一种高敏感性免疫层析检测试纸的制作方法

本发明涉及医学检测
技术领域：
，具体地说是一种高敏感性免疫层析检测试纸。
背景技术：
：应用免疫层析的检测方法日益确立了其在即时检测中的地位。针对不同分析物的免疫层析胶体金试纸条，具有操作简单、检测快速、反应结果直观、可现场检测的优点,现已广泛应用于环境监测、食品检查、医疗检测等领域中，使得它成为一种理想的即时检测或自我诊断手段。如目前使用的检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)的检测工具为血或尿HCG胶体金免疫层析检测试纸，已经成为早孕即时检测诊断的主要方法。胶体金免疫层析技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种免疫标记技术，以该技术制成的免疫层析胶体金试纸条，其不足之处是检测的敏感性较差，当样本中如人血液、尿液、唾液、汗液等中待测物含量较低或微量时尤其明显，如检测尿液样本时结果表现为假阳性，胶体金试纸条的背景干扰信号时有出现，同样用胶体金试纸条检测唾液样本时，常有假阴性结果出现，普通的胶体金试纸条抗唾液的干扰作用差，尤其唾液中存在大量粘蛋白时更明显；又如溶血样本，尤其是大量溶血标本用胶体金试纸条检测时，对检测结果有显著影响。为了提高免疫层析胶体金试纸的检测灵敏性，人们开始大量的探索和研究。有人用大颗粒的胶体金，如大于40nm的胶体金来标记，但较大颗粒胶体金的稳定性差；针对胶体金标记的试纸灵敏度低的问题，有人选择应用双面神颗粒(Janus)、量子点等替代示踪标志物来提高检测的灵敏度，如蒋兴宇等的专利cn104655836A一种免疫层析试纸条的制备及使用，王兵等的专利cn105004869A一种量子点免疫层析试纸条及制备方法，胡敏等专利cn203432969U一种碳量子点试纸条以及吉田晓等的专利cn102667482B有机着色颗粒，含有其的诊断药剂盒以及体外诊断的方法，均比现有免疫层析胶体金试纸条技术的灵敏度高；但这些方法不利之处为背景干扰信号没有解决，另外需要额外的设备(如荧光读数仪等)，且成本高；还有在传统层析试纸中以不同的金颗粒组成双结合垫，或者有单独的二个结合垫，如陈伟等的专利cn102507929A一种信号增强型免疫层析试纸条及制备方法，都能够提高被检测物的灵敏度，但是这些方法的应用也有其局限性，当被检测分析物中存在干扰因素时，如血细胞、唾液中的粘蛋白、细菌等存在的情况下，样本中存在或形成了不希望有的固体成分，其阻断了标记分析物通往检测区的通道，因而降低了检测的灵敏度；还有用酶法、银染增强、磁珠等来提高敏感性，但也是存在操作复杂、成本高的问题；赵福铨等的一种检测样本的试纸条(专利cn204154724U)，因标记垫被样本垫覆盖，使得金标释放速度放缓，使样本中被分析物与金标抗体的浓度比值增大，从而提高试纸条的灵敏度；孙雪娇等一种灵敏度高的试纸条(专利cn203385721U)在样品垫上加样品，使待检物质直接先与T线结合，再在缓冲液加样垫上加样品缓冲液，使胶体金标记颗粒释放，胶体金标记颗粒与结合在T线上的待检物质结合显色，这样一方面可以减少样品的用量，另一方面与传统的试纸条相比，如果样品与检测线上的抗原或抗体结合先一步停留在检测线上，在一定程度上可以提高检测的灵敏度。上述通过改变通路的方法，一定程度上提高了检测的灵敏度，但是起关键或核心作用的示踪标志物胶体金没有改变的话，这种单一改变通道的免疫层析试纸，它的敏感性提高有限。上述情况表明，目前尚未有从示踪标志物、样本垫、结合垫、试纸的结构或材料以及通路等多方面全面优化免疫层析试纸的研究和专利，如能全面优化免疫层析试纸并提高免疫层析试纸的敏感度，将会使免疫层析技术或检测方法得到更广泛的应用。因此，如何寻找一种通过检测试纸的结构以及材料等的结合，提高试纸敏感度，迫在眉睫。技术实现要素：为了解决上述技术缺陷，本发明提供快速、简单、灵敏性高且特异性强的一种高敏感性免疫层析检测试纸。鉴于上述现状，本发明的目的在于提供一种全面优化并提高敏感度的免疫层析试纸。它即是一种快速、简单以及结果准确的免疫层析试纸，又是当一种被检测分析物中存在干扰因素时以及待测物含量较低或微量时能够准确检测，同时适用于不同种类的体液(如血液、尿液、唾液、汗液等)样本的即时免疫诊断层析试纸。