全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂以及检测方法与流程

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本发明涉及检测试剂技术领域，尤其是涉及一种全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂。本发明还涉及一种全血中血清淀粉样蛋白A定量检测方法。

背景技术：

血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A protein，SAA)是一种急性时相反应蛋白，可在炎症或疾病感染期的48～72h内迅速升高，并升高至最初浓度的1000倍左右，且在疾病恢复期迅速下降(Urieli Shoval S，et,al.Expression and function of serum amyloid A，a major acutephase protein，in normal and disease states[J].Curr Opin Hematol，2000，7(1):64-69.)。感染性疾病中，SAA和CRP联合检测有助于鉴别细菌感染和病毒感染(SAA在病毒和细菌感染中均升高，而病毒感染中CRP几乎不升高或升高不明显)。此外，监测SAA/CRP比值比单独检测SAA或CRP具有更大的应用价值。SAA水平还与肿瘤、淀粉样变性疾病、冠心病、排斥反应(Muller T，et al.Prospective analysis of 10 different parameters of acute renal allograft rejection[J].Transplant Proc，1992，24(6):2731-2734.)等疾病(陈长强，等.血清淀粉样蛋白A在疾病应用中的研究进展[J].检验医学，2012，27(9):776-779.)密切相关，为临床诊断提供更好的参考信息。

近年来，随着对SAA临床意义的深入研究，其在临床中的应用范围越来越广泛。目前，用于临床上检测SAA的方法主要有胶乳增强免疫比浊法、放射性免疫测定法(RIA)、免疫速率散射比浊法、微球捕获酶免疫法(MEIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。这些方法均以血清或血浆为检测样本，均需对全血进行预先分离红细胞再进行测试，需要专门的分离装置(如离心机等)，增加操作步骤，费时费力，同时加大了样本需求量，对于儿童和新生儿以及大面积烧伤患者等，采足检测需求量的血样一直是个难题。目前还没有能够用全血检测SAA的试剂盒或检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂，它具有使用的检测样本可以为末梢血等全血，可以同时满足灵敏度高和线性范围宽的要求，具有良好的抗干扰性、准确度及精密度，能够满足临床检验要求的特点。本发明还公开了一种全血中血清淀粉样蛋白A定量检测方法。

本发明所采用的第一个技术方案是：

全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂，包括试剂R1、试剂R2，

所述试剂R1包括：质量百分比为0.10％～2.00％的破胞组分，pH为6.0-8.0、浓度为10-100mmol/L的缓冲液，质量百分比为0.01％-3.00％的表面活性剂，质量百分比为0.10％-3.00％的电解质，质量百分比为0.01％-2.00％的防腐剂，质量百分比为0.01％-4.00％的反应促进剂，质量百分比为0.01％-3.00％的稳定剂；

所述试剂R2包括：质量百分比为0.10％-0.80％的胶乳颗粒，质量百分比为0.01％-3.00％的表面活性剂，质量百分比为0.10％-3.00％的电解质，质量百分比为0.01％-2.00％防腐剂，质量百分比为0.02％-10.00％的稳定剂，pH为6.0-8.0、浓度为10-100mmol/L的缓冲液；以及

该破胞组分用以去除干扰测定的血红细胞，其中不分离血细胞，使用原样全血；

该胶乳颗粒包被有抗人SAA抗体，其粒径为50-300nm。

所述破胞组分为聚乙二醇辛基苯基醚、脂肪酸盐、硫酸酯盐、磷酸酯盐、聚山梨酯、烷基苯磺酸钠中的一种。

所述缓冲液为甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸盐缓冲液中的一种。

所述表面活性剂为非离子型表面活性剂，为Tween20、Tween80、Span20、Triton X-100中的至少一种。

所述电解质为钠离子、钾离子、钙离子、镁离子中的至少一种。

所述防腐剂为叠氮钠、山梨酸盐类、苯甲酸及其盐类、亚硝酸钠、庆大霉素中的至少一种。

所述反应促进剂为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇8000、聚乙二醇6000中的至少一种。

所述稳定剂为牛血清蛋白、明胶、乙二醇、乳糖、HEDTA、蔗糖中的至少一种。

本发明所采用的第二个技术方案是：

全血中血清淀粉样蛋白A定量检测方法，

所述检测方法采用的检测仪器为：特定蛋白仪；

分析方法为：两点终点法；

反应方向为：上升反应；

校准方式为：Spline；

测定波长为：546nm；

测定温度为：37℃；

样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl；

步骤为：8μl样本和250μl试剂R1混匀后于37℃孵育3-5min，随即加入50μl试剂R2，读取第1读数点吸光度A1，混匀后37℃孵育5min，读取第2读数点吸光度A2，计算A2-A1差值，根据校准曲线计算所得值及相应红细胞压积，得出样本中血清淀粉样蛋白A含量。

