猪心中提取肌红蛋白的方法及含有其的人总抗氧化状态试剂盒与流程

本发明涉及生物化学、检测试剂领域，具体涉及的是一种采用硫酸铵沉淀、疏水层析两步法从新鲜猪心中快速提取获得高纯度肌红蛋白，通过喷雾干燥技术制成干粉，并将其应用于制备人总抗氧化状态(TAS)试剂盒，检测人总抗氧化状态的技术；具体的为一种猪心中提取肌红蛋白的方法及含有其的人总抗氧化状态试剂盒。
背景技术：
：活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)主要包括羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢。在机体的正常生理代谢过程中会产生活性氧，同时一些环境因子例如紫外照射、吸烟、污染等也会诱导活性氧的产生。自由基会引起DNA损伤从而导致突变，还能使蛋白质、核酸等大分子交联进而影响细胞正常功能，同时自由基作为代谢中间产物，其强反应能力可使细胞中的多种物质发生氧化，诱导氧化应激，参与早老性痴呆、帕金森病等诸多疾病的病理过程。目前研究人机体抗氧化能力主要通过分析机体某种特定抗氧化成分和(或)自由基代谢产物的变化，如脂质过氧化物(LPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸、维生素E等。而这种通过体外检测某组分中单一的抗氧化成分变化的方式并不能准确反映机体抗氧化水平。总抗氧化状态(TotalAntioxidantStatus,TAS)反映机体维持氧化-抗氧化状态平衡的能力。文献报道表明，机体的总抗氧化状态与糖尿病、支气管哮喘、动脉粥样硬化、风湿性关节炎、肝损伤、早老性痴呆、癌症等多种疾病有着密切的关系，因此测定机体血浆、血清、尿液等成分中总的抗氧化物质浓度，具有非常重要的生物学和临床意义，有利于更全面地评估机体抗氧化状态，掌握机体的防御能力，为实施抗氧化辅助治疗提供依据，以期有效地预防疾病和控制相关疾病的恶化。肌红蛋白(Myoglobin，MB)由一条肽链和一个血红素辅基组成的结合蛋白，是肌肉内储存氧的蛋白质。MB特有的结构使得其非常有利于氧的储存和运输，但正是这种富氧状态使其极易受到自由基的攻击，被氧化。氧化状态的MB可以通过偶联催化ABTS形成激活态ABTS，即ABTS+，ABTS+呈蓝色，在600nm处有吸收峰，而体内的抗氧化物质能够抑制该反应的产生，通过其抑制的大小判断机体的抗氧化能力。肌红蛋白的辅基为血红素，其由四个吡咯类亚基组成一个环，环中心为一个亚铁离子，该物质结构的特殊性和复杂性使得目前通过基因工程方式表达获得的重组肌红蛋白存在产量低、稳定性差等问题，限制了其在TAS试剂盒中的应用。目前有文献报道，可采用两次柱层析法对猪心肌、沙丁鱼肌肉等动物组织中的肌红蛋白进行提取，但该方法繁琐，提取效率不高；也有报道称从野牛心肌、马属动物心肌中提取的肌红蛋白稳定性好，但缺点是原材料难以获得、成本高，无法满足试剂盒的批量生产需求。技术实现要素：本发明针对上述不足，提出了一种猪心中提取肌红蛋白的方法，该方法产量高，提取成本低，获得的肌红蛋白具有良好的稳定性，能应用到TAS试剂盒中，以检测机体血清、尿液等成分中总的抗氧化物质浓度，同时原材料来源丰富，容易获得，可满足试剂盒的批量生产需求。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种猪心中提取肌红蛋白的方法，主要步骤包括：1)将新鲜猪心去除脂肪和结缔组织之后，加入破碎缓冲液，用组织匀浆机快速匀浆，并用高速冷冻离心机离心，去除沉淀，获得粗提液；2)粗提液中加入硫酸铵，搅拌，室温下沉淀0.5-1.5h后，用高速冷冻离心机离心，保留上清；3)在上清液中加入硫酸铵至饱和状态，室温下沉淀2h以上，并用高速冷冻离心机离心，弃去上清，获得沉淀；4)沉淀用含硫酸铵的缓冲液复溶至原体积(此处的原体积为：步骤(1)中破碎缓冲液的体积)，过滤待上样；5)疏水填料装柱后，用含硫酸铵的缓冲液平衡，平衡结束后上样，上样完毕后，继续平衡至无蛋白流出，然后用含有硫酸铵的缓冲液洗脱，根据洗脱峰收集目的蛋白；6)收集得到的目的蛋白通过SDS-PAGE检测纯度后，加入保护剂通过喷雾干燥技术制备干粉。本发明主要采用硫酸铵沉淀和疏水层析方法提取肌红蛋白，硫酸铵沉淀具有适应性广、对蛋白无损伤、原料成本低等优点；同样疏水层析是一步纯化，快速分离，具有处理时间短、生产成本低等优点，将二者结合使用，可快速、简单地从猪心中提取获得高纯度的肌红蛋白。