本发明一种高敏感性免疫层析检测试纸，包括：底板，以及依次设置在所述底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸样垫，所述样品垫、所述硝酸纤维素膜、所述吸样垫依次搭接，构成一用于待测液流通的通道，即将其称为第一水平通道；其中，还包括一隔膜，所述隔膜一端搭接在所述样品垫上，另一端搭接在所述硝酸纤维素膜上，且所述结合垫一端搭接在所述隔膜上，另一端搭接在所述硝酸纤维素膜上，所述结合垫、所述硝酸纤维素膜、所述吸样垫之间构成另一通道(将其称为第二水平通道)，使得构成双通道模式检测试纸。本发明一种高敏感性免疫层析检测试纸，其优点是：样本通过第一水平通道达到检测线，且不与标记抗体/抗原(缀合物)结合而产生结合物，标记抗体/抗原(缀合物)通过第二水平通道迁移达到检测线，即本发明检测试纸的双通道设计；本发明设计的双通道层析通路以及通过示踪标志物胶体金、纤维素纳米颗粒、乳胶颗粒或胶体金—纤维素纳米颗粒等的选择，A结合垫、B结合垫以及结合垫、硝酸纤维素膜中亲和素、生物素的应用，克服了缀合物与样本中分析物之间的聚集/凝聚问题，同时也提高了示踪标志物的良好标记，增强了检测信号放大的能力，从而体现出本发明的高特异和高敏感性。附图说明图1为本发明一种高敏感性免疫层析检测试纸第一种形式结构示意图；图2、4、6为本发明一种高敏感性免疫层析检测试纸第五、六、七种形式结构示意图；图3为本发明一种高敏感性免疫层析检测试纸第二种形式结构示意图；图5为本发明一种高敏感性免疫层析检测试纸第三种形式结构示意图；图7为本发明一种高敏感性免疫层析检测试纸第四种形式结构示意图；图8为本发明一种高敏感性免疫层析检测试纸第八种形式结构示意图；图9为本发明一种高敏感性免疫层析检测试纸外设置有外壳的结构示意图；其中：1、底板，2、样品垫，3、结合垫，31、B结合垫，32、A结合垫，4、硝酸纤维素膜，41、检测线，42、质控线；5、吸样垫，6、隔膜，7、过滤垫，8、缓冲液垫，9、外壳，10、加样孔，11、加液孔，12、检测视窗，13、吸样垫视窗。具体实施方式本发明检测试纸第一种形式具体结构为：一种高敏感性免疫层析检测试纸，包括底板1，以及依次设置在所述底板1上的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸样垫5，所述样品垫2、所述硝酸纤维素膜4、所述吸样垫5依次搭接，构成一用于待测液流通的通道，即第一水平通道；其中，还包括一隔膜6，所述隔膜6一端搭接在所述样品垫2上，另一端搭接在所述硝酸纤维素膜4上，且所述结合垫3一端搭接在所述隔膜6上，另一端搭接在所述硝酸纤维素膜4上，所述结合垫3、所述硝酸纤维素膜4、所述吸样垫5之间构成另一通道，即第二水平通道，使得构成双通道模式检测试纸。(如图1所示)进一步地，所述样品垫2与所述硝酸纤维素膜4搭接长度为2mm左右。本发明检测试纸第二种形式与第一种形式不同之处在于：所述样品垫2上设置有一过滤垫7，用于过滤被检测物中的干扰物。进一步地，所述过滤垫7过滤的干扰物为细菌、黏蛋白、溶血、血球等，且所述过滤垫7中的结构及材料设计根据所过滤的物质而更改。(如图3所示)本发明检测试纸第三种形式与第一种形式不同之处在于：所述隔膜6上还粘贴有一缓冲液垫8，且所述缓冲液垫8一端搭接在所述隔膜(6)上，另一端搭接在所述结合垫3上，用于加速所述结合垫3内标记物充分溶解、释放到所述硝酸纤维素膜4上。(如图5所示)本发明检测试纸第四种形式与第二种形式不同之处在于：所述隔膜6上还粘贴有一缓冲液垫8，且所述缓冲液垫8一端搭接在所述隔膜(6)上，另一端搭接在所述结合垫3上，用于加速所述结合垫3内标记物充分溶解、释放到所述硝酸纤维素膜4上。(如图7所示)本发明检测试纸第五种、第六种、第七种形式分别与第一种、第二种、第三种检测试纸的不同之处均在于：所述结合垫3包括B结合垫31、A结合垫32，所述B结合垫31一端搭接在所述硝酸纤维素膜4上，所述B结合垫31另一端被所述A结合垫32的一端搭接，且所述A结合垫32的另一端搭接在所述隔膜6上，从而构成双结合垫，用于被检测物微量时的检测，提高捕获能力；(如图2或图4或图6所示)如图6中，所述缓冲液垫8一端搭接在所述隔膜6上，另一端搭接在所述A结合垫32上。本发明检测试纸第八种形式与第四种形式不同之处在于：所述结合垫3包括B结合垫31、A结合垫32，所述B结合垫31一端搭接在所述硝酸纤维素膜4上，所述B结合垫31另一端被所述A结合垫32的一端搭接，且所述A结合垫32的另一端搭接在所述隔膜6上，从而构成双结合垫，用于被检测物微量时的检测，提高捕获能力。(如图8所示)如图8中，所述缓冲液垫8一端搭接在所述隔膜6上，另一端搭接在所述A结合垫32上。