一种抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡及其制作、使用方法与流程

本发明涉及微流控技术和免疫荧光技术相结合的技术领域，具体涉及一种抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡及其制作、使用方法。

背景技术：

近年来因自身免疫障碍而导致的不孕问题越发引起人们的重视，抗精子抗体(AsAb)是免疫性不孕最常见的一种因素。抗精子抗体(AsAb)是一个复杂的病理产物，其作用主要表现为精子凝集、精子制动，影响精子的运送，抑制精子穿透宫颈黏液，限制精子与卵透明带粘附，抑制精子顶体的活性，使精子不易穿透包绕卵细胞的放射冠和透明带，阻碍精子与卵细胞膜的融合，阻止精子与卵子结合等。

抗缪勒管激素是一种不同于睾酮的蛋白质类物质，产生于包括人类在内的所有哺乳类动物的睾丸，它能够导致缪勒管退化。抗缪勒管激素属于转化生长因子β超家族的一种多肽，是由两个相同的70kb亚基组成的二聚糖蛋白，相对分子质量为140 000。其在雄性体内的唯一作用就是导致胎儿体内的缪勒管退化，使其具有男性表型。当缺乏抗缪勒管激素时，缪勒管可发展成为子宫、输卵管和阴道上部。

微流控(Microfluidics)指的是使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到阿升)的一种技术。当微通道的特征尺寸在微米甚至纳米量级时，微通道表面积与其内部空间的体积之比很大，通道的结构、形状和壁面性质都将对其中的流体流动状态产生极大的影响。流体在微流控的微通道中具有独特的流体性质，如层流和液滴等。借助这些独特的流体现象，微流控可以实现一系列常规方法所难以完成的微加工和微操作。

免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)是免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合，使用荧光微球标记已知的抗原或抗体，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在检测过程中，采用荧光微球最佳激发光源进行激发，发射出的荧光经过滤光片后，用CCD扫描技术或光纤技术，将发射光谱收集、聚集和倍增后，转换成数值信号，实时检测荧光变化曲线。

目前市面上尚无抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测产品，单独的抗精子抗体检测产品多采用酶联免疫吸附法和浅盘凝集法，单独的抗缪勒管激素检测产品多采用双抗夹心ELISA方法，这些方法尚存在以下方面的不足：

酶联免疫吸附法是采用正常精子膜抗原包被反应板，加待测标本及酶标记二抗底物显色，阳性为明显黄色，阴性孔不显色。此方法无法定量检测抗精子抗体的含量，且操作复杂，且影响因素较多，检测结果易受外界因素的干扰。

浅盘凝集法是将微量正常精子与待测标本在浅盘中混合，镜下观察有无凝集。有活动的凝集精子为阳性。此方法无法定量检测抗精子抗体的含量，且灵敏度低，且较易受到外界因素的干扰。

双抗夹心ELISA法只能定性或者半定量检测血液样本中抗缪勒管激素的含量，而无法精确定量检测。

技术实现要素：

针对以上现有技术问题，本发明的目的在于提供一种灵敏度高、操作简便、稳定且定量检测的抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡。采用微流控技术和免疫荧光技术制成包括覆有滤纸的加样区、喷涂有不同荧光微球标记的抗精子二抗和抗缪勒管激素抗体的结合区、并联微通道时间阀、包被有抗精子二抗并具有特殊结构的检测区、包被有抗缪勒管激素抗体并具有特殊结构的检测区和废液区的抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡。具体技术方案如下：

一种抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡，包括底卡和面卡，其中，所述底卡上设有加样区，结合区，阀，检测区以及废液区，所述加样区连接结合区且加样区与结合区位于阀的一端，所述检测区连接废液区且位于阀的另一端；所述面卡上设有加样孔和检测孔。

进一步地，所述加样区覆有滤纸，所述结合区喷涂有不同荧光微球标记的抗精子二抗和抗缪勒管激素抗体。

进一步地，所述检测区包括第一检测区和第二检测区，第一检测区包被有抗精子二抗，第二检测区包被有抗缪勒管激素抗体。

进一步地，所述阀为并联微通道时间阀。

进一步地，所述结合区和检测区分别设置于并联微通道的两端并直接连接至并联微通道，所述底卡和面卡的背面扣合连接。

进一步地，所述微通道为通过软光刻技术制成的微通道，和/或两条并联微通道时间阀宽度均为3μm。

进一步地，其采用聚二甲基硅氧烷材质制成，和/或，所述滤纸直径1.5cm、孔径为1～3μm，和/或，所述检测区带有弯型通道。

上述抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡的制作方法，包括如下步骤：

(1)制作底卡模板；

(2)制备不同荧光微球标记的抗精子二抗和抗缪勒管激素抗体混合液；

(3)喷涂抗体混合液；

(4)包被抗体；

(5)滤纸粘覆；

(6)抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡的制备。

进一步地，步骤(1)中底卡采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材质，利用光刻机设备，经过CAD制图、掩模、光刻、再铸模、软光刻等工艺过程来完成底卡模板的制作；和/或，步骤(2)中包括如下步骤：