通过上述纯化方法，获得的高纯度肌红蛋白，对其进行产量、纯度等分析显示：1000g猪心可以提取获得2g天然肌红蛋白，回收率50％以上，经SDS-PAGE分析发现，所提取的肌红蛋白纯度可达95％以上。该方法具有原材料易得、成本低、方法简单、无需复杂设备、经济实惠、提取得率高等优点，可实现批量生产。上述所用缓冲液为磷酸缓冲液、Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液、HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液、MOP(3-(N-吗啉基)丙磺酸)缓冲液、硼酸盐缓冲液中的一种或几种，使用浓度为1mM～1000mM，且pH范围在6～9.5之间。其中各个步骤中所使用的缓冲液可以不一致，但为了操作简易一般整个过程使用同种缓冲液；上述所用硫酸铵质量浓度为：1)粗提液中为40-60％，此步骤通过盐析作用，让疏水性强的蛋白质形成沉淀，离心加以去除；2)复溶沉淀、平衡缓冲液中为30-40％，在此浓度条件下，肌红蛋白具有一定的疏水性，可以和疏水填料结合；3)洗脱缓冲液为15-25％，在此浓度条件下，肌红蛋白疏水性减弱，可与疏水填料解离，从而被洗脱下来。上述所用疏水填料为苯基、丁基、辛基、异丙基中的一种。为市售产品，比如西安恒成生物科技有限公司销售的产品编号为13-0132-(01～06)的苯基类的疏水填料，产品编号为13-0132-(01～06)的13-0231-(01～06)的丁基类的疏水填料等等。上述喷雾干燥所用保护剂为海藻糖、玉米糊精、玉米淀粉、阿拉伯树胶中的一种或几种，以目的蛋白收集液的体积计算，保护剂使用的质量浓度为0.1％～10％，保护剂的加入可保护肌红蛋白在喷雾干燥高温处理过程中不发生变性、聚集、沉淀，同时能有效增大喷雾干燥受热面积，有利于喷雾干粉的形成。本发明还提供一种含有上述肌红蛋白的人总抗氧化状态(TAS)试剂盒，该试剂盒由试剂1和试剂2组成：试剂1为：缓冲液5～1000mM(mmol/L)2,2’-重氮-双-(3-乙基苯噻唑啉磺酸盐)(ABTS、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)10～1000μM(10-6mol/L)肌红蛋白1～100g/L防腐剂0.01～2g/L；试剂2为：过氧化氢(H2O2)2～100mM。本发明上述试剂盒中的缓冲液为为磷酸缓冲液、Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液、HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液、MOP(3-(N-吗啉基)丙磺酸)缓冲液、硼酸盐缓冲液中的一种或几种，且pH范围在5.5～8.5之间。本发明上述试剂盒中的防腐剂为叠氮化合物、硫柳汞、PC系列防腐剂中的一种或几种。本发明中的TAS试剂盒，可用于检测和评估机体血清、血浆、尿液、唾液、细胞裂解液等成分的总抗氧化状态。本发明的试剂盒，由于肌红蛋白具有良好的稳定性，可以配制成液体试剂，在37℃条件下可稳定15d左右，在4℃条件下可稳定1年左右，试剂盒性能指标基本保持不变；同时肌红蛋白来源于猪心，提取工艺简单、提取得率高，生产成本低，解决了从马属动物心肌、骨骼肌提取的高成本问题，有效降低试剂盒的生产成本，产生良好的经济效益。本发明的优点及有益效果：1、本发明通过硫酸铵沉淀、疏水层析作用直接从新鲜猪心中提取肌红蛋白，原材料易得、提取步骤简单、提取率高、生产成本低、易实现产业化。2、通过上述提取方法，可获得纯度达95％以上的天然肌红蛋白，稳定性良好，可应用于TAS试剂盒中，TAS试剂盒37℃条件下可稳定15d左右，在4℃条件下可稳定1年左右。3、通过本发明中的TAS试剂盒，各方面性能满足要求，能用于检测机体血清、尿液等成分中总的抗氧化物质浓度，评估总抗氧化状态。附图说明图1本发明实施例1的SDS-PAGE图谱。图2本发明实施例2的SDS-PAGE图谱。具体实施方式：下面结合具体实例进一步阐述本发明，但不是对本发明的限制，在本发明的精神和权力保护范围内所做的任何修改，都将纳入本发明的保护范畴。