本发明所具有的优点是：

1、样本需求量少：采用全血样本，减少用量，省去分离步骤，省时省力，更适合采血困难患者。

2、线性范围宽：为5-500mg/L，健康人参考范围为≤10mg/L，基本满足临床需要。

3、检测灵敏度高：试剂缓冲液、界面活性剂等成分的配比提高了反应的灵敏度。

4、准确度高：与同品牌同方法学血清SAA检测试剂的相关性达到0.9978，且同品牌同方法学血清SAA检测试剂与进口试剂的相关性达到0.9988，基本可替代市面上现有的血清SAA检测试剂或检测方法。

5、试剂稳定：试剂各成分配比优化，试剂在2-8℃密闭条件下可稳定18个月。

即，本发明的全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂以及检测方法使用的检测样本可以为末梢血等全血，可以同时满足灵敏度高和线性范围宽的要求，具有良好的抗干扰性、准确度及精密度，能够满足临床检验要求。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明：

图1是本发明的全血中血清淀粉样蛋白A检测试剂的操作步骤示意图；

图2是本发明的全血SAA试剂线性范围测定；

图3是本发明全血SAA试剂和Purebio血清SAA试剂相关性；

图4是Purebio血清SAA试剂和国际知名品牌对比试剂/方法相关性；

图5-1、图5-2、图5-3分别是本发明全血SAA试剂对胆红素、脂肪乳、类风湿因子的抗干扰性试验结果。

具体实施方式

实施例1

全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂，包括试剂R1、试剂R2。

具体的讲：

试剂R1包括：破胞组分、缓冲液、表面活性剂、电解质、防腐剂、反应促进剂、稳定剂。其中：破胞组分为质量百分比为0.10％的脂肪酸盐，缓冲液为pH值为6.0、浓度为10mmol/L的甘氨酸缓冲液，表面活性剂为质量百分比为0.01％的Tween20，电解质为质量百分比为3.00％的钠盐，防腐剂为质量百分比为0.01％的叠氮钠，反应促进剂为质量百分比为0.01％的聚乙二醇2000，稳定剂为质量百分比为0.01％的牛血清蛋白。

试剂R2包括：胶乳颗粒、缓冲液、表面活性剂、电解质、防腐剂、稳定剂。其中：胶乳颗粒的百分含量为0.10％、包被有SAA抗体、粒径大小为50nm，缓冲液为pH值为6.0、浓度为10mmol/L的甘氨酸缓冲液，表面活性剂为质量百分比为0.01％的Tween20，电解质为质量百分比为3.00％的钠盐，防腐剂为质量百分比为0.01％的叠氮钠，稳定剂为质量百分比为0.20％的牛血清蛋白。

见图1所示，采用前述全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂进行血清淀粉样蛋白A检测的方法为：

所用检测仪器为：特定蛋白仪

分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：Spline；测定波长：546nm；测定温度：37℃；样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl。

方法步骤：8μl样本和250μl试剂R1混匀后于37℃孵育3min，随即加入50μl试剂R2，读取第1读数点吸光度A1，混匀后37℃孵育5min，读取第2读数点吸光度A2。计算A2-A1差值，根据校准曲线计算所得值以及相应红细胞压积，得出样本中血清淀粉样蛋白A含量。

实施例2

全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂，包括试剂R1、试剂R2。具体的讲：

试剂R1包括：破胞组分、缓冲液、表面活性剂、电解质、防腐剂、反应促进剂、稳定剂。其中：破胞组分为质量百分比为2.00％的硫酸酯盐，缓冲液为pH值为8.0、浓度为100mmol/L的Tris缓冲液，表面活性剂为质量百分比为3.00％的Tween80，电解质为质量百分比为0.10％的钾盐，防腐剂为质量百分比为2.00％的山梨酸盐类，反应促进剂为质量百分比为4.00％的聚乙二醇4000，稳定剂为质量百分比为3.00％的明胶。

试剂R2包括：胶乳颗粒、缓冲液、表面活性剂、电解质、防腐剂、稳定剂。其中：胶乳颗粒的百分含量为0.80％、包被有SAA抗体、粒径大小为300nm，缓冲液为pH值为8.0、浓度为100mmol/L的Tris缓冲液，表面活性剂为质量百分比为3.00％的Tween80，电解质为质量百分比为0.10％的钾盐，防腐剂为质量百分比为2.00％的山梨酸盐类，稳定剂为质量百分比为10.00％的明胶。