进一步地，所述缓冲液垫8与所述隔膜6搭接的长度为所述隔膜6总长度的1/3-1/4，所述缓冲液垫8与所述结合垫3搭接的长度为所述结合垫3总长度的1/4-1/5或者2mm。进一步地，所述硝酸纤维素膜4上包被有检测线41、质控线42；且所述检测线41、所述质控线42上有固定抗原或抗体或其它的配体结合分子，如适配体、核酸等。优选地，所述结合垫3中标记有特异性抗体或抗原的胶体金、纤维素纳米颗粒、乳胶颗粒或胶体金—纤维素纳米颗粒，或/和所述硝酸纤维素膜4上添加有亲和素或/和生物素。优选地，如图9所示：所述检测试纸还包括一外壳9，且所述外壳9包括依次开设的加样孔10、加液孔11、检测视窗12、吸样垫视窗13，且所述加样孔10与所述样品垫2对应，当检测试纸上设置有所述过滤垫7时，所述加样孔10与所述过滤垫7对应，使得样本通过所述加样孔10后进行层析或依次通过所述过滤垫7、所述样品垫2后进行层析；所述加液孔11与所述结合垫3对应，当所述结合垫3分为A结合垫32、B结合垫31时，所述加液孔11与所述A结合垫32对应，当所述结合垫3上设置有缓冲液垫8时，所述加液孔11与所述缓冲液垫8对应，用于缓冲液通过所述缓冲液垫8进入所述结合垫3、或者A结合垫32上后进行层析；所述检测视窗12与所述硝酸纤维素膜4上包被的所述检测线41与所述质控线42对应，用于通过所述检测视窗12观察检测结果；所述吸样垫视窗13与所述吸样垫5对应，用于观察样本是否达到所述吸样垫5。进一步地，在所述外壳9上可设置数字和/或字母编号，以标明所述样品垫2加样本处的所述加样孔10、所述加液孔11、所述检测视窗12和所述吸样垫视窗13等。根据被样本的不同，还可以选择先将样本进行稀释或者与稀释液混合后使用，根据不同种类的样本以及样本中的不同检测物，本发明所述的试纸可选择不同的稀释液、缓冲液配合使用或者样本和缓冲液的混合物，并且应当首先使用。而所述结合垫3包括A、B结合垫31、缓冲液垫8处添加缓冲液位置的加液孔11用于接收缓冲液。所述样品垫2、所述缓冲液垫8、所述过滤垫7为玻璃纤维膜或无纺布；所述吸样垫5由吸水滤纸构成；本发明可根据不同领域的不同用途，进行实际选择本发明检查试纸所需要的所述样品垫2、所述结合垫3、所述硝酸纤维素膜4和所述吸样垫5的尺寸、厚度、密度以及材质。当本发明检测试纸中的结合垫3为一个时，所述结合垫3中标记有特异性抗体或抗原的胶体金或纤维素纳米颗粒或乳胶颗粒或胶体金—纤维素纳米颗粒或添加有亲和素或生物素，其与所述硝酸纤维素膜4上检测线41的标记组合有如下不同方式：1、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的胶体金，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体；2、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的纤维素纳米颗粒，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体；3、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的胶体金-纤维素纳米颗粒，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体；4、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的胶体金+生物素，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体+亲和素；5、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的胶体金+亲和素，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体+生物素；6、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的胶体金+亲和素，硝酸纤维素膜4上标记有另一特异性抗原或抗体的胶体金+亲和素抗体；7、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的胶体金+亲和素抗体，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体+亲和素；8、