实例1：从猪心中提取肌红蛋白1)将500g新鲜猪心去除脂肪和结缔组织之后，加入1000ml50mM磷酸缓冲液pH8.0，用组织匀浆机快速匀浆5min后，高速冷冻离心机12000rpm离心40min，去除沉淀，获得粗提液；2)粗提液中加入占粗体液体质量40％的硫酸铵固体，轻微搅拌，待溶解完全，室温下沉淀1h后，用高速冷冻离心机12000rpm离心40min，弃去沉淀，保留上清液；3)在上清液中继续加入硫酸铵固体至饱和状态，轻微搅拌，待溶解完全，室温下沉淀2h后，用高速冷冻离心机12000rpm离心40min，弃去上清，获得沉淀；4)沉淀用含30％硫酸铵的缓冲液复溶至1000ml，用0.45μm滤膜过滤以致澄清；5)将200ml苯基疏水填料装入层析柱中，用3000ml30％硫酸铵的100mM磷酸缓冲液pH8.0平衡，平衡结束后上样，上样完毕后，继续平衡至无蛋白流出，然后用含有15％硫酸铵的100mM磷酸缓冲液pH8.0洗脱，根据洗脱峰收集目的蛋白；6)通过SDS-PAGE检测收集液中目的蛋白的纯度，电泳结果表明纯度不低于95％(图1)，将收集液根据体积加入2％阿拉伯树胶，通过喷雾干燥技术制备干粉，其中喷雾干燥条件为进口温度150℃、喷雾速度100ml/h。实例2：从猪心中提取肌红蛋白1)将1000g新鲜猪心去除脂肪和结缔组织之后，加入2000ml120mMTris缓冲液pH8.8，用组织匀浆机快速匀浆10min后，高速冷冻离心机12000rpm离心40min，去除沉淀，获得粗提液；2)粗提液中加入50％的硫酸铵固体，轻微搅拌，待溶解完全，室温下沉淀1h后用高速冷冻离心机12000rpm离心40min，保留上清；3)在上清液中加入硫酸铵固体至饱和状态，轻微搅拌，待完全溶解，室温下沉淀2h后，用高速冷冻离心机12000rpm离心40min，弃去上清，获得沉淀；4)沉淀用35％硫酸铵150mMTris缓冲液pH8.5复溶至2000ml，0.45μm滤膜过滤后，准备上样；5)将500ml辛基疏水填料，装入层析柱中，用含35％硫酸铵的150mMTris缓冲液pH8.5平衡，平衡结束后上样，上样完毕后，继续平衡至无蛋白流出，然后用含有25％硫酸铵的150mMTris缓冲液pH8.5洗脱，根据洗脱峰收集目的蛋白；6)通过SDS-PAGE检测收集液中目的蛋白的纯度，电泳结果表明纯度不低于95％(图2)，将收集液按体积加入5％海藻糖，通过喷雾干燥技术制备干粉，其中喷雾干燥条件为进口温度170℃，喷雾速度250ml//h。实例3：从猪心中提取肌红蛋白1)将800g新鲜猪心去除脂肪和结缔组织之后，加入1400ml，250mM.硼酸缓冲液pH7.2中，用组织匀浆机快速匀浆25min后，高速冷冻离心机8000rpm离心40min，去除沉淀，获得粗提液；2)粗提液中加入60％的硫酸铵固体，轻微搅拌，室温下沉淀1h后用高速冷冻离心机8000rpm离心40min，保留上清；3)在上清液中加入硫酸铵固体至饱和状态，室温下沉淀2h后用高速冷冻离心机7500rpm离心50min，弃去上清，获得沉淀；4)沉淀用40％的饱和硫酸铵缓冲液复溶至1400ml，0.8μm滤膜过滤待上样；5)将600ml丁基疏水填料装柱后，用含40％硫酸铵的200mM硼酸盐缓冲液pH7.2平衡3000ml，平衡结束后上样，上样完毕后，继续平衡至无蛋白流出，然后用含有20％硫酸铵200mM硼酸盐缓冲液pH7.2洗脱，根据洗脱峰收集目的蛋白；6)通过SDS-PAGE检测收集液中目的蛋白的纯度，电泳结果表明纯度不低于95％(图2)，将收集液中加入4％的玉米糊精，通过喷雾干燥技术制备干粉，喷雾干燥条件为进口温度120℃，喷雾速度80ml/h。获得的肌红蛋白SDS-PAGE电泳后条带分析获得的谱图如附图1-2所示，显示条带清晰，纯度高，猪心中肌红蛋白的分子量大小约在16.7KDa左右。实施例4：TAS试剂盒的制备将实施案例1、2、3中提取获得的肌红蛋白配制TAS试剂盒。试剂1为：100mMTris缓冲液，pH7.4200μMABTS20g/L肌红蛋白1g/L叠氮钠试剂2为：30mMH2O2试剂盒检测条件为：RateA法，R1:R2:S＝250:50:5，主波长600nm，副波长405nm，读数点22-32，反应向上。实施例5：TAS试剂盒的制备将实施案例1、2、3中提取获得的肌红蛋白配制TAS试剂盒。试剂1为：100mM磷酸缓冲液，pH6.8200μMABTS10g/L肌红蛋白1g/L硫柳汞试剂2为：30mMH2O2试剂盒检测条件为：两点速率法，R1:R2:S＝210:80:10，主波长600nm，副波长405nm，读数点25-35，反应向上。实施例6：TAS试剂盒性能检测对实施例4中配置的TAS试剂盒的性能指标进行检测。