喹乙醇代谢物残留快速检测试纸条的制作方法
【专利摘要】本发明试纸条属于食品安全快速检测领域。试纸条包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，结合物释放垫的部分区域覆盖于样品吸收垫之下。在反应膜上包被有喹乙醇代谢物-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠IgG构成的质控线；结合物释放垫包被有喹乙醇代谢物的胶体金标记物。该试纸条可以延长检测结果观察时间，样品吸收垫也可以将检测液充分吸收与金标抗体完全接触而充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差。还可以防止检测样本中的一些干扰成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。
【专利说明】喹乙醇代谢物残留快速检测试纸条
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种喹乙醇代谢物残留快速检测试纸条，属于食品安全快速检测领域。
技术背景
[0002]喹乙醇是一种具有促生长作用的药物性添加剂，具有抗菌与蛋白同化作用，兼有促进生长作用。对革兰氏阴性菌如巴氏杆菌、鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌及变形杆菌等作用较强，对革兰氏阴性菌如金黄色葡萄球菌、链球菌等及密螺旋体亦有抑制作用。可促进蛋白质同化，增加瘦肉率，促进畜禽生长，提高饲料转化率，广泛用于猪、牛、鸡、羊的促进生长，抗菌治病和水生动物疾病的防治。用于饲料中，可通过胃肠系统的作用，提高饲料利用率。由于具有致突变和光敏毒性大多数国家禁止使用该药。由于喹乙醇曾经的广泛使用和较大危害性对其进行残留监控十分必要。喹乙醇本身不稳定，在动物体内能够在短时间内代谢；其在动物体内有十多种代谢产物，其中3-甲基喹恶啉-2-羧酸(MQCA)是主要代谢物在体内相对稳定是国家食品法典委员会认定的标示残留物。
[0003]目前文献报道的MQCA残留分析可以采用HPLC、HPLC — MS/MS法分析测定，这些方法中一般都是先水解、再过固相萃取柱净化后上机测试，普遍存在检出限高、回收率较低和操作繁琐、耗时长的缺点，不适应现场大量样本的筛查。本研究运用免疫分析方法对喹乙醇及其代谢物进行检测；不仅能够灵敏快速地对大量样本进行检测及筛查，而且有助于质检机构更准确、有效地检测喹乙醇代谢物，更好地管理、利用喹乙醇避免含喹乙醇药物残留的水产品在国内市场流通；有效地防止国内含有喹乙醇药物残留的动物源食品进入国际市场而引起国际间贸易争端；同时也可防止国外不合格产品进入国内。对保障人体健康、提高人民生活质量，维护社会安定等具有重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的:研制出特异、敏感、快速、简便的喹乙醇代谢物残留快速检测试纸条。
[0005]本发明的技术方案:
一种喹乙醇代谢物残留快速检测试纸条，底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护膜固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为纤维层，吸附金标抗体纤维层，纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联喹乙醇代谢物的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“II”。支撑层是用不吸水的硬质塑胶片条或硬纸条制成。测试端纤维层用玻璃棉、或尼龙膜、或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、或聚酚膜制成，优选玻璃棉。吸水材料层用吸水纸制成。纤维素膜层用硝酸纤维素膜、或纯纤维素膜，或梭化纤维素膜制成。金标抗体纤维层用吸附喹乙醇代谢物的金标抗体玻璃棉，喹乙醇代谢物金标抗体为胶体金标记喹乙醇代谢物的单克隆抗体或多克隆抗体，偶联喹乙醇代谢物的载体蛋白溶液为喹乙醇代谢物与载体蛋白偶联的复合溶液。在测试端吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0.5 Cm处。偶联喹乙醇代谢物的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA ),或为鸡卵清白蛋白(OVA),或为铁蛋白，或为血蓝蛋白。
[0006]本发明的喹乙醇代谢物残留快速检测试纸条具有以下优点:
(1)特异性强，敏感性高。该试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸条具有较高的特异性和敏感性；
(2)操作简便、快速。使用本发明试纸条时无需任何其它试剂，只需滴加100μ I左右待检样品于样品垫上，在5分钟内即可判定检测结果；