见图1所示，采用前述全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂进行血清淀粉样蛋白A检测的方法为：

所用检测仪器为：特定蛋白仪

分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：Spline；测定波长：546nm；测定温度：37℃；样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl。

方法步骤：8μl样本和250μl试剂R1混匀后于37℃孵育4min，随即加入50μl试剂R2，读取第1读数点吸光度A1，混匀后37℃孵育5min，读取第2读数点吸光度A2。计算A2-A1差值，根据校准曲线计算所得值以及相应红细胞压积，得出样本中血清淀粉样蛋白A含量。

实施例3

全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂，包括试剂R1、试剂R2。具体的讲：

试剂R1包括：破胞组分、缓冲液、表面活性剂、电解质、防腐剂、反应促进剂、稳定剂。其中：破胞组分为质量百分比为0.50％的磷酸酯盐，缓冲液为pH值为7.0、浓度为50mmol/L的磷酸缓冲液，表面活性剂为质量百分比为1.00％的Span20，电解质为质量百分比为2.00％的钙盐，防腐剂为质量百分比为0.05％的苯甲酸及其盐类，反应促进剂为质量百分比为2.00％的聚乙二醇8000，稳定剂为质量百分比为0.10％的乙醇。

试剂R2包括：胶乳颗粒、缓冲液、表面活性剂、电解质、防腐剂、稳定剂。其中：胶乳颗粒的百分含量为0.20％、包被有SAA抗体、粒径大小为100nm，缓冲液为pH值为7.0、浓度为50mmol/L的磷酸缓冲液，表面活性剂为质量百分比为1.00％的Span20，电解质为质量百分比为2.00％的钙盐，防腐剂为质量百分比为0.05％的苯甲酸及其盐类，稳定剂为质量百分比为0.10％的乙醇。

见图1所示，采用前述全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂进行血清淀粉样蛋白A检测的方法为：

所用检测仪器为：特定蛋白仪

分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：Spline；测定波长：546nm；测定温度：37℃；样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl。

方法步骤：8μl样本和250μl试剂R1混匀后于37℃孵育5min，随即加入50μl试剂R2，读取第1读数点吸光度A1，混匀后37℃孵育5min，读取第2读数点吸光度A2。计算A2-A1差值，根据校准曲线计算所得值以及相应红细胞压积，得出样本中血清淀粉样蛋白A含量。

实施例4

全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂，包括试剂R1、试剂R2。具体的讲：

试剂R1包括：破胞组分、缓冲液、表面活性剂、电解质、防腐剂、反应促进剂、稳定剂。其中：破胞组分为质量百分比为1.00％的烷基苯磺酸钠，缓冲液为pH值为6.5、浓度为20mmol/L的硼酸盐缓冲液，表面活性剂为质量百分比为2.00％的Triton X-100，电解质为质量百分比为1.00％的镁盐，防腐剂为质量百分比为1.00％的亚硝酸钠，反应促进剂为质量百分比为1.00％的聚乙二醇6000，稳定剂为质量百分比为1.00％的乳糖。

试剂R2包括：胶乳颗粒、缓冲液、表面活性剂、电解质、防腐剂、稳定剂。其中：胶乳颗粒的百分含量为0.30％、包被有SAA抗体、粒径大小为150nm，缓冲液为pH值为6.5、浓度为20mmol/L的硼酸盐缓冲液，表面活性剂为质量百分比为2.00％的Triton X-100，电解质为质量百分比为1.00％的镁盐，防腐剂为质量百分比为1.00％的亚硝酸钠，稳定剂为质量百分比为1.00％的乳糖。

见图1所示，采用前述全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂进行血清淀粉样蛋白A检测的方法为：

所用检测仪器为：特定蛋白仪

分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：Spline；测定波长：546nm；测定温度：37℃；样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl。

实施例5

全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂，包括试剂R1、试剂R2。具体的讲：

试剂R1包括：破胞组分、缓冲液、表面活性剂、电解质、防腐剂、反应促进剂、稳定剂。其中：破胞组分为质量百分比为1.50％的聚乙二醇辛基苯基醚，缓冲液为pH值为7.5、浓度为30mmol/L的甘氨酸缓冲液，表面活性剂为质量百分比各为1.50％的Tween20和Tween80，电解质为质量百分比各为0.50％的钠盐和钾盐，防腐剂为质量百分比为1.50％的庆大霉素，反应促进剂为质量百分比各为1.00％的聚乙二醇2000和聚乙二醇4000，稳定剂为质量百分比为2.00％的HEDTA。

