一种应用在线SPE/LC‑MS/MS测定卷烟主流烟气中6种芳香胺类化合物的方法与流程

本发明属于卷烟烟气释放物有关成分分析测试技术领域，具体涉及一种应用在线固相萃取-液相色谱-串联质谱技术测定卷烟主流烟气中6种芳香胺类化合物的方法，包括邻甲基苯胺、2，6-二甲基苯胺、邻茴香胺、1-氨基萘、2-氨基萘和4-氨基联苯。

背景技术：

作为重要的有机合成原料和中间体，芳香胺类化合物广泛存在于药物、杀虫剂、偶氮染料，塑料、橡胶等工业生产中。此外，人们已从各种各样的环境物质如空气、排放的废水、食品添加剂、化妆品等中检出了各类芳香胺成分。芳香胺类化合物可通过呼吸、食入或皮肤接触等方式进入人体，能通过形成高铁血红蛋白，对人体血液系统造成损害，也可直接作用于肝细胞，引起中毒性肝损害。其中一些芳香胺衍生物还具有致癌和致突变的作用，对人类身体健康造成威胁^[1-3]。研究证实，职业暴露于2-氨基萘和4-氨基联苯的人群罹患膀胱癌和白血病的风险较高^[4]。

目前，已有多种芳香胺类化合物在卷烟烟气中被检出，如1-氨基萘、2-氨基萘、4-氨基联苯、邻甲基苯胺等^[5]。其中，邻甲基苯胺、2，6-二甲基苯胺、邻茴香胺、1-氨基萘、2-氨基萘、4-氨基联苯这6种芳香胺成分因其具有致癌性，被列入美国食品药品监督局(FDA)发布的93种“烟草制品及烟草烟雾中有害物质及潜在有害物质成分”列表中(简称HPHCs列表)^[6]。

目前，尽管芳香胺的分析检测方法很多，但常用的方法是国家标准GB/T 23358-2009(卷烟主流烟气总粒相物中主要芳香胺的测定气相色谱-质谱联用法)。该方法用剑桥滤片捕集卷烟主流烟气中的总粒相物，用盐酸溶液萃取后，经二氯甲烷洗涤、氢氧化钠还原、正己烷萃取后，使用五氟丙酸酐进行衍生化，所得溶液采用固相萃取柱纯化，浓缩后通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)定量测定芳香胺的含量。该方法利用GC-MS对主流烟气中芳香胺类化合物进行分析检测，研究对象仅为1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯和4-氨基联苯等4种化合物，且样品前处理方法繁琐费时，一次样品分析周期约3天。近几年，又陆续有2篇专利对卷烟主流烟气中芳香胺的检测方法进行了研究。其中，专利1(一种气相色谱-串联质谱检测卷烟主流烟气中芳香胺的方法，公开号：CN 102279237B)用剑桥滤片捕集卷烟主流烟气中的总粒相物，用盐酸溶液萃取后，经二氯甲烷洗涤、氢氧化钠还原、正己烷萃取后，使用五氟丙酸酐和盐酸三甲胺衍生化，浓缩后，采用气相色谱-串联质谱联用仪(GC-MS/MS)对卷烟主流烟气中芳香胺的测定。该方法对国家标准GB/T 23358-2009方法中的样品衍生化步骤进行改进，减少了样品浓缩次数，分析研究对象与国家标准GB/T 23358-2009相同(1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯和4-氨基联苯)，但仍需对样品进行繁琐费时处理(如洗涤、还原、萃取、衍生化、浓缩等)，一次样品分析周期约2天。专利2(一种液相色谱-串联质谱法检测卷烟主流烟气中10种芳香胺类化合物的方法，公开号：CN 102608232B)利用剑桥滤片和含5％HCl溶液的吸收瓶，分别捕集主流烟粒相物和气相物中的芳香胺类化合物，采用5％HCl溶液萃取滤片后，经HLB固相萃取柱纯化处理，采用液相色谱-串联质谱联用仪(LC-MS/MS)对卷烟主流烟气中10种芳香胺(1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯和4-氨基联苯、苯胺、邻、间、对-甲基苯胺、间苯二胺、间茴香胺)进行测定。该方法与前两种分析方法相比，避免了衍生化反应及液液萃取等操作，但需要人工对样品溶液进行固相萃取处理，一次样品处理周期约2小时，分析效率仍有待提高，且该方法中研究对象不是针对HPHCs列表中6种致癌性芳香胺类化合物。