(2-1)取荧光微球A加入抗精子二抗，混匀搅拌，洗涤离心，沉淀用PBS溶液复溶沉淀待用；

(2-2)取荧光微球B加入抗缪勒管激素抗体，混匀搅拌，洗涤离心，沉淀用PBS溶液复溶沉淀待用；

(2-3)将上述制备的抗精子二抗溶液和抗缪勒管激素抗体溶液按比例混合，制成抗精子二抗和抗缪勒管激素抗体混合液；

和/或，步骤(3)中用喷金机将上述混合好的抗体混合液均匀喷涂至底卡模板的结合区，干燥后放于室温干燥环境中备用；和/或，步骤(4)中用PBS调节抗精子二抗的浓度，用PBS调节抗缪勒管激素的浓度，将两种溶液分别均匀喷涂在底卡模板的两个检测区内，干燥并于室温干燥环境中保存备用；和/或，步骤(5)中，将滤纸粘覆在底卡模板的加样区；和/或，步骤(6)中，将面卡和制备好的底卡按合，压紧。

上述抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡的使用方法，包括如下步骤：

a.平放抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡；

b.将待测血清平衡至室温；

c.用已灭菌的一次性滴管吸取待测血清滴一滴至加样孔；

d.立即将检测卡放至多色荧光检测仪中；

e.多色荧光检测仪实时检测荧光微球在660nm和480nm激发光源的激发下所发出的荧光数值。

与目前现有技术相比，本发明通过微通道控制待测样品的流速，再利用免疫荧光技术实时检测荧光变化曲线，再根据一定时间内荧光变化值换算待测样品中抗精子抗体的浓度水平值。检测过程中，采用多色荧光检测仪实时检测两种荧光微球在其最佳激发光源的激发下所发出的荧光数值，测出荧光变化曲线，对照其标准曲线，取两点荧光值所对应的抗精子抗体的标准浓度值，通过公式即可换算出待测血清中抗精子抗体和抗缪勒管激素的含量。本发明灵敏度高、操作简便、稳定且定量准确。本发明使用的荧光微球不受外界环境的影响，因而荧光稳定，而且通过微流控技术控制待测血液在检测卡上的流速，为定量检测提供了良好的条件。具体来说：

1、本发明采用荧光微球标记抗体。荧光微球是一种载有荧光分子的功能性微球，有比较稳定的形态结构及发光行为，故而不易受到外界因素的干扰。

2、本发明采用微流控技术和免疫荧光技术，通过微通道时间阀控制待测血液在检测卡上的流速，加上荧光微球稳定高效的发光效率，并且采用并联微通道的方式，以达到同时定量检测待测血液中抗精子抗体和抗缪勒管激素含量的目的。

3、本发明采用检测卡形式，只需滴一滴待测血液即可完成检测，操作简便，灵敏度高。

附图说明

图1是抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡的底卡结构示意图

图2是抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡的面卡结构示意图

图3是荧光的变化曲线图

具体实施方式

下面根据附图对本发明进行详细描述，其为本发明多种实施方式中的一种优选实施例。

在一个优选实施例中，一种抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡是采用聚二甲基硅氧烷(也称硅酮弹性体或硅橡胶，PDMS)材质制成，由底卡和面卡组成，底卡构造包括覆有滤纸的加样区11、喷涂有不同荧光微球标记的抗精子二抗和抗缪勒管激素抗体的结合区12、并联微通道时间阀13、包被有抗精子二抗并具有特殊结构的检测区14、包被有抗缪勒管激素抗体并具有特殊结构的检测区15和废液区16。面卡包含加样孔和检测孔，面卡构造包括加样孔21和检测孔22。

底卡构造中加样区粘覆有滤纸，滤纸直径1.5cm、孔径为1～3μm，底卡构造中包含通过软光刻技术制成的微通道，两条并联微通道时间阀宽度均为3μm，底卡中结合区不同荧光微球标记的抗精子二抗和抗缪勒管激素抗体，底卡中检测区带有弯型通道的特殊结构。

一种不同荧光微球标记的抗精子二抗和抗缪勒管激素抗体混合液的方法：(1)取0.1ml荧光微球A(10mg/ml、粒径0.51μm、激发波长660nm、发射波长690nm)加入6μl抗精子二抗，充分混匀后，室温搅拌反应3小时，分别用超纯水洗涤离心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸盐缓冲液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶沉淀0.1ml，待用；(2)取0.1ml荧光微球B(10mg/ml、粒径0.52μm、激发波长480nm、发射波长520nm)加入5μl抗缪勒管激素抗体，充分混匀后，室温搅拌反应3小时，分别用超纯水洗涤离心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸盐缓冲液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶沉淀0.1ml，待用；(3)将上述制备的抗精子二抗溶液和抗缪勒管激素抗体溶液按1:1.2混合，制成抗精子二抗和抗缪勒管激素抗体混合液。

0.1ml荧光微球A(10mg/ml、粒径0.51μm、激发波长660nm、发射波长690nm)中加入6μl抗精子二抗，0.1ml荧光微球B(10mg/ml、粒径0.52μm、激发波长480nm、发射波长520nm)加入5μl抗缪勒管激素抗体，将上述制备的抗精子二抗溶液和抗缪勒管激素抗体溶液按1:1.2混合，制成抗精子二抗和抗缪勒管激素抗体混合液。

