一种二次谐波高分辨率成像方法及系统与流程

本发明属于光学显微成像领域，尤其涉及一种二次谐波高分辨率成像方法及系统。

背景技术：

近年随着激光技术、检测技术和计算机技术的快速发展，利用二次谐波(second harmonic generation,SHG)进行生物组织的三维成像成为生物医学成像领域中的热门课题，引起了广泛关注。二次谐波成像是一种三维光学成像技术，具有非线性光学成像所特有的高空间分辨率和高成像深度。

SHG的激发效率与激发光的平方成正比，因此仅在焦点附近才有足够的光子能量来激发，非线性效应的强局域性减少了成像时非焦点处发光产生的背景干扰，提高了信噪比和三维空间分辨率。同时使得非焦平面上的光漂白和光毒性大大降低，因此能长时间对样品进行成像而不影响其活性。由于二次谐波显微成像使用近红外的激发光，组织吸收和散射效应较小，激发光能深入组织内部，相比传统的显微镜，如激光扫描共焦显微镜，可以做更深层的成像。此外，二次谐波成像技术的发射与激发波长相距较远，因此信号易于有效分离。对活体生物样品，SHG还具有一些独特的优点。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射，不被吸收，因此不产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。另外，在许多情况下，组织的病变过程中的线性光学特性变化很小，传统的线性光学成像技术较难检测。生物组织发生病变时一般都会伴随着组织结构、细胞形态及分子结构的变化，SHG对组织微观结构变化高度敏感，所以有望将该方法用于某些疾病(如糖尿病、动脉硬化和一些视网膜疾病等)的早期检测和诊断。二次谐波显微成像技术不需进行样品染色，因此对某些不能进行荧光标记的非中心对称样品，采用二次谐波显微成像技术检测有效。

然而，目前二次谐波显微成像的空间分辨率还受到物镜数值孔径等条件的限制，无法满足所需要的更高的空间分辨率成像要求。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种二次谐波高分辨成像方法及系统，旨在提高二次谐波显微成像的空间分辨率，扩大其应用范围。