1)线性范围测定：以维生素E代表抗氧化物质用于测定TAS试剂盒的线性范围。将维生素E(VitaminE，VE)用生理盐水稀释一系列倍数，通过本发明制备的TAS试剂盒测定不同稀释倍数下VE的浓度，每个点测3次，用其平均值计算线性系数。数据见表1：表1：不同稀释倍数下，抗氧化物质(VE)浓度的测定结果稀释倍数10.90.80.70.60.50.40.30.20.10测定浓度1(mM)2.562.212.031.781.551.190.950.720.500.260.07测定浓度2(mM)2.532.262.051.761.511.260.960.710.510.260.08测定浓度3(mM)2.562.312.041.701.581.291.050.780.540.230.07平均浓度(mM)2.552.262.041.751.551.250.990.740.520.250.08将表1中的测定浓度与稀释倍数进行统计学分析，获得相关线性方程为：Y＝2.502X+0.0201，R2＝0.9987，由此获得本发明试剂盒的检测线性范围为0～2.5mM，符合说明书要求的0～2.2mM。2)精密度测定：利用TAS试剂盒分别连续检测高低两个不同浓度下的Ve，检测次数为20次，计算CV值，用以表示精密度。数据如表2、表3：表2：高浓度抗氧化物质(VE)的连续检测结果根据表2，经统计学分析，高浓度VE平均测值为2.237mM，标准差为0.0615mM，CV为2.75％，变异系数符合说明书要求5％，检测精密度高。表3：低浓度抗氧化物质(VE)的连续检测结果检测次数12345678910浓度(mM)0.750.730.720.740.740.730.770.760.730.73检测次数11121314151617181920浓度(mM)0.690.680.730.790.760.710.790.70.720.72根据表2，经统计学分析，低浓度VE平均测值为0.7345mM，标准差为0.02947mM，CV为4.01％，变异系数符合说明书要求5％，检测精密度高。实施例7：TAS试剂盒性能检测对实施例5中配置的TAS试剂盒的性能指标进行检测。1)线性范围测定：用维生素E代表抗氧化物质用于测定TAS试剂盒的线性范围。将维生素E(VitaminE，VE)用生理盐水稀释一系列倍数，通过本发明制备的TAS试剂盒测定不同稀释倍数下VE的浓度，每个点测3次，用其平均值计算线性系数。数据见表1：表1：不同稀释倍数下，抗氧化物质(VE)浓度的测定结果稀释倍数10.90.80.70.60.50.40.30.20.10测定浓度1(mM)2.552.232.021.781.531.220.960.740.520.250.06测定浓度2(mM)2.562.242.011.791.551.230.970.760.500.260.07测定浓度3(mM)2.542.221.991.771.511.220.970.730.490.230.06平均浓度(mM)2.552.232.011.781.531.220.970.740.500.250.06将表1中的测定浓度与稀释倍数进行统计学分析，获得相关线性方程为：Y＝2.501X+0.008，R2＝0.9986，由此获得本发明试剂盒的检测线性范围为0～2.5mM，符合说明书要求的0～2.2mM。2)精密度测定：利用TAS试剂盒分别连续检测高低两个不同浓度下的Ve，检测次数为20次，计算CV值，用以表示精密度。数据如表2、表3：表2：高浓度抗氧化物质(VE)的连续检测结果根据表2，经统计学分析，高浓度Ve平均测值为2.235mM，标准差为0.0476mM，CV为2.13％，变异系数符合说明书要求5％，检测精密度高。表3：低浓度抗氧化物质(VE)的连续检测结果检测次数12345678910浓度(mM)0.780.730.740.690.720.760.730.740.780.7检测次数11121314151617181920浓度(mM)0.760.750.730.740.690.760.780.780.760.71根据表2，经统计学分析，低浓度Ve平均测值为0.7415mM，标准差为0.02925mM，CV为3.94％，变异系数符合说明书要求5％，检测精密度高。综上，依据本发明方法制备的TAS试剂盒，对抗氧化物质的检测线性良好、范围广，变异系数低，精密度高，可满足于机体抗氧化状态的检测。当前第1页1 2 3