利用低场核磁共振技术检测小鼠中体成分含量的方法与流程

本发明涉及动物体成分含量检测领域，特别涉及一种利用低场核磁共振技术检测小鼠中体液、脂肪和瘦肉含量的方法。

背景技术：

动物体内的体液、脂肪、瘦肉含量往往可以体现动物的健康状况。在已有的动物身体成分测量方法中，传统的全身化学成分分析法是测量身体成分的金标准，但是这种方法过程长、工作量大，并且需要将动物杀死，因此不能对动物进行反复的测量。

新的测定动物体成分技术，如生物电阻抗分析法、双能x射线吸收法、计算机断层扫描和磁共振成像方法等。这些方法都需要对动物进行麻醉或镇静，使实验动物保持绝对不动的状态，但是麻醉或镇静将会带来动物摄食量减少，体温降低等副作用，并且有死亡的风险。此外还有同位素稀释法和全身电导率法等，这些方法测得的数值不够准确，而且无法对身体成分的变化进行追踪研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于，针对现有技术在动物体成分检测方面的空白，提出一种利用低场核磁共振技术快速无损检测小鼠中体液、脂肪和瘦肉含量的方法，同时，保证方法简单、快速、准确、环保。

为达到上述目的，本发明提供了一种利用低场核磁共振技术检测小鼠中体成分含量的方法，包括如下步骤：

S1、选取10～30g实验小鼠若干只，作为检测样品；

S2、对步骤S1所述小鼠样品进行低场核磁共振分析，利用CPMG脉冲序列法采集核磁共振回波信号，获得回波衰减曲线数据；

所述CPMG脉冲序列参数为：90度脉宽P1：13μs，180度脉宽P2：26μs，重复采样等待时间Tw：1000-10000ms，模拟增益RG1：[10到20，均为整数]，数字增益DRG1：[2到5，均为整数]，前置放大增益PRG：[1，2，3]，NS：4，8，16，NECH：1000-10000，接收机带宽SW：100，200，300KHz，开始采样时间的控制参数RFD：0.002-0.05ms，时延DL1：0.1-0.5ms；

S3、小鼠测量：将步骤S1所述小鼠样本进行解剖，分离出小鼠全身的瘦肉，作为小鼠瘦肉检测样本，其他部分作为体液及脂肪检测样本；

分别对解剖得到的每只小鼠样本的体液及脂肪检测样本和瘦肉检测样本进行体液参数、脂肪参数和瘦肉参数的测量，获得体液、脂肪和瘦肉含量数据；

采用105℃烘干恒重法测定所述小鼠样本的体液及脂肪检测样本和瘦肉检测样本，获得步骤S1所述小鼠样本的体液含量；采用索氏提取法测定所述体液及脂肪检测样本，获得步骤S1所述小鼠样本的脂肪含量；所述瘦肉含量等于所述瘦肉检测样本中蛋白质含量、水分含量及灰分含量的总和，其中蛋白质含量由凯氏定氮法测定，水分含量由105℃烘干恒重法测定，灰分含量由550℃灼烧法测定；

所述测量小鼠样本体液含量及小鼠样本的瘦肉中水分含量的105℃烘干恒重法的具体操作为：

(1)用天平称量每只小鼠样本的体液及脂肪检测样本和瘦肉检测样本的重量；

(2)将所述体液及脂肪检测样本或瘦肉检测样本分别置于105℃烘箱中，每2h用天平检查所述体液及脂肪检测样本或瘦肉检测样本的重量，待恒重后再次用天平称量所述体液及脂肪检测样本或瘦肉检测样本的重量；计算得到所述体液及脂肪检测样本或瘦肉检测样本的水分含量；

(3)将同一小鼠样本的所述体液及脂肪检测样本和瘦肉检测样本的水分含量相加即为所述小鼠样本的体液含量。

所述测量小鼠样本脂肪含量的索氏提取法的具体操作为：

(1)将测量完体液含量的所述体液及脂肪检测样本粉碎成粉末置于石油醚中，加热回流，提取所述体液及脂肪检测样本的脂肪；

(2)采用旋转蒸发器真空蒸干石油醚，待恒重后称量所提取的脂肪重量，即为小鼠样本的脂肪含量。

所述测量小鼠样本的瘦肉中蛋白质含量的凯氏定氮法的具体操作为：

(1)取部分测量完瘦肉中水分含量的所述瘦肉检测样本进行消化，同时进行空白实验；

(2)用半凯氏定氮仪蒸馏至中性；

(3)用盐酸滴定溶液呈淡紫色，记录盐酸消耗量和空白实验盐酸消耗量，通过计算得到所述小鼠样本瘦肉中的蛋白质含量。

所述测量小鼠瘦肉中灰分含量的550℃灼烧法的具体操作为：

取部分测量完瘦肉中水分含量的所述瘦肉检测样本放在坩埚中称重，再放入550℃的马弗炉中加热6～8h，冷却后称重，得到所述小鼠样本瘦肉中的灰分含量。

S4、将所述回波衰减曲线数据与所述体液，脂肪和瘦肉含量数据通过计量学软件采用偏最小二乘回归方法(PLSR)及主成分回归法(PCR)进行拟合，建立体液，脂肪和瘦肉含量的回归模型；