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的胶体金+生物素，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体+生物素抗体；9、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的胶体金+生物素抗体，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体+生物素；10、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的纤维素纳米颗粒+生物素，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体+亲和素；11、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的纤维素纳米颗粒+亲和素，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体+生物素；12、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的纤维素纳米颗粒+亲和素，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体+亲和素抗体；13、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的纤维素纳米颗粒+亲和素抗体，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体+亲和素；14、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的纤维素纳米颗粒+生物素，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体+生物素抗体；15、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的纤维素纳米颗粒+生物素抗体，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体+生物素；16、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的胶体金-纤维素纳米颗粒+生物素，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体+亲和素；17、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的胶体金-纤维素纳米颗粒+亲和素，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体+生物素；18、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的胶体金-纤维素纳米颗粒+亲和素，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体+亲和素抗体；19、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的胶体金-纤维素纳米颗粒+亲和素抗体，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体+亲和素；20、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的胶体金-纤维素纳米颗粒+生物素，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体+生物素抗体；21、结合垫3上标记有特异性的抗原或抗体的胶体金-纤维素纳米颗粒+生物素抗体，硝酸纤维素膜4上有另一特异性抗原或抗体+生物素；上述不同组合同样适用于乳胶颗粒以及它们之间的相互组合。当本发明检测试纸中的所述结合垫3的结构分为所述A结合垫32、所述B结合垫31时，所述A结合垫32、所述B结合垫31的标记有如下方式：1、A结合垫32上标记有生物素化抗体+纤维素纳米颗粒，B结合垫31上有亲和素+纤维素纳米颗粒。2、B结合垫31上标记有生物素化抗体+纤维素纳米颗粒，A结合垫32上有亲和素+纤维素纳米颗粒。