动物组织中卡巴氧和喹乙醇代谢物残留量的检测方法与流程

本发明涉及药物残留检测领域，具体涉及一种动物组织中卡巴氧和喹乙醇代谢物残留量的检测方法。

背景技术：

卡巴氧 (carbadox)和喹乙醇 (olaquindox)同属喹噁啉类化合物, 该类药物具有抑菌作用, 添加在饲料中可提高禽畜的消化能力和免疫力, 促进其生长发育。但二者均具有潜在的致畸变、致癌作用, 其代谢物也可能带来健康风险，因此许多国家将卡巴氧和喹乙醇列为对食用动物禁用或限用的药物, 由于二者的原药在动物组织内代谢迅速，而相应的代谢产物喹噁啉-2-羧酸 ( QCA)和 3-甲基-喹噁啉-2-羧酸 (MQCA)则相对稳定, 因此通常将这 2个代谢产物作为残留分析和监控的目标物。

目前已有关于检测动物组织中卡巴氧和喹乙醇代谢物残留量的报导和标准，但其灵敏度和准确性均不理想，无法满足日益严格的残留限量要求。

技术实现要素：

针对以上技术现状，本发明的目的是提供一种高灵敏度和准确性的动物组织中卡巴氧和喹乙醇代谢物残留量的检测方法。

本发明采用以下技术方案：

一种动物组织中卡巴氧和喹乙醇代谢物残留量的检测方法，其步骤包括：在样品中加入内标工作液，用偏磷酸-甲醇溶液提取样品，提取液中加入乙酸乙酯萃取，分离上层乙酸乙酯层，旋蒸至干，用甲醇-甲酸溶液定容溶解残渣，过0.22μm滤膜，用液相色谱-串联质谱仪进行定性和/或定量检测。

所述内标工作液为喹噁啉-2-羧酸-d4的甲醇溶液，浓度为100 ng/mL。

所述偏磷酸-甲醇溶液中偏磷酸的浓度为50g/L，甲醇的体积浓度为20%。

所述甲醇-甲酸溶液为无水甲醇与0.5%（v/v）甲酸溶液按照体积比1：1的比例混匀制得。

优选地，用偏磷酸-甲醇溶液提取样品2次，合并提取液。

优选地，提取液用乙酸乙酯萃取2次，合并上层乙酸乙酯层。

所述液相色谱条件为：

a) 色谱柱：Thermo C18，150 mm×2.1 mm (内径)，粒度5 μm；

b) 柱温：30℃；

c) 进样量：50μL；

d) 流动相组成及梯度洗脱条件如下：

；

所述质谱条件为：

a) 离子源：电喷雾离子源；

b) 扫描模式：正离子模式(ESI+)；

c) 检测方式：多反应监测 (MRM)；

d) 电喷雾电压 (ESI) ：4000 V；

e) 碰撞气：高纯氮气；

f) 碰撞气压力：1.5 mTorr；

g) 离子源温度：450℃。

所述定性检测为：用空白样品基质溶液配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液，将样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过以下范围的，则判定样品中存在对应的待测物：相对离子丰度>50%的，相对误差不超过±20%；20%<相对离子丰度≤50%的，相对误差不超过±25%；10%<相对离子丰度≤20%的，相对误差不超过±30%；相对离子丰度≤10%的，相对误差不超过±50%；

所述定量检测为：以分析物和内标物的峰面积比为纵坐标，以分析物和内标物的浓度比为横坐标，作标准工作曲线，并作标准线性回归方程，用标准工作曲线按内标法定量，样品溶液中待测物的响应值均应在标准线性回归方程的线性范围内。

具体地，本发明方法的步骤为：准确称取5 g样品于50 mL离心管中，加入100µL内标工作溶液，加入15 mL偏磷酸-甲醇溶液，均质2 min，10000 r/min离心10 min，将上清液转移到另一个50 mL聚丙烯离心管中；在残渣中再加入10.0 mL偏磷酸-甲醇溶液，重复上述操作，合并上清液，加15 mL乙酸乙酯，涡旋混匀2min，6000 r/min离心5 min，取上层乙酸乙酯层于鸡心瓶中，再加15 mL乙酸乙酯，重复上述操作，合并乙酸乙酯层，于45℃旋转蒸发至干，用1 mL甲醇-0.5%甲酸溶液定容溶解残渣，过0.22 μm滤膜，用液相色谱-串联质谱仪进行定性和/或定量检测。