(3)结果显示形象、直观、准确。本测试纸条以显示红棕色“I”及“II”印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色“I”印迹表示在被检测样品液中含有喹乙醇代谢物，两条棕红色“ II ”印迹表示在被检样品中不含喹乙醇代谢物，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判；
(4)成本低，投资少。使用快速检测试纸条，不需另配仪器设备及其它试剂，随时随地进行检测，费用低廉，可节省大量贵重仪器及设备费用；
(5)应用范围广，便于推广应用。本发明快速检测试纸操作简单，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1为喹乙醇代谢物残留快速检测试纸条结构示意图(其中1、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6、质控线；7、底板)。
[0008]图2为喹乙醇代谢物残留快速检测试纸条俯视结构示意图(其中8-1和8-2是覆盖在试纸卡两端的保护膜，9为标记线)。
[0009]图3为喹乙醇代谢物快速检测试纸卡阴性(图3a )、阳性(图3b )、无效(图3c)显色示意图，其中T为质控区，C为检测区。
【具体实施方式】
[0010]制备喹乙醇代谢物残留快速检测试纸条，首先需制备偶联喹乙醇代谢物的载体蛋白和金标抗体，从而制备检测印迹和金标抗体纤维；其次需制备羊抗或兔抗小鼠IgG抗体，用于制备对照印迹。
[0011]1.喹乙醇代谢物3-甲基-喹啉-2-羧酸(MQCA)合成
(1)硅胶薄层板的制作
取硅胶12 g，溶解在40 mL0.5%质量浓度的轻羟甲基纤维素钠溶液中，用玻璃棒充分搅拌成糊状，超声波振荡I分钟，均匀涂布在多块0.3X8 cm玻璃板上，置于阴凉处自然干燥后，放入105°C的烘箱内活化I小时，所得硅胶薄层板置十干燥箱中备用；
(2)3-甲基-2-乙酰喹啉的制取 ①称取6g的乙酰甲喹，加四氢呋喃160 mL, 30 mL氯仿，30 mL蒸馏水，微微加热溶解，每隔30分钟加入6 g的低亚硫酸钠，并取样进行薄层色谱分析，过程中，当水相中有过多白色沉淀时注意补水，整个反应温度控制在70°C ；
②点样与展开:吸取反应液Iμ L，点十硅胶薄层板下端I cm处，点样结束，吹干，将板放入层析液缸中，层析液是乙酸乙酯/30°C -60°C石油醚,体积比I 展开层析至5.5 cm处,取板,吹干溶剂；
③显色:将板置十紫外分析仪中，在254nm波长处观察；当薄层层析板上只剩一个点时，有机相呈明显深紫色并不再变化后，反应结束，将反应液静置分层，取有机相，旋转蒸发除去有机溶剂，加入预先准备好的60 mL冰水，静置一段时间后，抽滤，得到黄褐色样品，86°C热蒸馏水重结晶三次，放真空干燥箱内干燥，得到3-甲基-2-乙酰喹啉，备用；
(3)3-甲基-喹啉-2-羧酸的制备
取0.5 g的3-甲基-2-乙酰喹啉，0.4 g聚乙二醇2000，加入60 mL蒸馏水和3mL 二氧六环，混合，缓慢加热溶解，慢慢提高温度至液体沸腾，加入5 mL次氯酸钠，用淀粉碘化钾试纸监测，变蓝，当试纸不再变蓝时需再次加入5 mL次氯酸钠，反复用淀粉碘化钾试纸监测，直到反应液呈明显淡黄色并不再变色为止，反应结束后，滴加一定剂量的亚硫酸钠，中和反应中过剩的次氯酸钠，同样用淀粉碘化钾试纸检测，直到试纸不再变蓝，之后将反应液放入事先准备好的冷水浴中，使其快速冷却，，再滴加浓盐酸，使PH值在2-3之间，冷水浴静置，有白色晶体沉出，抽滤，得到喹乙醇代谢物3-甲基-喹啉-2-羧酸(MQCA)。
[0012]2.喹乙醇代谢物半抗原的合成
(1)将Img 3-甲基喳琳-2-梭酸溶解于6 mL的四氢呋喃，加入70 μ L的三丁胺，在-2°C的冰浴中搅拌半小时，再加入140 UL的氯甲酸异丁酯，继续搅拌I小时，制备成A液；取I mg氨基乙酸，溶解于5 mL的0.05 mol/L, pH9.6碳酸钠缓冲溶液中，制备成B液。将B液加入到A中，继续搅拌反应2小时。停止反应后，加入6 mL的二氯甲烷，萃取，取有机相；
(2)取硅胶粉，浸泡于展开剂(氯仿:乙酸乙酯:乙酸13:6:1)中，填装于柱体积为60mL的玻璃层析柱，平衡后，加入上述步骤制备的有机相，柱层析，收集所需组分，旋转蒸发，取沉淀，真空干燥，即得喹乙醇代谢物半抗原，密封避光4°C保藏。
[0013]3.喹乙醇代谢物半抗原与载体蛋白的偶联
(1)包被原的制备:
①取制得的喹乙醇代谢物半抗原和3-甲基喹啉-2-羧酸各Img,分别溶解于3 mLN，N-二甲基甲酰胺，4°C搅拌，加入31 μ L的三丁胺，室温搅拌半小时，再加入35 μ L的氯甲酸异丁酯，4°C继续搅拌I小时,制备成A液；另外,分别取0.02 mg的0VA,溶解于3 mL的0.05 mol/L, pH9.6碳酸钠缓冲溶液中，制备成B液；
②将A液缓慢滴加于反应液B中，搅拌反应，4°C过夜。次日，离心，去沉淀，将上清液置于透析袋中，超纯水透析3天，每8小时换一次透析液。透析后，液体贮于0°C备用；
(2)免疫原的制备:
①分别取制得的喹乙醇代谢物半抗原以及3-甲基喹啉-2-羧酸各I mg，分别溶解于3mL 二氧六环-N, N一二甲基甲酞胺(2:1, v/v), 4°C搅拌,加入20.6 mg DCC和11.5 mgNHS，继续搅拌，制备成A液；另外，分别取0.02 mgBSA溶解于3 mL的0.05 mol/L, ρΗ9.6碳酸钠缓冲溶液，制备成B液；