3、A结合垫32上标记有生物素化抗体，B结合垫31上有亲和素+纤维素纳米颗粒。4、B结合垫31上标记有生物素化抗体，A结合垫32上有亲和素+纤维素纳米颗粒。5、A结合垫32上标记有生物素化抗体+胶体金，B结合垫31上有亲和素+纤维素纳米颗粒。6、B结合垫31上标记有生物素化抗体+胶体金，A结合垫32上有亲和素+纤维素纳米颗粒。7、A结合垫32上标记有抗生物素抗体+纤维素纳米颗粒，B结合垫31上有生物素化抗体。8、A结合垫32上标记有抗生物素抗体+纤维素纳米颗粒，B结合垫31上有生物素化抗体+纤维素纳米颗粒。9、A结合垫32上标记有抗生物素抗体+纤维素纳米颗粒，B结合垫31上有生物素化抗体+胶体金。10、B结合垫31上标记有抗生物素抗体+纤维素纳米颗粒，A结合垫32上有生物素化抗体。11、B结合垫31上标记有抗生物素抗体+纤维素纳米颗粒，A结合垫32上有生物素化抗体+纤维素纳米颗粒。12、B结合垫31上标记有抗生物素抗体+纤维素纳米颗粒，A结合垫32上有生物素化抗体+胶体金。13、A结合垫32上标记有双链DNA联结生物素化抗体+纤维素纳米颗粒，B结合垫31上有亲和素+纤维素纳米颗粒。14、B结合垫31上标记有双链DNA联结生物素化抗体+纤维素纳米颗粒，A结合垫32上有亲和素+纤维素纳米颗粒。15、A结合垫32上标记有生物素化抗体+胶体金，B结合垫31上有亲和素+胶体金。16、B结合垫31上标记有生物素化抗体+胶体金，A结合垫32上有亲和素+胶体金。17、A结合垫32上标记有抗生物素抗体+胶体金，B结合垫31上有生物素化抗体。18、B结合垫31上标记有抗生物素抗体+胶体金，A结合垫32上有生物素化抗体。19、A结合垫32上标记有抗生物素抗体+胶体金，B结合垫31上有生物素化抗体+胶体金。20、B结合垫31上标记有抗生物素抗体+胶体金，A结合垫32上有生物素化抗体+胶体金。21、A结合垫32上标记有双链DNA联结生物素化抗体+胶体金，B结合垫31上有亲和素+胶体金。22、B结合垫31上标记有双链DNA联结生物素化抗体+胶体金，A结合垫32上有亲和素+胶体金。上述不同组合同样适用于乳胶颗粒以及它们之间的相互组合。本发明可用于不同种类的样本，如血液、尿液、唾液、汗液、脑脊液等，并可用于测试任何配体的存在，优选本发明中的双通道当设置有所述过滤垫7、所述缓冲液垫8模式进行测试时，采用所述过滤垫7接受样本，通过所述过滤垫7后样本再达到所述样品垫2完成后续层析。为了方便或更准确观察所述吸样垫5有无样本层析，所述吸样垫5上可添加着色剂或着色条带，当所述吸样垫5有样本层析时显色，或通过所述吸样垫视窗13可清晰观察，此时便可在所述缓冲液垫8或所述结合垫3处加入缓冲液，该方法优于5秒-5分钟后再在结合垫3加入缓冲液的方式。本发明一种高敏感性免疫层析检测试纸，是这样工作的：将样本滴加至所述样品垫2(当为设置有所述过滤垫7时，滴加至所述过滤垫7上)，样本通过第一水平通道层析至所述硝酸纤维素膜4上，与所述检测线41上的特异性抗原或抗体结合；当样本层析至所述吸样垫5时，即5秒-5分钟后或所述吸样垫视窗13可清晰观察有样本层析显色时，将缓冲液滴加至所述结合垫3(当分为A结合垫32、B结合垫31时，滴加至A结合垫32上；当结合垫3上设置有缓冲液垫8时，滴加至缓冲液垫8上)上，所述结合垫3(者A结合垫32)内的标记物(缀合物)通过第二水平流动通道层析流动至所述硝酸纤维素膜4上，与所述检测线41上的检测物—特异性抗原或抗体结合后呈肉眼可见的颜色(阳性/阴性)反应，约数秒至数分钟后，所述检测线41、所述质控线42出现肉眼可见的颜色时，即阳性检测结果，表明被检测物样本中含有检测的抗体或抗原，当只有所述质控线42出现肉眼可见的颜色时，即阴性检测结果，表明被检测物样本中无检测的抗体或抗原，当所述质控线42没有出现肉眼可见的颜色时，表明试纸质量控制出现问题，与阳性或阴性检测结果无关。以下根据具体实施例对本发明作进一步说明：实施例一人唾液绒毛膜促性腺激素(HCG)快速免疫诊断试纸的制备(当结合垫为一个时，则结合垫与硝酸纤维膜的标记组合为上述揭示中的第17种模式)一、1、主要原料如下：试剂：氯金酸、柠檬酸三钠、抗α-HCG或β-HCG抗体、纤维素纳米颗粒(AsahiKasei公司产的纤维素CNB纳米颗粒)、BSA、海藻糖、NaCl、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、硼酸、硼砂、吐温-20、TritonX-100、蔗糖、超纯水；耗材：硝酸纤维素膜(NC膜)、8975玻璃纤维、GF-06玻璃纤维、吸水垫、底板、容量瓶、锥形瓶、EP管、枪头。