综上，以上发明方法都涉及到繁琐的人工处理，检测周期长，且易引入人为误差，影响测量结果的准确性和精密性。因此，有必要研究开发一种快速、准确测定卷烟主流烟气中6种有害芳香胺类化合物的检测方法，为实现对大批量样品中芳香胺类化合物的检测提供技术支撑。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有芳香胺类化合物检测技术中样品前处理繁琐费时且易引入人为误差的不足，提供一种应用在线固相萃取-液相色谱-串联质谱技术测定卷烟主流烟气中6种芳香胺类化合物的方法。该方法能够实现样品自动、快速分析，避免了对样品进行繁琐人工处理时可能造成的人为误差，同时该方法灵敏度好、精密度高、选择性强，适用于实验室对大批量样品进行监控检测分析研究。

本发明的技术方案是：一种应用在线SPE/LC-MS/MS测定卷烟主流烟气中6种芳香胺类化合物的方法，其特征是，

(1)利用剑桥滤片和含2％甲酸溶液的吸收瓶，分别捕集主流烟气烟粒相物和气相物中芳香胺类化合物；

(2)吸收瓶的溶液中加入内标后，进入在线SPE/LC-MS/MS进行卷烟主流烟气中6种芳香胺的在线固相萃取和检测；

(3)将剑桥滤片置于收集容器中，加入2％甲酸溶液和内标，超声萃取，经膜过滤后进入在线SPE/LC-MS/MS进行卷烟主流烟气中6种芳香胺的在线固相萃取和检测；

(4)将步骤(2)和步骤(3)分别测得的各芳香胺的含量进行相加，得到卷烟主流烟气中各芳香胺的总含量。

所述内标为d₉-邻甲苯胺、d₃-邻茴香胺、d₆-2，6-二甲基苯胺、d₇-1-氨基萘及d₉-4-氨基联苯的混合内标。

所述在线固相萃取(在线SPE)，采用PRS阳离子(Bond Elute PRS，10×2.0mm，40-90μm，荷兰Spark Holland公司)萃取小柱和C18反相HD(HySphere C18HD，10×2.0mm，7μm，荷兰Spark Holland公司)萃取小柱组成的二维在线固相萃取。

萃取条件：将样品上样至PRS阳离子固相萃取小柱，依次用2％的甲酸溶液、甲醇/2％的甲酸(体积比为10:90)进行淋洗，洗脱掉样品中大部分杂质；然后用5％氨水将样品转移至C18反相HD萃取小柱，以5％氨水冲洗C18反相HD萃取小柱，可以进一步将目标分析物和第一根小柱保留下来的干扰物分开，使干扰物在目标分析物到达分析柱之前就被冲洗到废液中；净化后的溶液再进行LC-MS/MS检测。为获得最高萃取效率同时确保样品最佳的净化效果，对在线固相萃取的活化、平衡、上样、转移、洗涤、再生等参数进行优化，优化结果见表1。

所述LC分析条件：色谱柱规格100mm×3.0mm i.d.,2.7μm的Poroshell 120EC-C18，柱温30℃；流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱，条件为0～12min：98％A+2％B，12.1～24min：72％A+28％B，24.1～29min：100％B，29.1～30min：100％A；流速：200μL/min；进样体积50μL。

所述MS/MS参数：离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾电压：4500V；气帘气压力：20psi；辅助气1压力：55psi；辅助气2压力：55psi；碰撞气压力：6psi；离子源温度：500℃。各化合物的定量离子对、定性离子对、驻留时间、碰撞能量(CE)及去簇电压(DP)参见表2。

优选的，所述步骤(1)的吸收瓶中2％甲酸溶液的体积为25mL；步骤(3)中收集容器(优选250mL磨口锥形瓶)中加入2％甲酸溶液的体积为100mL，超声萃取时间为30分钟。

本发明在样品抽吸之前，按照ISO 4387:2000标准条件对样品进行平衡。

本发明在卷烟主流烟气中芳香胺的捕集过程中，卷烟抽吸采用直线式吸烟机，按照ISO3308:2000标准条件抽吸。

本发明的有益效果如下：

(1)GC-MS和GC-MS/MS方法均需要衍生化反应及液液萃取等操作(单次样品处理周期分别约为2天和3天)，LC-MS/MS方法需要人工对样品进行离线萃取净化处理(单次样品处理周期约2小时)，而本发明方法对样品进行在线固相萃取处理，然后进LC-MS/MS进行分析，不仅避免了繁琐费时的衍生化反应及液液萃取等操作，而且无需人工进行萃取净化，大大简化了样品前处理过程，提高了分析效率(单次样品处理周期约0.5小时)，并且能够在一定程度上减少繁琐的人工操作对检测结果可能造成的影响，同时该方法灵敏度好、精密度高、选择性强，能够实现样品自动和大批量分析；

(2)与现有的LC-MS/MS方法相比，本发明方法采用较易挥发的甲酸水溶液作为萃取液，有利于减少对仪器和色谱柱的污染，降低对样品分析干扰；

(3)本发明方法利用阳离子小柱(Bond Elute PRS)和反相C18小柱(HySphere C18HD)组成的二维在线固相萃取技术，基于不同的萃取机理完成对样品进行的净化，能够确保在较高的方法灵敏度下，最大程度地去除复杂样品基质中干扰物；