试剂R2包括：胶乳颗粒、缓冲液、表面活性剂、电解质、防腐剂、稳定剂。其中：胶乳颗粒的百分含量为0.40％、包被有SAA抗体、粒径大小为200nm，缓冲液为pH值为7.5、浓度为30mmol/L的甘氨酸缓冲液，表面活性剂为质量百分比各为1.50％的Tween20和Tween80，电解质为质量百分比各为0.50％的钠盐和钾盐，防腐剂为质量百分比为1.50％的庆大霉素，稳定剂为质量百分比为5.00％的HEDTA。

见图1所示，采用前述全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂进行血清淀粉样蛋白A检测的方法为：

所用检测仪器为：特定蛋白仪

分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：Spline；测定波长：546nm；测定温度：37℃；样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl。

实施例6

全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂，包括试剂R1、试剂R2。具体的讲：

试剂R1包括：破胞组分、缓冲液、表面活性剂、电解质、防腐剂、反应促进剂、稳定剂。其中：破胞组分为质量百分比为1.80％的聚山梨酯，缓冲液为pH值为7.0、浓度为40mmol/L的磷酸缓冲液，表面活性剂为质量百分比为2.50％的Tween20，电解质为质量百分比为1.50％的钠盐，防腐剂为质量百分比各为0.50％的叠氮钠和庆大霉素，反应促进剂为质量百分比为3.00％的聚乙二醇6000，稳定剂为质量百分比为1.50％的蔗糖。

试剂R2包括：胶乳颗粒、缓冲液、表面活性剂、电解质、防腐剂、稳定剂。其中：胶乳颗粒的百分含量为0.50％、包被有SAA抗体、粒径大小为250nm，缓冲液为pH值为7.0、浓度为40mmol/L的磷酸缓冲液，表面活性剂为质量百分比为2.50％的Tween20，电解质为质量百分比为1.50％的钠盐，防腐剂为质量百分比各为0.50％的叠氮钠和庆大霉素，稳定剂为质量百分比为6.00％的蔗糖。

见图1所示，采用前述全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂进行血清淀粉样蛋白A检测的方法为：

所用检测仪器为：特定蛋白仪

分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：Spline；测定波长：546nm；测定温度：37℃；样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl。

实施例7

全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂，包括试剂R1、试剂R2。具体的讲：

试剂R1包括：破胞组分、缓冲液、表面活性剂、电解质、防腐剂、反应促进剂、稳定剂。其中：破胞组分为质量百分比为1.20％的脂肪酸盐，缓冲液为pH值为6.0、浓度为80mmol/L的Tris缓冲液，表面活性剂为质量百分比为1.00％的Tween80，电解质为质量百分比为2.50％的钠盐，防腐剂为质量百分比各为0.50％的叠氮钠，反应促进剂为质量百分比为1.50％的聚乙二醇8000，稳定剂为质量百分比各为1.00％的牛血清蛋白和蔗糖。

试剂R2包括：胶乳颗粒、缓冲液、表面活性剂、电解质、防腐剂、稳定剂。其中：胶乳颗粒的百分含量为0.60％、包被有SAA抗体、粒径大小为80nm，缓冲液为pH值为6.0、浓度为80mmol/L的Tris缓冲液，表面活性剂为质量百分比为1.00％的Tween80，电解质为质量百分比为2.50％的钠盐，防腐剂为质量百分比各为0.50％的叠氮钠，稳定剂为质量百分比各为3.00％的牛血清蛋白和蔗糖。

见图1所示，采用前述全血中血清淀粉样蛋白A定量检测试剂进行血清淀粉样蛋白A检测的方法为：

所用检测仪器为：特定蛋白仪

分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：Spline；测定波长：546nm；测定温度：37℃；样本：R1：R2＝8μl:250μl:50μl。

线性范围试验

用SAA纯品配制成高浓度样本，用生理盐水按常规比例分别进行倍比稀释，采用实施例2配比的试剂R1、R2重复测定每个样本3次(其余实施例试剂同样具有相同的实验结果)，计算均值，求出回归方程，并通过回归方程和红细胞压积计算出理论值，结果见图2。本发明试剂的线性范围宽，为5-500mg/L，健康人参考范围为≤10mg/L，基本满足临床需要。