②将A液缓慢滴加于反应液B中，搅拌反应，4°C过夜。次日，离心，去沉淀，将上清液置于透析袋中，超纯水透析3天，每8小时换一次透析液。透析后，液体贮于0°C备用。
[0014]4.抗喹乙醇代谢物单克隆抗体的制备
(1)动物免疫:将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为80μ g/只，使其产生抗血清；
(2)细胞融合和克隆化:小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按7:1比例(数量配比)与SP2/o骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
(3)细胞冻存和复苏:将前述单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成IX IO6个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；
(4)单克隆抗体的生产与纯化:将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5 mL/只，7天后腹腔注射林喹乙醇代谢物的单克隆杂交瘤细胞株5X IO7个/只，7天后采集腹水。用辛酸一饱和硫酸铵法进行腹水纯化，得到单克隆抗体，于-20°C保存。
[0015]5.喹乙醇代谢物金标抗体和金标抗体玻璃棉的制备
以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在5(Tl00 mL沸腾的0.01~0.05%氯金酸水溶液中加入2~4 mL的0.5~2%柠檬酸三 钠溶液，获得直径15 nm左右的胶体金。以0.1 mol/L的K2CO3调胶体金pH至8.5^9.5，置于以1:1000-2000的标记比将待标记的喹乙醇代谢物单克隆抗体加入ΡΗ8.5~9.5的金溶胶中，标记10 min后，加20%PEG 10000至终浓度0.05%, 4°C、1500~3000 rpm离心20 min,除去未结合的胶体金颗粒,4°C, 15000 rpm离心I h,弃上清,获初步纯化金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获喹乙醇代谢物得胶体金标记抗体。将1:(100-500 )稀释的胶金标记抗体吸附于精制玻璃棉中，4°C低温真空干燥，制备喹乙醇代谢物金标抗体玻璃棉。
[0016]6.羊抗或兔抗小鼠IgG的制备
以饱和硫酸铵提取小鼠血清IgG，取1份小鼠血清加2份PBS (pH 7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵混匀，置4°C冰箱2 h, 40C，1200 r/min离心15 min，弃上清；以适量PBS (pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵至终浓度33%，置4°C冰箱2h，4°C，1200 r/min离心15 min,弃上清，以少量PBS印H7.2)溶解沉淀，置4°C冰箱内用PBS (pH7.2)过夜透析，换液2~3次，4°C，12000 r/min离心15 min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以50-100 μ g/kg体重(小鼠血清IgG)经皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3次，末次免疫10天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1:2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵提取羊抗或兔抗小鼠IgG (方法与提取小鼠血清IgG相同，不重述)，用于喹乙醇代谢物快速检测试纸条对照显示印迹的制备。
[0017]7.喹乙醇代谢物快速检测试纸条反应原理
(I)当待检样品溶液滴入试纸条加样孔后，样品溶液因硝酸纤维素膜载体的毛细管作用向另一端扩散。在移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫胶体金的颜色显示出来。如果样品溶液含有喹乙醇代谢物残留,喹乙醇代谢物先和胶体金颗粒上的抗体反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的喹乙醇代谢物占据而无法与检测线上喹乙醇代谢物抗原结合，不能显示检测印迹，而羊抗鼠IgG抗体则可与金标抗体结合，质控区显色，形成一条红色对照印迹“ I ”，呈一条印迹为阳性；相反样本溶液中无喹乙醇代谢物则不能阻止金标抗体与纤维素膜上喹乙醇代谢物抗原偶联载体蛋白检测印迹结合，检测区显示红色印迹“ I ”，同样羊抗鼠IgG抗体也与金标抗体结合，质控区也显示红色对照印迹“ I ”，形成两条红线“II”阴性标记，如果纤维素膜上没有红色标记显示，则试纸卡无效；