2、制备前的准备2.1胶体金制备称取0.105g柠檬酸三纳于15mlEP管中，加入5ml纯水，混匀至完全溶解即为2％柠檬酸三纳溶液。取40ml纯水于50ml容量瓶中，向容量瓶中加入0.5ml1％氯金酸溶液，用纯水定容至50ml，混匀即为0.01％氯金酸溶液。将50ml0.01％氯金酸溶液倒入100ml锥形瓶中，放在电炉上用3-4档加热至沸腾，用移液枪吸取380μL2％柠檬酸三纳溶液，快速打入到沸腾的氯金酸溶液中，继续加热，即40-55nm胶体金制备完毕。2.2PBS缓冲液配制：称取Na2HPO4·12H2O1.615-2g，NaH2PO4·2H2O0.225-5g，NaCl4.0-5.0g于烧杯中，加入400ml超纯水溶解定容至500ml，0.22μm滤膜过滤后备用。3、最佳pH确定：分别取1mL胶体金于6个1.5mLEP管中，向每管分别加入0.2MK2CO31μL、2μL、3μL、5μL、7μL、10μL，对应pH分别约为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，向每管分别加入150-200μL0.1mg/mL抗体溶液，混匀，37度静置20min，向每管分别加入100-130μL10％NaCl溶液，混匀，静置观察颜色变化，0.2MK2CO3加入量为1-3μL的EP管中胶体金颜色仍为紫红色，其他管变为蓝色，最适pH为7.0-8.0。4、最小抗体标记量确定：取4支EP管，分别取1mL胶体金加入各管中，再向每管分别加入K2CO32-4μL，混匀，加入30μL(3μg)、50μL(5μg)、70μL(7μg)、100μL(10μg)的0.08-0.1mg/ml的抗体溶液，混匀，37℃静置20min，向每管加入10％NaCl溶液，混匀，静置观察颜色变化，抗体加入量为7-10μg的EP管中胶体金颜色未发生明显变化为紫红色，抗体加入量为3、5μg的EP管中胶体金变蓝，说明1ml胶体金的最小抗体加入量为5-8μg。5、溶液配制0.2M硼酸溶液配制：称取硼酸12.37g于烧杯中，加入800ml超纯水溶解后定容至1L，0.22μm滤膜过滤后备用。0.05M硼砂溶液配制：称取硼砂19.07g于烧杯中，加入800ml超纯水溶解后定容至1L，0.22μm滤膜过滤后备用。10mMpH8.0硼酸-硼砂缓冲液配制：分别取3ml0.05M硼砂溶液、7ml0.2M硼酸溶液于烧杯中，加入190ml超纯水，混匀备用。10mMpH8.4硼酸-硼砂缓冲液配制：分别取4.5ml0.05M硼砂溶液、5.5ml0.2M硼酸溶液于烧杯中，加入190ml超纯水，混匀备用。6、制备方法①、样品垫2的制备：配制样本液：分别称取0.9g±0.05gNaCl、0.2g±0.05过氧化脲于100ml烧杯中，加入70ml10mMpH8.4硼酸盐缓冲液溶解，分别加入5ml马血清、1ml吐温-20及1mlTritonX-100，混匀，定容至100ml，0.22μm滤膜过滤后备用；再将经剪裁成0.7cm和3.2cm宽长条后的玻璃纤维膜置于样本液中，室温浸泡4h，37℃烘干，干燥皿中保存备用。②、结合垫3的制备：步骤一、配制结合垫3处理液：称取0.1g±0.05gBSA，0.5g±0.05g海藻糖于100ml烧杯中，加入70ml10mMpH8.0硼酸盐缓冲液溶解，加入0.3ml吐温-20，混匀，定容至100ml，0.22μm滤膜过滤后备用；步骤二、金标抗体的制备：取1mL40-55nm胶体金于EP管中，加入2μL0.2MK2CO3溶液，混匀，加入70μL0.08-0.1mg/mlβ-HCG抗体溶液，混匀，37℃静置20min，加入100μL10％BSA溶液(终浓度1％)，混匀，37℃放置1.5h，4℃，12000g离心20min，弃上清，加入1mlPBS复溶，4℃，12000g离心20min，弃上清，加入100μL复溶液复溶，4℃保存备用；步骤三、CNB纳米标记抗体制备：取已超声的0.1％CNB纳米颗粒，先取5ml的离心管，依次加入20-30mM,9.0pH硼酸盐600-800ul及1mg/ml的β-hCG抗体500-600ul，最后分别加入备用的超声纳米材料300ul，混合均匀。37℃孵育2h，每隔10分钟取出混匀片刻。孵育完成后，向离心管中加入2％小鼠血清封闭液(或0.5％CNB颗粒封闭液)，均为6-8ml。37℃封闭2h，每隔10分钟取出混合片刻，封闭结束后离心处理。