S5、模型的评价：根据所述回归模型预测值与真实值的相关系数R_cal²和R_cv²、均方根误差RMSEC和预测标准差SEP对所述回归模型进行评估；

S6、测定待测样品的回波衰减曲线数据，利用已经评估的所述体液，脂肪和瘦肉含量的回归模型，对待测样品的回波衰减曲线数据进行分析，得到相应的体液，脂肪和瘦肉含量的预测值。

优选方式下，步骤S1所述实验小鼠为昆明小鼠、ICR小鼠、LACA小鼠、NIH小鼠；测量时，选择重量不同的小鼠作为模型样本。

本发明的技术创新在于：

1、本发明涉及的检测方法操作过程简单，待测小鼠样品无需前处理，重复性好，分析时间短，对小鼠无破坏，在建立好用于预测的回归模型之后对所有其他待测小鼠样品仅需要测量回波衰减曲线数据即可通过回归模型预测体液，脂肪和瘦肉含量，为非侵入式测量方法，而且可以同时测量小鼠的体液，脂肪和瘦肉含量，检测的数值准确、稳定，提高了测量效率，可以满足对活体的、未麻醉的动物进行快速的身体成分检测。

2、本发明方法不需要对动物进行麻醉或镇静，对动物没有损伤，使实验动物保持绝对不动的状态，不会给受检测的动物带来因麻醉或镇静而产生的摄食量减少、体温降低、甚至死亡的问题。

3、本发明方法对常用做实验的小鼠品种进行体成分含量模型的建立，为今后研究关于小鼠体成分含量变化的实验提供了方便。

4、同位素稀释法通过对全身总水量的计算而确定不含脂肪组织的量，从而间接获得脂肪量，这一方法的关键是假设大约73％的非脂肪组织都是水，给测量带来很大的不确定性和误差。全身电导率法，原理是利用脂肪组织基本上不导电，而水和电介质则成为良导电物质，通过测定电导率间接测得瘦肉含量，然后通过计算得到脂肪量，但是这种方法测得的数值不够准确，瘦肉量的极微小的误差会导致脂肪量很大的误差，而且无法对身体成分的变化进行追踪研究。本发明方法相对于现有同位素稀释法、全身电导率法等，测得的数值更准确，而且可对身体成分的变化进行追踪研究。

综上所述，采用核磁共振技术进行小鼠体成分分析，是一种非常有潜力的快速检测新技术。

附图说明

图1为本发明昆明鼠样品的体成分含量的回波衰减曲线；

图2为昆明鼠体液含量通过主成分回归法(PCR)建立的回归模型的预测值与真实值回归谱图；

图3为昆明鼠脂肪含量通过主成分回归法(PCR)建立的回归模型的预测值与真实值回归谱图；

图4为昆明鼠瘦肉含量通过主成分回归法(PCR)建立的回归模型的预测值与真实值回归谱图；

图5为昆明鼠体液含量通过偏最小二乘回归方法(PLSR)建立的回归模型的预测值与真实值回归谱图；

图6为昆明鼠脂肪含量通过偏最小二乘回归方法(PLSR)建立的回归模型的预测值与真实值回归谱图；

图7为昆明鼠瘦肉含量通过偏最小二乘回归方法(PLSR)建立的回归模型的预测值与真实值回归谱图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好的理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明进一步说明。

实施例1

下述实施例中所使用的小鼠，以昆明鼠为例，但不局限于昆明鼠，只要体重在10-30克均可以适用。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

具体实施步骤如下：

仪器校正：参数设置为：90度脉宽P1：13μs，180度脉宽P2：26μs，重复采样等待时间Tw：3000ms，模拟增益RG1：15，数字增益DRG1：3，前置放大增益PRG：1，NS：8，NECH：5000，接收机带宽SW：200KHz，开始采样时间的控制参数RFD：0.002ms，时延DL1：0.5ms。

