本发明涉及牛肝菌化学成分测定方法，具体涉及一种牛肝菌中烟碱的手性分析方法。
背景技术：
：牛肝菌，又名白牛肝菌、大脚菇、黄荞巴，是一种大型食用真菌。中国是牛肝菌的全球主要产区之一，据粗略统计，中国牛肝菌每年平均产量约5万吨（鲜重），除少量内销外，绝大部分出口。中国牛肝菌的主销市场是欧盟、瑞士、美国和中国香港等国家和地区，其中欧盟是中国牛肝菌产品的第一出口市场，约占整个出口市场份额的90%。然而自2008年9月1日起，德国率先执行欧盟（EC）No.396/2005的规定，即牛肝菌样品中烟碱限量标准为0.01mg/kg（折成干品为0.12mg/kg），欧盟其他进口商也纷纷要求增加对烟碱的抽检。2008年11月17日，德国巴登符腾堡州内政部从市场上抽查了26个牛肝菌样品，其中22个样品被检出烟碱含量超标，这些被抽检样品大部分来自中国。虽然2010年4月，欧盟消费者保护总司以立法的形式对法案（EC）No.396/2005进行了修订，将牛肝菌干品中烟碱的最高限量调整为2.3mg/kg，中国牛肝菌仍有部分产品烟碱含量超标。这一风波不仅严重影响了中国牛肝菌产品的出口，也引起了人们对通过牛肝菌摄入烟碱的健康风险的广泛关注。烟碱，也叫尼古丁，是一种存在于茄科植物中的生物碱，也是烟草的重要成分，牛肝菌等野生菌类中也含有烟碱，中国国家质检总局对牛肝菌中烟碱来源的调查认为烟碱是真菌类物种生长过程中产生的一种普遍存在的次生代谢产物。烟碱分子含有一个手性中心，即四氢吡咯环上的2位碳原子，所以烟碱有两个对映体：S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱。烟碱的两个对映体具有完全不同含量、代谢机理和生理特性。S-(-)-烟碱的生理活性和毒性都要高于R-(+)-烟碱，例如相对于烟碱乙酰胆碱受体，S-(-)-烟碱比R-(+)-烟碱的亲和性高10-100倍。因此进行牛肝菌中烟碱的手性分析对了解经牛肝菌摄入烟碱的健康风险具有重要意义。目前关于烟碱的手性分析，主要是针对烟草和烟草制品中烟碱的手性分析方法研究，尚未有关于牛肝菌中烟碱的手性分析方法。牛肝菌中烟碱的含量远低于烟草中的含量，这给牛肝菌中烟碱手性分析带来了挑战。因此有必要开发一种灵敏度高、精密度好、适合准确定量牛肝菌中S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的方法。技术实现要素：本发明以烟碱为研究对象，对牛肝菌样品进行了前处理方法研究，建立了基于自动固相微萃取-多维气相气质联用系统的牛肝菌中烟碱旋光异构体的分析方法，实现了对牛肝菌中烟碱旋光对映体S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的准确测定。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种牛肝菌中烟碱的手性分析方法，将牛肝菌样品干燥、粉碎和过筛，加入萃取液萃取并过滤，经自动固相微萃取后进行多维气相色谱串联质谱（MDGCMS）分析；具体步骤如下：1）标准溶液的配制：分别称取100.0mg的S-(-)-烟碱标准品、50.0mg的R-(+)-烟碱标准品，用正己烷配制S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱浓度分别为100μg/mL和50μg/mL的混合标准溶液，浓度为100μg/mL的S-(-)-烟碱标准溶液，浓度为100μg/mL的R-(+)-烟碱标准溶液。2）牛肝菌样品的混匀：将牛肝菌样品置于40℃烘箱中，1小时后将牛肝菌样品取出，粉碎后过0.45毫米孔径标准筛；3）牛肝菌样品的萃取：称取约5g牛肝菌粉末，置于100mL锥形瓶中，加入20mL水，40mL正己烷和10mL2mol/L氢氧化钠溶液，具塞震荡萃取1h后，将萃取液避光静置30min；取上层有机相，2000g离心10min后过0.22μm滤膜至螺纹瓶中待进样。4)多维气相色谱串联质谱分析：将步骤3）的过滤液再经自动固相微萃取后进行多维气相色谱串联质谱分析，具体条件如下：①自动固相微萃取条件：自动萃取纤维首次使用时需要进行老化，条件如下：固定相PDMS/DVB(聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯)，250℃老化30min；样品加热温度30℃，预热3min，萃取时间5min，解吸5min，进样后在250℃烤针10min。②一维分析条件：色谱柱：30m×0.25mm×0.25μm5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷毛细管色谱柱(Rtx-5MS色谱柱或其他等效柱)。进样口温度：250℃。载气：氦气（纯度≥99.999%)，恒压进样：117.9kPa。升温程序：初始温度80℃，平衡时间1min，以10℃/min的速率至200℃，保持10min。检测器：火焰离子化检测器（FID）；温度：280℃；氢气：40mL/min；空气：400mL/min；尾吹：10mL/min；切割压力为50.0kPa。③二维分析条件：色谱柱：30m×0.25mm×0.25μm环糊精毛细管色谱柱(InertCapCHIRAMIX色谱柱或其他等效柱)。升温程序：初始温度50℃，保持3min，以2℃/min的速率升至130℃，之后以3℃/min的速率升至180℃，保持1min。检测器：电子轰击源（EI）；离子源温度：200℃；接口温度：220℃；检测器电压相对于调谐结果0kV；溶剂延迟：3min；检测模式：选择离子检测模式（SIM）；定量离子84。5）采用对照标样与牛肝菌样品烟碱色谱峰的保留时间及特征离子进行S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的定性分析，对定量离子峰面积进行归一化定量S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱占总烟碱的比例。