14000g离心15-25min，尽量移除上清，沉淀用30-50mM,pH9-10.0硼酸盐溶解并恢复体积，混合均匀。沉淀用保存液、硼酸盐缓冲液，海藻糖各300ul溶解，置于4℃保存。再将结合垫3原料裁成0.7cm宽的长条后置于结合垫32处理液中室温浸泡4h，37℃烘干，再用划膜喷金机将金标抗体-CNB纳米标记抗体+亲和素(1mg/ml/)按照12μL/cm的量喷于结合垫3上，37度烘干后干燥皿中保存备用。③、硝酸纤维素膜4包被：步骤一、配制包被缓冲液：称取3g海藻糖于烧杯中，加入80-100mlPBS溶解后加入3-5ml甲醇，混匀，定容至100ml，0.22μm滤膜过滤后备用；步骤二、生物素抗体制备：用移液枪取а-HCG抗体约100μL于EP管中；从-20度取出生物素溶液复溶，20mg/ml分别取1μL生物素溶液加入到а-HCG抗体溶液中，混匀(生物素：а-HCG抗体≈20:1)，室温放置1h转入透析袋中，用PBS4℃透析过夜；从透析袋中取出生物素-抗体，4℃保存备用。步骤三、包被检测线41：用包被缓冲液将步骤二制备的生物素抗体稀释至0.8-1.3mg/ml，按0.9-1.5μL/cm的量划在所述硝酸纤维素膜4上，37℃烘干后干燥皿中保存备用。包被质控线42：用包被缓冲液将羊抗鼠多克隆抗体稀释至1.2-1.5mg/ml，按0.7-1.4μL/cm的量划在所述硝酸纤维素膜4上，37℃烘干后干燥皿中保存备用；7、试纸的制备：在温度20-30℃、湿度小于30-40％的干燥室内，取底板1，将已包被的所述硝酸纤维素膜4放置在底板1的中部粘贴；在所述硝酸纤维素膜4一侧粘贴所述吸样垫5，且所述吸样垫5一侧与所述硝酸纤维素膜4搭接，另一侧边缘与所述底板1平齐，所述硝酸纤维素膜4另一侧与所述样品垫2搭接，使得待测样本依次通过所述样品垫2、所述硝酸纤维素膜4、所述吸样垫5形成第一水平流动通道；将所述隔膜6两端分别搭接在所述样品垫2、所述硝酸纤维素膜4上方，所述结合垫3两端分别搭接在所述隔膜6、所述硝酸纤维素膜4上方，检测过程中缓冲液依次通过所述结合垫3、所述硝酸纤维素膜4、所述吸样垫5形成第二水平流动通道，最后用裁剪机将制备的试纸剪切成4mm宽的试纸条，切好的试纸条可装入塑料卡或棒(笔)内，形成快速诊断试纸卡或棒(笔)。8、试纸测试及结果判断将试纸条放入待测液(使加样孔10浸没在样本液面下)中停留5s，取出平放在台面上，当所述吸样垫5的颜色改变后，取50μLPBS缓冲液滴在缓冲液垫上，5min后读取结果，30min内有效。结果判断：当出现二条红色条带，一条位于检测线41、另一条位于质控线42，表明已怀孕；当出现一条红色条带，仅位于质控线42，表明没有怀孕；当5-10分钟时在质控线42无红色条带出现，表明不正确的操作过程或者试纸条已变质损坏，需要用新的试纸条正确操作和/或重新测试。二，对上述制备的人唾液绒毛膜促性腺激素(HCG)试纸的灵敏度进行测试1、唾液采集：用唾液采集棒采集唾液后放入唾液稀释液中，将采集棒两面分别在装有唾液稀释液的管壁上摩擦5-6次即可。2、加标唾液：取98μL唾液于微孔中，加入2.5μL1IU/ml的HCG标准品即得加标25mIU/ml的唾液；分别取98μL、95μL唾液于微孔中，加入2μL、5μL100mIU/ml的HCG标准品即得加标2mIU/ml、5mIU/ml的唾液；3、测试：将双通道试纸条平放桌面上，取50μL唾液逐滴点在样品通道的样品垫2垫上，室温静置1-5min，吸样垫5有颜色变化后，再取50μLPBS缓冲液逐滴点在试剂通道的缓冲液垫上，室温静置5min，观察结果，唾液灵敏度可达到2mIU/ml。重复测试10次(如表1)。表1人唾液绒毛膜促性腺激素试纸条灵敏度测试注：“+++”表示明显可见，“++”表示可见，“+”表示微弱可见，“—”表示不可见。(表1中，C线表示质控线42，T线表示检测线41)三、对上述制备的人唾液绒毛膜促性腺激素(HCG)试纸的37℃稳定性进行测试样品稀释液为10mM,pH7.4PBS，1％BSA，0miu/mlhCG标准品，25miu/mlhCG标准品。从干燥器中取6支试纸条，备用。准备6份检测样品(0miu/mlhCG标准品；25miu/mlhCG标准品)，试纸条测试15min。测试结果如表2所示：表2人唾液绒毛膜促性腺激素试纸条37℃稳定性测试注：“+++”表示明显可见。(表2中，C线表示质控线42，T线表示检测线41)结果显示信号正常，没有假阳性，试纸条稳定性良好。