本发明提供了一种二次谐波高分辨率成像方法，包括以下步骤：

产生激发光；

对所述激发光进行调制，形成条纹激发光斑；

移动所述条纹激发光斑，并且在每移动一次之后，将所述条纹激发光斑在样品上进行时间空间聚焦，以在样品上激发出二次谐波；

逐次探测激发出的所述二次谐波；

根据探测到的所有二次谐波进行频谱分析，获得图像。

进一步地，所述对所述激发光进行调制，形成条纹激发光斑，包括：

先将所述激发光准直，再将准直后的激发光转换为线偏振光，再利用空间光调制器对所述线偏振光进行相位调制，产生条纹激发光斑。

进一步地，所述将所述条纹激发光斑在样品上进行时间空间聚焦，包括：

对所述条纹激发光斑进行时间聚焦，同时使时间焦点与所述样品的物平面重合。

进一步地，所述逐次探测激发出的所述二次谐波，包括：

在每次探测时，利用前向和/或背向二次谐波效应对所述激发出的二次谐波进行探测。

本发明还提供了一种二次谐波高分辨率成像系统，包括：

激发光源，用于产生激发光；

空间光调制器，用于调制激发光，以产生条纹激光光斑；

移动控制单元，用于控制所述空间光调制器所产生的条纹激光光斑进行移动；

光栅，用于使每次移动后的所述条纹激光光斑在样品上进行时间聚焦，且使时间焦点与所述样品的物平面重合，以在样品上激发出二次谐波；

物镜，用于收集产生的二次谐波；

探测器，用于记录二次谐波。

进一步地，所述激发光源与所述空间光调制器之间还设有：

扩束准直装置，用于调整所述激发光的尺寸并进行准直；

半波片，用于将准直之后的激发光变成线偏振光。

进一步地，所述空间光调制器与所述光栅之间还设有：

4f系统，用于将所述激发光中的0级衍射光截止。

进一步地，所述4f系统包括第一透镜、第二透镜以及一个孔径光阑，所述孔径光阑置于第一透镜的后焦面上，且第一透镜的后焦面与第二透镜的前焦面重合。

进一步地，所述物镜与所述探测器之间还设有：

滤光片，用于筛选所需的二次谐波。

本发明与现有技术相比，有益效果在于：本发明提供的二次谐波高分辨成像方法，先对激发光进行调制，形成条纹激发光斑；然后通过移动所述条纹激发光斑，并且在每移动一次之后，将所述条纹激发光斑在样品上进行时间空间聚焦，以在样品上激发出二次谐波；最后逐次探测激发出的所述二次谐波，并根据探测到的所有二次谐波进行频谱分析，获得高空间分辨率的图像。

本发明提供的二次谐波高分辨成像系统，利用空间光调制器在显微物镜的物面形成条纹光斑对物体激发，并控制空间光调制器移动条纹，利用探测器记录激发产生的二次谐波，记录的二次谐波包含了超过衍射极限的高频信息。由于激发光条纹与物体结构信息叠加，使得系统探测到更高频率的物体信息，从而提高成像横向分辨率。同时利用光栅对激光进行时间聚焦，只在时间焦点处才有二次谐波产生，从而又提高了成像的轴向分辨率，并且可以进行层析成像。

本发明提供的二次谐波高分辨成像系统，结合所发明的成像方法对系统进行了设置，不仅结构简单，而且成像效果显著。

附图说明

图1是本发明实施例提供的二次谐波高分辨成像方法的实现流程示意图；

图2是本发明实施例提供的二次谐波高分辨成像系统。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面介绍一种二次谐波高分辨成像方法，请参阅图1，本发明实施例提供的二次谐波高分辨成像方法，包括：

S101、产生激发光；

具体地，通过激发光源产生激发光，可以为激光器。

S102、对激发光进行调制，形成条纹激发光斑；

具体地，先将激光进行准直调整之后，变成线偏振光，然后通过空间光调制器和透镜对激发光进行调整，形成条纹激发光斑。

S103、移动所述条纹激发光斑，并且在每移动一次之后，对将所述条纹激发光斑在样品上进行时间空间聚焦，以在样品上激发出二次谐波；

具体地，先利用光栅将条纹激光光斑形成频率连续分布的各组分光，然后与管镜、物镜等配合使用，将被光栅分开的连续频率组分的光重新重叠，通过时间空间聚焦作用在样品上激发出SHG(二次谐波)信号。

S104、逐次探测激发出的所述二次谐波；

具体地，探测二次谐波的光路为背向探测和/或前向探测，探测到的二次谐波会被相应连接的探测器接收。移动所述条纹光斑，使样品上激发出新的二次谐波，探测新的二次谐波；

具体地，对于已形成的条纹激发光斑，让条纹在某一个方向进行移动，每移动条纹一次，探测器对物成像一次。

S105、根据探测到的所有二次谐波进行频谱分析，获得图像。

具体地，利用这些移动条纹对样本所成的像进行频谱分析，可以获得系统截止频率以外的高频分量，即可提高该方向的分辨率。转动条纹，再重复上述过程，即移动条纹成像，就可提高该方向的分辨率。依次类推，就可以提高该平面内各个方向的成像分辨率。

本发明实施例还提供了一种二次谐波高分辨率成像系统，包括：

激发光源，用于产生激发光；

空间光调制器，用于调制激发光，以产生条纹激光光斑；

移动控制单元，用于控制所述空间光调制器所产生的条纹激光光斑进行移动；

光栅，用于使每次移动后的所述条纹激光光斑在样品上进行时间聚焦，且使时间焦点与所述样品的物平面重合，以在样品上激发出二次谐波；

物镜，用于收集产生的二次谐波；

探测器，用于记录二次谐波。

如图2所示，为本发明的二次谐波高分辨成像系统的一较佳实施例。其中所述系统包括激发光源1，空间光调制器5，光栅11，物镜15以及探测器19和23。

具体地，激发光源1采用钛宝石飞秒激光器，产生的激光为飞秒激光，该激光可实现物质的二次谐波激发。激发光源1和空间光调制器5之间设有第一扩束准直透镜2和第二扩束准直透镜3构成的扩束准直装置、半波片4。激发光源1产生的激光经由扩束准直透镜2和扩束准直透镜3构成的扩束准直装置，变成所需尺寸的准直光，准直之后的激光经半波片4变成线偏振光。