(2)喹乙醇代谢物残留快速检测试纸条的结构:参见图1、图2。图中I为样品吸收垫，用玻璃棉制成，2为结合物释放垫层，根据上述【具体实施方式】4中所述的制备方法，制备吸附有喹乙醇代谢物单克隆抗体的金标抗体纤维层，3为反应膜层，采用硝酸纤维素膜，4为吸水材料层，用吸水滤纸制成，将编号1，2，3，4各层从左至右依次粘贴固定在塑胶条7上，各层交界处纤维互相交叉渗透。5为用偶联喹乙醇代谢物的卵清蛋白(OVA)溶液印上检测印迹“ I ”，6为用羊抗小鼠IgG溶液印上对照印迹“ I ”，两印迹平行排列形成组合印迹带“ II ”。8-1为覆盖在样品吸收垫层I和金标抗体纤维层2上面的测试样品端白色保护膜，在I和2交界处对应保护膜8-1位置上偏向于样品吸收垫一侧0.5 cm处印有标记线9，9的右端印有箭头及max字样，滤纸层4为吸水层(手柄端)上覆盖有其它颜色(如黄色)保护膜8-2。
[0018]8.检测样品液的制备:
(1)准确称取2.0±0.05 g均质过的组织样本于50 mL离心管中；
(2)加入乙酸乙酯8mL，立即涡旋5 s使基质分散；
(3)立即加入1.5 mol/L HCl溶液4 mL,立即润旋3 min ;室温4000 r/min,离心5 min ；
(4)取上层乙酸乙酯5mL于另一 10 mL离心管中，加入食盐水3 mL，涡旋30 S，静止分
层；
(5)取上层乙酸乙酯4mL于另一 10 mL离心管中，40?50 °C水浴氮气吹干；
(6)用ImL正已烷溶解残留物，涡旋I min后，再加入500 μ L 0.02Μ PBS缓冲液，振荡混合30 s ；
(7)去除上层正己烷相以及两相(正己烷相和水相)之间的泡沫或者胶状物，取下层水相液体进行检测。(注意:取下层水相时应小心，不能带入正己烷，否则影响实验结果)。
[0019]9.检测操作方法:从包装袋中取出试纸条，用滴管吸取待检溶液，在加样孔中滴入3滴(约100 μ L)，加样后开始计时，结果应在3-5分钟读取，其他时间判读无效。
[0020]10.检测结果判断:如果在纤维素膜上有一条红棕色标记“ I ”显示，检侧结果呈阳性，表示在被检测样品液中含喹乙醇代谢物(如图3 b所示)，含量超过国家残留标准的产品不能在市场上流通；如果喹乙醇代谢物快速检测试纸条上的纤维素膜上出现两条红棕色标记“II”，检测结果呈阴性，表示待检样品中不含喹乙醇代谢物成份(如图3 a所示)，如未出现C线，可能操作不当或试剂板已失效(如图3 c所示)。
【权利要求】
1.一种喹乙醇代谢物残留快速检测试纸条，含有底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护层固定在吸附层上，其特征是:吸附层从测试端依次为纤维层、吸附金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联喹乙醇代谢物的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，有用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“ II ”。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:支撑层是用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:测试端纤维层用玻璃棉、或尼龙膜、或聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜制成。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:吸水材料层用吸水纸制成。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:纤维素膜层用硝酸纤维素膜、或纯纤维素膜、或羧化纤维素膜制成。
6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:金标抗体纤维层用吸附喹乙醇代谢物的金标抗体玻璃棉，喹乙醇代谢物金标抗体为胶体金标记的喹乙醇代谢物单克隆抗体或多克隆抗体，偶联喹乙醇代谢物的载体蛋白溶液为喹乙醇代谢物与载体蛋白偶联的复合溶液。
7.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:在测试端吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0.5 cm处。
8.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:偶联喹乙醇代谢物的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，或为鸡卵清白蛋白(OVA )，或为铁蛋白，或为血蓝蛋白。
【文档编号】G01N33/558GK103792355SQ201210432966
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年11月4日 优先权日:2012年11月4日
【发明者】杜道林, 邢海龙 申请人:江苏维赛科技生物发展有限公司