(4)在本发明方法定量部分，对每一个目标物都单独使用具有稳定同位素及相同或同分异构的化合物作为特定内标，基于内标物与目标物具有相同的基质萃取效率和及色谱保留行为，能够弥补萃取和前处理过程中低效和损耗，可以有效降低质谱离子化中的基质效应；

(5)研究对象不同：GC-MS和GC-MS/MS方法的研究对象均为1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯和4-氨基联苯，LC-MS/MS(离线固相萃取样品)方法的研究对象为10种芳香胺(1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯和4-氨基联苯、苯胺、邻、间、对-甲基苯胺、间苯二胺、间茴香胺)，而本发明针对的研究对象为美国FDA发布的HPHCs列表中的6种致癌性芳香胺类化合物，即邻甲基苯胺、2，6-二甲基苯胺、邻茴香胺、1-氨基萘、2-氨基萘及4-氨基联苯。

因此，本发明方法能有效完成卷烟主流烟气中6种有害芳香胺类化合物的自动、快速、客观、准确分析，极其适合于对复杂基质中超低含量目标化合物进行高通量分析。

附图说明

图1为邻甲基苯胺(o-TOL)、2，6-二甲基苯胺(2,6-DMA)、邻茴香胺(o-ASD)、1-氨基萘(1-ANP)、2-氨基萘(2-ANP)、4-氨基联苯(4-ABP)标样的多反应监测质谱(MRM)图；

图2为实施例1样品1卷烟主流烟气中邻甲基苯胺(o-TOL)、2，6-二甲基苯胺(2,6-DMA)、邻茴香胺(o-ASD)、1-氨基萘(1-ANP)、2-氨基萘(2-ANP)、4-氨基联苯(4-ABP)标样的多反应监测质谱(MRM)图；

图3为实施例1样品2卷烟主流烟气中邻甲基苯胺(o-TOL)、2，6-二甲基苯胺(2,6-DMA)、邻茴香胺(o-ASD)、1-氨基萘(1-ANP)、2-氨基萘(2-ANP)、4-氨基联苯(4-ABP)标样的多反应监测质谱(MRM)图。

具体实施方式

本发明以下将结合实施例作进一步说明：

实施例1

1.样品的制备

将平衡及筛选后的卷烟按照ISO 3308:2000规定的标准条件抽吸，采用4张剑桥滤片(φ44mm)捕集20支卷烟主流烟气中的粒相物(每张剑桥滤片捕集5支卷烟主流烟气中的粒相物)；将预先装有25mL 2％甲酸溶液的吸收瓶通过软管连接在捕集器后面，用以收集气相物。

将收集气相物的吸收瓶取下，加入0.25mL混合内标(d₉-邻甲苯胺、d₃-邻茴香胺、d₆-2，6-二甲基苯胺、d₇-1-氨基萘及d₉-4-氨基联苯)后，混合均匀，直接进Online SPE/LC-MS/MS分析。

将捕集有20支卷烟主流烟气粒相物的剑桥滤片折叠放入250mL磨口锥形瓶中，加入1.0mL混合内标和100mL 2％甲酸溶液(萃取液)，室温下超声萃取30min，经滤膜(0.22μm，聚四氟乙烯)过滤后进Online SPE/LC-MS/MS分析。

分别对气相物和粒相物的各芳香胺类化合物含量进行Online SPE/LC-MS/MS检测，二者含量相加即得卷烟主流烟气中各化合物的总含量。

混合内标液配置方法：准确称取d₉-邻甲苯胺、d₃-邻茴香胺、d₆-2，6-二甲基苯胺、d₇-1-氨基萘及d₉-4-氨基联苯各100mg置于100mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，得到浓度均为1.0mg/mL内标单标储备液。用移液枪分别准确移取上述5种单标储备液各0.10mL于100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释、定容至刻度，得到浓度为1.0μg/mL的混合内标液，备用。

2.在线固相萃取

仪器：在线固相萃取仪(Symbiosis^TM Pico，荷兰Spark Holland公司)。

选择PRS阳离子(Bond Elute PRS，10×2.0mm，40-90μm，荷兰Spark Holland公司)和C18反相HD(HySphere C18HD，10×2.0mm，7μm，荷兰Spark Holland公司)两种萃取小柱对样品进行净化处理。