具体地，在本实例中，空间光调制器5采用的是全反射纯相位型空间光调制器，利用SLM实现对入射光的相位调制，产生我们所需的激发条纹光斑。

具体地，空间光调制器5与光栅11之间设有4f系统，所述4f系统由一对透镜——第一透镜6和第二透镜8，以及一个孔径光阑7组成。孔径光阑7摆在第一透镜6的后焦面上，第一透镜6的后焦面和第二透镜8的前焦面重合。该4f系统将激光中不需要的0级衍射光截止，即进行空间滤波。

具体地，光栅11与4f系统之间连接有半波片9和傅里叶透镜10，其中光栅11为闪耀光栅。其中，半波片9的偏振方向和半波片4的偏振方向相同。闪耀光栅11面和傅里叶透镜10的后焦面重合。经过半波片9后的激光光斑经过傅里叶透镜10后，在闪耀光栅11面即傅里叶透镜10的后焦面上形成我们所需要条纹形状的激光光斑，然后以闪耀角入射闪耀光栅11。经过闪耀光栅11后，形成按照光谱频率连续分布的各组分光。

具体地，光栅11与物镜15之间设有管镜12、激发滤光片13、双色镜14。在本实例中，物镜15的焦平面和时间聚焦面重合。不同频率连续分布的激光经过管镜12、激发滤光片13、双色镜14，并通过物镜15的聚焦作用，在物镜15的焦平面即时间聚焦面上被光栅分开的连续频率组分的光将重新重叠。通过时间空间聚焦作用在物平面16上的激发出SHG信号。

以下对本实施例中的探测光路的结构进行详细说明。

本发明实例探测光路分为两部分——背向探测和前向探测。需要说明的是，两部分可以分开使用也可以结合起来使用。

具体地，背向探测光路包括双色镜14，滤光片17，管镜18以及被探测器19。在实施例中，背向探测光路中双色镜14对中心波长为810nm的脉冲激光高透，对波长为405nm的SHG信号高反，双色镜14与入射光束之间的夹角为45°或135°。物平面16产生的背向SHG被足够大数值孔径的物镜115接收，经双色镜114反射后，在传导光路上依次经过接收滤光片17、管镜18并被探测器19接收。

具体地，前向探测光路包括物镜20，滤光片21，管镜22以及探测器23。物平面16产生的前向SHG向前传播，被数值孔径足够大的物镜20收集之后经过接收滤光片21、管镜22并被探测器23接收。

在本实例中，滤光片17、21采样窄带滤光片，仅让SHG通过，并进入后续系统。管镜18和22将信号收集在探测器上19、23上。探测器19和23采用面探测器，优选为CCD相机或CMOS相机。

本发明实施例实现二次谐波高分辨率成像的理论公式包括：

激发二次谐波的激发条纹光为：

其中代表不同相位，m＝1,2,…,M。

经过光学系统之后探测器接收到的光强：

其中h_2p(x)是有效双光子点扩散函数，h_em(x)该系统发射点扩散函数，s(x)是样本函数。

傅里叶变换之后：

具体地：

可将各个频率分量进行分离，复位并相加，并转换到时域，即可得到该方向超分辨的图像。

在本实例中，移动控制单元可使用计算机。空间光调制器5和探测器19、23与如计算机连接。通过计算机控制空间光调制器5可以形成条纹光斑，并可让条纹在某一个方向进行移动，每移动条纹一次，探测器对物成像一次，并存储在计算机中。利用这些移动条纹对样本所成的像进行频谱分析，可以获得系统截止频率以外的高频分量，即可提高该方向的分辨率。转动条纹，再重复上述过程，即移动条纹成像，就可提高该方向的分辨率。依次类推，就可以提高该平面内各个方向的成像分辨率。

本实施例中通过时间空间聚焦作用，可以进行层析成像，提高轴向分辨率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。