本发明的优点和积极效果在于：

本发明的样品处理方法简单，操作成本低，喹噁啉-2-羧酸和3-甲基喹噁啉-2-羧酸测定低限为1µg/kg，在2 ng/mL -200 ng/mL范围内符合线性关系，线性相关系数r＞0.99，平均回收率范围为82.71%～121.09%，相对标准偏差（RSD）在4.07%～9.51%之间（n=6），表明本发明方法准确度和灵敏度满足检测要求。

附图说明

图1为QCA、QCA-d4和MQCA标准物质(5ng/mL)的多反应监测色谱图；

图2为鸡肉阳性样品中待测物多反应监测色谱图。

具体实施方式

下面用具体实施例来对本发明的技术方案进行详细说明。

1、试样制备

从市场上购买兔肝和鸡肉样品，用微型粉碎机粉碎成均匀样品，用于检测。

2、测定步骤

准确称取5 g（精确到0.01 g）动物组织样品于50 mL离心管中，加入100µL内标工作溶液，加入15 mL偏磷酸-甲醇溶液，均质2 min，离心10 min(10000 r/min)，将上清液转移到另一个50 mL聚丙烯离心管中；在残渣中再加入10.0 mL偏磷酸-甲醇溶液，重复上述操作，合并上清液，加15 mL乙酸乙酯，涡旋混匀2min，离心5 min(6000 r/min)，取上层乙酸乙酯层于鸡心瓶中，再加15 mL乙酸乙酯，重复上述操作，合并乙酸乙酯层，于45℃旋转蒸发至干，用1 mL甲醇-0.5%甲酸溶液定容溶解残渣，过0.22 μm滤膜，上机待测。

以上步骤中用到的试剂的配制：

内标工作溶液：精确量取适量喹噁啉-2-羧酸-d4标准物质，用甲醇定容，配成100 ng/mL的标准工作液，在4℃保存。

偏磷酸-甲醇溶液：称取50 g偏磷酸加入适量水加热溶解，加入200 mL甲醇，用水溶解至1000mL。

甲醇-0.5%甲酸溶液：取500 µL甲酸加入100 mL水，混匀，制得0.5%甲酸溶液，量取50 mL甲醇与50 mL 0.5%甲酸溶液，混匀。

3、测定

（1）色谱条件

a) 色谱柱：Thermo C18 150 mm×2.1 mm (内径), 粒度5 μm；

b) 柱温：30℃；

c) 进样量：50μL；

d) 流动相组成及梯度洗脱条件见表1：

表1 流动相组成及梯度洗脱条件

QCA和MQCA标准物质(5ng/mL)多反应监测色谱图参见图1。

（2）质谱参考条件

a) 离子源：电喷雾离子源；

b) 扫描模式：正离子模式(ESI+)；

c) 检测方式：多反应监测 (MRM)；

d) 电喷雾电压 (ESI) ：4000 V；

e) 碰撞气：高纯氮气；

f) 碰撞气压力：1.5 mTorr；

g) 离子源温度：450℃

i) 母离子、子离子及其他参数见表2。

表2 分析物的测定条件

* 为定量离子。

（3）定性测定

用空白样品基质溶液配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液（现用现配），如果样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。

表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许误差

（4）定量测定

以分析物和内标物的峰面积比为纵坐标，以分析物和内标物的浓度比为横坐标作标准工作曲线，做标准线性回归方程。用标准工作曲线按内标法定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。结果如表4所示：

表4 兔肝和鸡肉中待测物的线性范围、线性方程和相关系数

（5）结果计算

试样中每种化合物残留量按式（1）计算，计算结果需扣除空白值。

（1）

式（1）中：

X —— 试样中待测化合物的残留量，单位为微克每千克（µg/kg）；

C—— 从基质标准工作曲线上得到的待测化合物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

V—— 样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；

m—— 最终样液代表的试样质量，单位为克（g）。

（6）实际样品检测结果

以上样品的检测结果见表5。

表5实际样品检测结果

鸡肉阳性样品中待测物多反应监测色谱图见图2。

（7）回收实验

在不含分析物的动物组织样品中做加标回收实验，加标水平为1 µg/kg、2 µg/kg、4 µg/kg，分别为检测低限、检测低限的2倍和4倍。平均回收率范围为82.71%～121.09%，相对标准偏差（RSD）在4.07%～9.51%之间（n=6），加标回收率的测定结果见表6，结果表明方法准确度和灵敏度满足检测要求。

表6 兔肝和鸡肉中喹噁啉-2-羧酸（QCA）和3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）的添加回收率和精密度

。

以上仅为本发明的较佳实施方式，而非其可实施方式的穷举，其同样可以用于其他动物组织中QCA和MQCA的检测，检测结果与本实施例中所列举的动物组织相当。