本发明提供了一种牛肝菌中烟碱的手性分析方法，具有以下优良效果：1.本发明方法采用液液萃取和固相微萃取的前处理方法，前处理过程简单，操作简便快速，且前处理效果较好。2.本发明方法采用多维气相气质联用系统，能实现对S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的较好分离，R-(+)-烟碱的检出限（LOD）为0.25%，能够满足牛肝菌样品中烟碱的手性分析。3.本发明方法采用了高灵敏度和强抗干扰能力的质谱进行检测，因此具有操作准确、检出限低、回收率及重复性好等优点。附图说明图1为混合标准溶液的色谱图，图2为牛肝菌1#样品的色谱图。具体实施方式本发明通过以下具体实施例作进一步描述，但不限制本发明。1.仪器和试剂MDGCMS-QP2010Ultra多维气质联用仪（日本岛津公司），自动进样器AOC-5000（日本岛津公司），自动固相微萃取纤维进样针，65μmPDMS/DVB（聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯）固定相萃取纤维头（美国Supelco），Rtx-5MS色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm，日本岛津公司），InertCapCHIRAMIX色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm，日本岛津公司），AE163电子天平（感量：0.0001g，瑞士Mettler公司），HY-8调速振荡器（常州国华电器有限公司），高速粉碎机（武汉银彩科技有限公司），德国SIGMA3-30K-高速台式冷冻型离心机。正己烷（色谱纯），氢氧化钠（分析纯），S-(-)-烟碱标准品（CAS：54-11-5），R-(+)-烟碱标准品（CAS：25162-00-9）。2.标准溶液的配制称取约100.0mg的S-(-)-烟碱标准品，用正己烷稀释定容到50mL棕色容量瓶中，配制成浓度约为2.0mg/mL的S-(-)-烟碱标准储备液；称取约50.0mg的R-(+)-烟碱标准品，用正己烷稀释定容到50mL棕色容量瓶中，配制成浓度约为1.0mg/mL的R-(+)-烟碱标准储备液；各取50μLS-(-)-烟碱标准储备液和R-(+)-烟碱标准储备液，用正己烷稀释定容至100mL棕色容量瓶中，配制S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱浓度分别为1μg/mL和0.5μg/mL的混合标准溶液，另外分别稀释标准储备液得到1μg/mL的S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱标准溶液。3.烟碱标准溶液的手性分析取10mL混合标准溶液按照上述自动固相微萃取-多维气相气质分析条件进样分析。结果表明，S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱能在此条件下实现较好分离；取10mLS-(-)-烟碱标准溶液进行自动固相微萃取-多维气相气质分析，另将10mLR-(+)-烟碱标准溶液进行多维气相气质分析，最终通过S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的保留时间，确定S-(-)-烟碱先于R-(+)-烟碱出峰。4.R-(+)-烟碱的检出限烟碱的手性组成通常以R-(+)-烟碱占总烟碱的百分比来表示。为评估R-(+)-烟碱的检出限，本发明方法在S-(-)-烟碱的标准溶液中加入R-(+)-烟碱的标准溶液。结果表明，S-(-)-烟碱的标准溶液中即可观察到R-(+)-烟碱的响应信号，对定量离子峰面积进行归一化后，S-(-)-烟碱的标准溶液中R-(+)-烟碱的比例为0.25%（峰面积相对于总烟碱峰面积），以此作为本方法R-(+)-烟碱的检出限。5.牛肝菌样品中烟碱的手性分析实例将牛肝菌样品置于40℃烘箱中，1小时后将牛肝菌样品取出，粉碎后过0.45毫米孔径标准筛；称取约5g牛肝菌粉末，置于100mL锥形瓶中，加入20mL水，40mL正己烷和10mL2mol/L氢氧化钠溶液，具塞震荡萃取1h后，将萃取液避光静置30min；取上层有机相，2000g离心10min后过0.22μm滤膜，经自动固相微萃取后进行多维气相色谱串联质谱分析；采用对照标样与牛肝菌样品烟碱色谱峰的保留时间及特征离子进行S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的定性分析，对定量离子峰面积进行归一化定量S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱占总烟碱的比例。采用该方法对6个牛肝菌样品进行了分析，结果见表1。表1.牛肝菌中烟碱的手性分析结果序号S-(-)-烟碱R-(+)-烟碱牛肝菌1#95.27%4.73%牛肝菌2#98.27%1.73%牛肝菌3#96.54%3.46%牛肝菌4#96.47%3.53%牛肝菌5#96.60%3.40%牛肝菌6#95.37%4.63%6.分析方法的精密度取同一牛肝菌样品进行5次日内和日间平行测定，考察了本发明方法的精密度，结果见表2和表3。结果表明，牛肝菌样品中R-(+)-烟碱的日内和日间测定结果的变异系数分别为1.96%和3.35%，精密度较好。表2.实验方法的日内精密度样品第1次第2次第3次第4次第5次平均值标准偏差RSD（%）牛肝菌1#4.84%4.62%4.79%4.65%4.74%4.73%0.09%1.96%表3.实验方法的日间精密度样品第1次第2次第3次第4次第5次平均值标准偏差RSD（%）牛肝菌1#4.73%4.92%4.49%4.75%4.64%4.71%0.16%3.35%采用具体实施方式中的方法对上述6个牛肝菌样品进行了检测。检测得到的色谱图如图1和图2所示，图1为混合标准溶液的色谱图，图2为牛肝菌1#样品的色谱图。当前第1页1 2 3