首先，将样品上样到PRS阳离子萃取小柱上，先后用2％甲酸水溶液及2％甲酸水溶液和甲醇组成的溶剂洗脱掉样品中大部分杂质，然后用5％氨水将样品转移到C18HD反相萃取小柱上，用5％氨水冲洗C18HD反相萃取小柱，可以进一步将目标分析物和第一根小柱保留下来的干扰物分开，使干扰物在目标分析物到达分析柱之前就被冲洗到废液中，使目标分析物在分析柱中得到分离，并被质谱检测到。为获得最高萃取效率同时确保样品最佳的净化效果，对在线固相萃取的活化、平衡、上样、转移、洗涤、再生等参数进行优化，优化结果见表1。

表1 Online-SPE萃取条件

3.检测

经在线固相萃取的待测样品采用LC-MS/MS方法进行检测，仪器参数条件如下。

液相色谱串联质谱仪：液相色谱部分(Symbiosis^TM Pico，荷兰Spark Holland公司)，API4000+质谱仪(美国AB SCIEX)。

LC分析条件：色谱柱规格100mm×3.0mm i.d.,2.7μm的Poroshell 120EC-C18，柱温30℃；流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱，条件为0～12min：98％A+2％B，12.1～24min：72％A+28％B，24.1～29min：100％B，29.1～30min：100％A；流速：0～30min：200μL/min；进样体积50μL。

MS/MS参数：离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾电压：4500V；气帘气压力：20psi；辅助气1压力：55psi；辅助气2压力：55psi；碰撞气压力：6psi；离子源温度：500℃。

各化合物的定量离子对、定性离子对、驻留时间、碰撞能量(CE)及去簇电压(DP)参见表2。邻甲基苯胺(o-TOL)、2，6-二甲基苯胺(2,6-DMA)、邻茴香胺(o-ASD)、1-氨基萘(1-ANP)、2-氨基萘(2-ANP)、4-氨基联苯(4-ABP)标样的多反应监测质谱(MRM)图如图1所示。

表2各化合物的定量离子对、定性离子对、内标、驻留时间、碰撞能量及去簇电压

4.方法的线性及检出限

本发明中采用甲醇配制芳香胺混合母液、氘代混合内标母液，采用2％甲酸配置芳香胺标准工作溶液。标准工作溶液含内标d₉-邻甲苯胺、d₃-邻茴香胺、d₆-2，6-二甲基苯胺、d₇-1-氨基萘及d₉-4-氨基联苯，浓度均为10ng/mL。实验中分别对标准工作溶液进行LC-MS/MS分析，并以芳香胺化合物标物峰面积(y)对其浓度比(x)进行线性回归，得到各目标化合物的标准工作曲线。取最低浓度标准工作溶液，平行测定10次，计算标准偏差，3倍标准偏差为检测限，10倍标准偏差为定量限，结果如表3所示。由此可见，6种芳香胺化合物在线性范围内具有良好的线性关系，相关系数在0.99706-0.99975之间。

表3工作曲线、相关系数、方法检测限及定量限

5.回收率和精密度

对同一卷烟样品，在低、中、高三个水平上加入标样，分别平行测定3次，进行加标回收率实验，结果如表4所示，加标回收率为91.0-122.9％，该方法的回收率较好。同时进行重复性实验，同一样品连续测定6次及连续5天测定，用测定结果的相对标准偏差(RSD)表示该方法的日内精密度和日间精密度，经测定，该方法日内精密度和日间精密度分别低于6％和7％，说明该发明方法重复性好、样品稳定，适合大批量样品分析，结果见表4。

表4方法回收率、日内精密度及日间精密度

6.检测结果

根据上述的方法，本发明对2个牌号卷烟样品的粒相物和气相物分别进行检测分析，测试结果如下表5所示。

表5卷烟样品测定结果

其加标后多反应监测质谱(MRM)图分别如图2-3所示。从图2-3可以看出：相比图1，图2-3的邻甲基苯胺(o-TOL)、邻茴香胺(o-ASD)和4-氨基联苯(4-ABP)的保留时间相比标准样品具有一定幅度的偏移，分析是由于内标化合物的存在影响其保留时间。经过本发明申请人的多次检测结果的总结，在后续的检测中，可以将图2的保留时间作为各化合物的保留时间用于定性。即邻甲基苯胺(o-TOL)、2，6-二甲基苯胺(2,6-DMA)、邻茴香胺(o-ASD)、1-氨基萘(1-ANP)、2-氨基萘(2-ANP)、4-氨基联苯(4-ABP)的保留时间分别为11.15、17.81、10.05、19.82、18.18和22.69min。

实施例2

将肯塔基参考卷烟3R4F按照ISO 3308:2000规定的标准条件抽吸，每张剑桥滤片收集5支卷烟的粒相物，装有25mL 2％甲酸溶液的吸收瓶收集气相物。

然后按照实施例1的所述步骤和条件，进行样品处理与分析。进行6次平行实验和分5天测定，各个化合物测定的相对标准偏差分别在2.50～5.52％和2.24～6.69之间，说明该方法的重现性和稳定性很好。

参考文献：

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