样品测量：样品低场核磁分析：采用Mini MR-Rat磁共振成像分析仪对30个昆明鼠样品进行低场核磁分析，利用CPMG脉冲序列，测量昆明鼠横向弛豫时间T2，获得回波衰减曲线。如图1所示(图中给出的为典型样品的代表性曲线)。

本实施例要测出每一只小鼠样本的体液、脂肪、瘦肉含量，分别与每只小鼠的核磁数据相对应。每一只小鼠样本都需完成对其体液、脂肪、瘦肉含量的测定。先进行体液及瘦肉中水分含量的测定，再进行脂肪含量的测定；然后将经过水分含量测定的瘦肉样本分成两份，分别进行瘦肉中蛋白质含量和灰分含量的测定，然后按实验样品占小鼠肌肉总量的比例，换算出每只小鼠的瘦肉中蛋白质含量和灰分含量；最后进行计算可得到每只小鼠的体液、脂肪、瘦肉含量。

体液含量的测定方法：105℃烘干恒重法的具体操作为：

用手术刀分离昆明鼠体全身的肌肉作为昆明鼠体瘦肉检测样本，其他部分作为体液及脂肪检测样本，分别用天平称量每只昆明鼠体的体液及脂肪检测样本和瘦肉检测样本的重量；将所述体液及脂肪检测样本或瘦肉检测样本分别置于105℃烘箱中，每2h用天平检查所述体液及脂肪检测样本或瘦肉检测样本的重量，待恒重后再次用天平称量所述体液及脂肪检测样本或瘦肉检测样本的重量；计算得到所述体液及脂肪检测样本或瘦肉检测样本的水分含量；将同一昆明鼠体样本的所述体液及脂肪检测样本和瘦肉检测样本的水分含量相加，即为昆明鼠体样本的体液含量。测量结果如表1所示。

脂肪含量的测定方法：利用测定完体液含量的体液及脂肪检测样本进行脂肪含量的测定，由于在测定体液的过程中没有脂肪的损失，所以对于脂肪的测定没有影响。通过测定可分别得到30只小鼠的脂肪含量。将烘干昆明鼠粉碎，用滤纸包好，将圆底烧瓶于105℃干燥箱中干燥至恒重，将滤纸包放入抽提器中，向圆底烧瓶中加入150ml石油醚，接好抽提器，接通冷凝水，恒温水浴90℃下抽提9h，蒸发除去石油醚，圆底烧瓶105℃干燥器中干燥2h，使其彻底挥发，称量烧瓶重量，计算得出昆明鼠脂肪含量，测量结果如表1所示。

瘦肉的测定：昆明鼠瘦肉含量＝蛋白质含量+灰分含量+水分含量。

测定蛋白质含量，采用凯氏定氮法，实验样品量为0.2g左右；测定灰分实验样品量为3g左右。

凯氏定氮法测蛋白质含量：标定0.1mol/L盐酸，称量部分测定完体液含量的瘦肉检测样本，将样本消化，同时进行空白实验，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾，再加20ml浓硫酸，200℃加热，再升至420℃，液体呈蓝绿色且澄清透明，用半凯氏定氮仪蒸馏至中性，用盐酸滴定至溶液呈淡紫色，记录盐酸消耗量和空白实验盐酸消耗量，计算得昆明鼠蛋白质含量。

灰分含量：(550℃灼烧法)取索氏提取脂肪后的样品烘干称重，取部分称重，坩埚置于马弗炉中灼烧1小时称重，样品放入坩埚中，置于550℃马弗炉中灼烧8h，冷却后称重，计算得昆明鼠灰分含量。

通过昆明鼠瘦肉含量＝蛋白质含量+灰分含量+水分含量，计算得到昆明鼠的瘦肉含量，结果如表1所示。

模型的建立：将昆明鼠样品的回波衰减弛豫曲线数据与体液含量，脂肪含量和瘦肉含量分别通过计量学软件进行拟合，利用主成分回归法(PCR)和偏最小二乘回归算法(PLSR)，建立体液含量，脂肪含量和瘦肉的PCR(校正集、交互验证集)和PLSR(校正集、交互验证集)的回归模型。本实施例中所用的软件为unscrambler9.7，需要说明的是，所述计量学软件可以为任何可以进行主成分回归法(PCR)和偏最小二乘回归算法(PLSR)分析并建立回归模型的软件，不限于本实施例的举例。

通过预测残余方差和主成分数量关系图来确定建立模型所需的最佳主因子数。如表2所示的PCR回归模型预测体液含量，脂肪含量和瘦肉含量模型所需的最佳主因子数分别为7，8和9。