四、对上述制备的人唾液绒毛膜促性腺激素(HCG)试纸的特异性进行测试分别选取以下试剂：hCG，A液：0miu/mlhCG，10mMPBS,pH7.4，1％BSA；hCG，B液：25miu/mlhCG，10mMPBS,pH7.4，1％BSA；hLH，A液：0miu/mlhCG，500miu/mlLH，10mMPBS,pH7.4，1％BSA；hLH，B液：25miu/mlhCG，500miu/mlLH，10mMPBS,pH7.4，1％BSA；hFSH，A液：0miu/mlhCG，1000miu/mlFSH，10mMPBS,pH7.4，1％BSA；hFSH，B液：25miu/mlhCG，1000miu/mlFSH，10mMPBS,pH7.4，1％BSA；hTSH，A液：0miu/mlhCG，1000uiu/mlTSH，10mMPBS,pH7.4，1％BSA；hTSH，B液：25miu/mlhCG，1000uiu/mlTSH，10mMPBS,pH7.4，1％BSA。从干燥器中取8支试纸条，备用。准备4组AB液检测样品，试纸条测试15min(国家标准：测试A液T线不显色；测试B液T线显色。)，测试结果如表3、表4所示：表3人唾液绒毛膜促性腺激素试纸条阴性特异性测试注：“+++”表示明显可见，“—”表示不可见。表4人唾液绒毛膜促性腺激素试纸条阳性特异性测试注：“+++”表示明显可见。(表3、4中，C线表示质控线42，T线表示检测线41)测试结果全部符合国标要求，特异性好，即本发明试纸条测试hCG与LH/FSH/TSH均无交叉。重复三次结果一致。实施例二：双结合垫中亲和素-生物素体系时的信号放大测试为对本发明试纸使用结合垫(结构上分为A结合垫和B结合垫)的信号放大测试，方法参照前述实施例一，试剂来源：①100nm胶体金(NanoComposix,LN:lXW0093),②1﹪R2CNB(纤维素纳米颗粒AsahiKasei,LN130212-R2-1),③NHS-PE4-Biotin(Thermo-scientific,LN05192370),④streptaridin(Thermo-scientific,LNOE185707),⑤ESE读数仪，型号ESLF34-MB-4501。测试样本为用lXPBS,1％BSA配制的不同浓度HCG标准品。测试时结合垫分成不同的组合，如下表:表5A为不同的结合垫的组合不同的结合垫组合的信号放大测试结果如下(表5B、表5C)：表5B系统比较不同的结合垫组合的信号放大作用表5C平均T线峰值的摘要表结论：组别①即A结合垫(CNB+生物素抗体)+B结合垫(CNB+亲和素)的组合灵敏性最高，且在HCG浓度0-0.5MIU/ml之间分辨信号最好。实施例三：人唾液HCG的临床实验应用实施例一制备的人唾液绒毛膜促性腺激素(HCG)免疫层析试纸、进行医院临床检测试验，对收集的临床唾液样本使用本试纸条按照使用方法进行检测，以医院临床血液检查结果进行对照，医院血检结果显示50份样本中有5份样本的血HCG值小于1.2mIU/ml，诊断为未怀孕，为阴性样本，其它45份样本的血HCG值大于5mIU/ml，诊断为怀孕，为阳性样本；将该50份样本的唾液分别用本试纸条检测，试纸条检出的5份阴性样本与医院临床结果一致且未出现假阳性，试纸条检出的其它45份样本均为阳性与医院临床结果一致且未出现假阴性，HCG线符合率100％，试纸条临床测试见下表6。表6试纸条临床测试结果注：“-”表示不可见，“+++”表示明显可见、“++”表示可见“+”表示微弱可见。(表6中，C线表示质控线42，T线表示检测线41)实施例四：人唾液乙型肝炎标志物的检测(制备一个结合垫的第八种形式的检测试纸)将待检测的各种不同浓度的乙型肝炎标志物混匀于正常人唾液中，本实施例不仅成功检测到乙型肝炎标志物，而且敏感性高，其中测得的最低浓度为乙肝表面抗原HbsAg为1ng/ml；表面抗体HbsAb为10miu/ml；e抗原HbeAg为1NCU/ml；e抗体HbeAb为2NCU/ml；核心抗体HbcAb为1NCU/ml。同时，与酶联免疫吸附法(Elisa)比较，检测上述样本，二者阳性结果如下表：本发明ElisaHbsAg3335HbeAg67HbsAb1515HbeAb1112HbcAb2930从上表中可见，二者检测结果基本相同。所述的A结合垫(32)、所述B结合垫(31)或所述结合垫(3)、所述硝酸纤维素膜(4)中应用亲和素或生物素。上文中，示踪标志物选择性应用胶体金、纤维素纳米颗粒、乳胶颗粒或胶体金—纤维素纳米颗粒等。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3