在另一个优选实施例中，一种抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡，包括以下步骤：

抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡的底卡模板的制作：采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材质，利用光刻机设备，经过CAD制图、掩模、光刻、再铸模、软光刻等工艺过程来完成底卡模板的制作，两条并联微通道时间阀宽度均为3μm。

不同荧光微球标记的抗精子二抗和抗缪勒管激素抗体混合液的制备：通过两种不同荧光微球分别标记抗精子二抗和抗缪勒管激素抗体，再按特定比例混合制成不同荧光微球标记的抗精子二抗和抗缪勒管激素抗体混合液。

喷涂抗体混合液：用喷金机将荧光微球标记的抗精子二抗按照6μl的量均匀喷涂至底卡模板的结合区。

包被抗体：用0.01M PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)调节抗精子二抗的浓度为0.6mg/ml，用0.01M PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)调节抗缪勒管激素的浓度为0.5mg/ml，将两种溶液按照2μl的量分别均匀喷涂在底卡模板的两个检测区内。

滤纸粘覆：将直径为1.5cm、孔径为1～3μm的圆形滤纸粘覆在底卡模板的加样区。

抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡的制备：将面卡和制备好的底卡按合，压紧，再将组装好的检测卡装入铝箔袋中，加入干燥剂后封口保存，与室温干燥环境下可保存一年。

在一个优选实施例中：

一、抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡的底卡模板的制作

本发明检测卡的底卡是采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材质，利用光刻机设备，经过CAD制图、掩模、光刻、再铸模、软光刻等工艺过程来完成底卡模板的制作，两条并联微通道时间阀宽度均为3μm。

二、不同荧光微球标记的抗精子二抗和抗缪勒管激素抗体混合液的制备

(1)取0.1ml荧光微球A(10mg/ml、粒径0.51μm、激发波长660nm、发射波长690nm)加入6μl抗精子二抗，充分混匀后，室温搅拌反应3小时，分别用超纯水洗涤离心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸盐缓冲液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶沉淀0.1ml，待用；

(2)取0.1ml荧光微球B(10mg/ml、粒径0.52μm、激发波长480nm、发射波长520nm)加入5μl抗缪勒管激素抗体，充分混匀后，室温搅拌反应3小时，分别用超纯水洗涤离心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸盐缓冲液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶沉淀0.1ml，待用；

(3)将上述制备的抗精子二抗溶液和抗缪勒管激素抗体溶液按1:1.2混合，制成抗精子二抗和抗缪勒管激素抗体混合液。

三、喷涂抗体混合液

用喷金机将上述混合好的抗体混合液按照6μl的量均匀喷涂至底卡模板的结合区，30℃真空干燥1～2h，放于室温干燥环境中备用。

四、包被抗体

用0.01M PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)调节抗精子二抗的浓度为0.6mg/ml，用0.01M PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)调节抗缪勒管激素的浓度为0.5mg/ml，将两种溶液按照2μl的量分别均匀喷涂在底卡模板的两个检测区内，30℃真空干燥12h，于室温干燥环境中保存备用。

五、滤纸粘覆

将直径为1.5cm的圆形滤纸粘覆在底卡模板的加样区。

六、抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡的制备

将面卡和制备好的底卡按合，压紧，再将组装好的检测卡装入铝箔袋中，加入干燥剂后封口保存，与室温干燥环境下可保存一年。

如图1所示，该抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡的底卡构造包括覆有滤纸的加样区11、喷涂有不同荧光微球标记的抗精子二抗和抗缪勒管激素抗体的结合区12、并联微通道时间阀13、包被有抗精子二抗并具有特殊结构的检测区14、包被有抗缪勒管激素抗体并具有特殊结构的检测区15和废液区16。

如图2所示，该抗精子抗体和抗缪勒管激素联合定量检测卡的面卡构造包括加样孔21和检测孔22。

1、样品检测：平放检测卡，将待测血清平衡至室温，用已灭菌的一次性滴管吸取待测血清滴一滴至加样孔，立即将检测卡放至多色荧光检测仪中。多色荧光检测仪实时检测荧光微球在660nm和480nm激发光源的激发下所发出的荧光数值。

2、结果分析：通过荧光分析软件分析所测荧光的变化曲线，对照其标准曲线，得出A1、A2荧光值所对应的抗精子抗体的标准浓度值AsAb2、AsAb1以及A1’、A2’荧光值所对应的抗缪勒管激素的标准浓度值AMH1、AMH2。

AsAb0表示待测血清中抗精子抗体的含量，AMH0表示待测血清中抗缪勒管激素的含量，AsAb1、AsAb2表示A1、A2荧光值所对应的抗精子抗体的标准浓度值，AMH1、AMH2表示A1’、A2’荧光值所对应的抗缪勒管激素的标准浓度值，V表示在微通道中血清流体的流速，t1、t2表示AsAb1/AMH1、AsAb2/AMH2荧光值所对应的时间，根据以下公式换算出待测血清中抗精子抗体的含量：

上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。