)，抽取0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL，各加入10％硫酸溶液1mL，然后再分别加去离子水定容至25mL，配制出浓度为0、0.2、0.4、0.8、1.6mg/L的标准溶液系列。以加0mL硝态氮标准液的调零，用1cm比色皿在紫外分光度计上210nm处测定吸光值，建立标准曲线，依此计算样品的硝态氮含量。
实施例6
锌快速还原法的回收率分析
抽取硝态氮标液(50mg/L)2mL(硝态氮加标量为0.1mg)、4mL(硝态氮加标量为0.2mg)分别加入2g/L硫酸钙溶液48mL、46mL，同时作空白1个(即抽取硝态氮标液(50mg/L)0mL，加入2g/L硫酸钙溶液50mL)，加盖密封后在180HZ振荡30min后过滤。两份待测液抽取准备、加热和冷却操作、硝态氮含量计算同实施例1操作；标准溶液配制及测定同实施例5操作。上述实验重复3次。测出的硝态氮含量除以硝态氮加标量，即得出锌快速还原法测硝态氮的回收率。
对比实施例1
酚二磺酸法检测土壤样品中的硝态氮
6个土壤样品分别进行如下操作：土壤样品称取10g放在250mL三角烧瓶中，加入硫酸钙0.5g和去离子水50mL，盖塞，振荡10min。放置至悬液分层后，将悬液的上部清液用干滤纸过滤，所得样品滤液放入干燥洁净的三角烧瓶中，待测。同时做空白对照，即向三角烧瓶中加入硫酸钙0.5g和去离子水50mL，盖塞，振荡10min，静置，将上部清液用干滤纸过滤，所得空白对照滤液放入另外的干燥洁净的三角烧瓶中。吸取待测样品滤液20mL于瓷蒸发皿中，【加碳酸钙0.05g，然后将瓷蒸发皿放在水面上，进行水浴加热，至瓷蒸发皿里面水分蒸干，取下稍冷，迅速加入酚二磺酸试剂1～2mL，使试剂接触到所有的蒸干物，静止10min使酚二磺酸试剂充分作用，然后加去离子水20mL，用玻璃棒搅拌直到蒸干物完全溶解。冷却后缓缓加入1：1氨水，不断搅拌混匀，至溶液呈微碱性时(溶液显黄色并不再加深时)再多加1：1氨水2mL，以保证氨水试剂过量。然后将瓷蒸发皿内溶液全部转入100mL容量瓶中，加去离子水定容，在722分光光度计上用1cm比色皿在波长420nm处测定吸光值ABS3。】空白滤液处理同上述操作，制得空白对照液，调节仪器零点。上述实验每个样重复5次，取平均值。
酚二磺酸法检测硝态氮标准液准备及标准曲线建立：
取50mg/L硝态氮标准液0、1、2、3、4mL于瓷蒸发皿中，水浴蒸干，其余操作与上述“酚二磺酸法检测土壤样品中的硝态氮”步骤中的“【】”内的操作步骤相同，以加0mL硝态氮标准液的调零，用1cm比色皿在紫外分光度计上420nm处测定吸光值，建立标准曲线，依此计算样品的硝态氮含量。
硝态氮含量计算公式如下：土壤硝态氮含量(mg/kg)＝[ABS3×k+b]×V×t/m鲜×(1+k水分)
ABS3：波长420nm处测定的吸光值；
k:回归方程(标准曲线)的斜率；
b：回归方程(标准曲线)的截距；
V：显色液体积体积(mL)；
t：分取倍数，t＝V1/V2；
V1：待测液体积(mL)；
V2：抽取待测液体积(mL)；
k水分：水分系数，k水分＝(m鲜-m干)/m干；
m干：烘干土重量(g)；
m鲜：鲜土重量(g)。
酚二磺酸法回收率分析：
抽取硝态氮标液(50mg/L)2mL(硝态氮加标量为0.1mg)、4mL(硝态氮加标量为0.2mg)加入0.5g的硫酸钙和去离子水48mL、46mL，同时作空白1个，盖塞后，用振荡机振荡10min。放置5min后，用干滤纸过滤，同时做空白。吸取清液20mL于瓷蒸发皿中，其余操作与上述“酚二磺酸法检测土壤样品中的硝态氮”步骤中的“【】”内的操作步骤相同，上述实验每个样重复3次。测出的硝态氮含量除以硝态氮加标量，即得出酚二磺酸法测硝态氮的回收率。
上述实施例1、实施例5、实施例6、对比实施例1中所得数据、含量详见表1、表2。
结果
表1
其中，表1中第1至第9列(第1行-第8行)为实施例1所得数据，第10至第18列(第9行-第16行)为对比实施例1所得数据。
表2
其中，表2中第1至第5列为实施例6所得数据，第6至第9列为对比实施例1所得数据。
由表1、表2中可以看出本发明方法与测定硝态氮含量的经典方法-酚二磺酸法测定数据经方差分析，两种方法所测的硝态氮含量无显著差异，变异系数均小于13％，精密度良好。本发明方法的平均回收率在为92.51％-93.97％，酚二磺酸法的平均回收率在89.50％-91.80％之间。
本发明方法的精密度与酚二碘酸法相当，准确性较酚二磺酸法的略高。这说明酚二磺酸法检测步骤繁琐，易产生误差。待测物水浴蒸干过程用时长，每个工作日的检测量难以达到40个样品以上，检测效率低，不适用于批量样品检测。酚二磺酸法需要使用有刺激性气味的苯酚、氨水，污染环境，危害人员健康。本发明中硝态氮还原环节操作简单快捷，每个工作日能完成检测60～70个样品，效率明显高于酚二磺酸法，更适用于批量样品检测。同时本发明方法不使用刺激性气味试剂，环保安全。
本发明方法简单快捷，加热还原条件易于控制，检测干扰小，操作安全高效，不涉及不确定性校正因数，检测结果准确可靠，尤其适用于批量样品检测，为养分诊断、氮素研究等工作提供可信的数据。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。