表1 昆明鼠体成分含量

表2 昆明鼠体成分含量PCR模型的参数

30只待测昆明鼠(年龄6-8周，购自大连医科大学实验动物中心)样品体液、脂肪和瘦肉含量的测定：对待测昆明鼠样品进行低场核磁共振，获得回波衰减曲线数据，通过利用已经建立的体液，脂肪和瘦肉含量PCR和PLSR回归模型，对待测昆明鼠样品的回波衰减曲线数据进行分析，得到相应的体液，脂肪和瘦肉含量的预测值。

如图2所示昆明鼠体液含量的PCR回归模型，校正集和交互验证集相关系数R_cal²和R_cv²分别为0.9664，0.9406。如图3昆明鼠脂肪含量的PCR回归模型，校正集和交互验证集相关系数R_cal²和R_cv²分别为0.9707，0.9304。如图4昆明鼠瘦肉含量的PCR回归模型，校正集和交互验证集相关系数R_cal²和Rcv2分别为0.9937，0.9850。如表3所示PLSR预测昆明鼠体液含量，脂肪含量和瘦肉含量的回归模型所需的最佳主因子数分别为6，7和7。如图5所示昆明鼠体液含量的PLSR回归模型，校正集和交互验证集相关系数R_cal²和R_cv²分别为0.9769，0.9429。如图6所示昆明鼠脂肪含量的PLSR回归模型，校正集和交互验证集相关系数R_cal²和R_cv²分别为0.9913，0.9544。如图7所示昆明鼠瘦肉含量的PLSR回归模型，校正集和交互验证集相关系数R_cal²和Rcv2分别为0.9973，0.9802。

表3 昆明鼠体成分含量PLSR模型的参数

模型的评价：表2显示了昆明鼠体液，脂肪和瘦肉含量PCR回归模型的评价结果。体液的PCR校正集回归模型和交互验证集的结果相近，相关系数R_cal²和R_cv²均大于0.94，均方根误差RMSEC和预测标准差SEP分别为0.5275和0.6674，均较小，利用PCR模型预测昆明鼠体液含量误差较小(表4)，说明低场核磁共振方法结合PCR回归模型可以准确地预测昆明鼠体液含量。脂肪的PCR回归模型相关系数R_cal²和R_cv²均大于0.93，均方根误差RMSEC和SEP分别为0.1071和0.1576，均较小，利用PCR模型预测昆明鼠脂肪含量误差较小(表5)，说明低场核磁共振方法结合PCR回归模型可以准确地预测昆明鼠的脂肪含量。瘦肉的PCR回归模型相关系数R_cal²和R_cv²均大于0.98，均方根误差RMSEC和SEP分别为0.1876和0.2803，均较小，利用PCR模型预测昆明鼠瘦肉含量误差较小(表6)，说明低场核磁共振方法结合PCR回归模型可以准确地预测昆明鼠的瘦肉含量。表3显示了昆明鼠体液，脂肪和瘦肉含量PLSR回归模型的评价结果。体液的PLSR回归模型校正集和交互验证集的结果相近，相关系数R_cal²和R_cv²均大于0.94，均方根误差RMSEC和预测标准差SEP分别为0.4436和0.6604，均较小，利用PLSR模型预测昆明鼠体液含量误差较小(表7)，说明低场核磁共振结合PLSR回归模型可以准确地预测昆明鼠的体液含量。脂肪的PLSR预测模型相关系数R_cal²和R_cv²均大于0.95，均方根误差RMSEC和SEP分别为0.0583和0.1283，均较小，利用PLSR模型预测昆明鼠脂肪含量误差较小(表8)，说明低场核磁共振方法结合PLSR回归模型可以准确地预测昆明鼠的脂肪含量。瘦肉的PLSR预测模型相关系数R_cal²和R_cv²均大于0.98，均方根误差RMSEC和SEP分别为0.1239和0.3264，均较小，利用PLSR模型预测昆明鼠瘦肉含量误差较小(表9)，说明低场核磁共振方法结合PLSR回归模型可以准确地预测昆明鼠的瘦肉含量。

表4 昆明鼠体液PCR模型预测

表5 昆明鼠脂肪PCR模型预测

表6 昆明鼠瘦肉PCR模型预测

表7 昆明鼠体液PLSR模型预测

表8 昆明鼠脂肪PLSR模型预测

表9 昆明鼠瘦肉PLSR模型预测

综上，通过对回归模型的验证，可以看出采用本发明的方法建立的用于预测昆明鼠体液，脂肪和瘦肉含量的回归模型，无论是采用主成分回归法(PCR)还是采用偏最小二乘回归算法(PLSR)进行拟合，都可以准确地用于预测昆明鼠的体液，脂肪和瘦肉含量，对待测昆明鼠样品无破坏，操作简便，可提高检测速度。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。