本发明属于医药领域，具体涉及中成药风寒感冒颗粒HPLC特征图谱的构建方法。
背景技术：
：风寒感冒颗粒是由麻黄、葛根、紫苏叶、防风、桂枝、白芷、陈皮、苦杏仁、桔梗、甘草、干姜等十一味中草药组成。主要功能为解表发汗，疏风散寒。用于感冒身热，头痛，咳嗽，鼻塞，流涕等症。现执行质量标准收载于中成药部颁标准，标准号为WS3-B-0045-89，标准中未收载薄层色谱鉴别及含量测定等质量控制方法。由于没有对产品的中间体、成口进行质量监控的有效手段，产品质量不能得到科学的监控，不同厂家生产出的样品间及批间质量差异较大，导致临床应用疗效差异也较大。为了提高风寒感冒颗粒药品的质量，已经对全方进行了质量检测方法研究，但因中药复方制剂中药味较多成分复杂不易分离鉴定等特点，仅能建立起几种专属性强的定性定量检测方法对方中个别成分进行监控，虽然现有技术风寒感冒颗粒的检测方法(专利号：CN103267824B)中对方中麻黄、桔梗进行了定性和定量检测，但只能反映出制剂中麻黄、桔梗所含成分的质量情况，并不能体现药品的整体质量情况。到本发明中我们对风寒感冒颗粒进行了HPLC特征图谱试验研究，建立了特征图谱的质量检测方法，并对所建立方法进行了精密度、重复性等方法学验证试验，结果表明本发明中检测方法稳定可行。本发明克服了风寒感冒颗粒现在执行标准中缺少质量检测方法的不足，以及现有技术中检测方法只能反映极少药物成分质量情况的片面性，建立的特征图谱测定方法是风寒感冒颗粒质量控制方法的有效补充，能反映出所含化学成分的种类和数量，能有效表征其质量，有利于全面控制产品的质量。技术实现要素：本发明的目的是提供中成药风寒感冒颗粒的HPLC特征图谱的构建方法，该方法包括以下步骤：(1)参照物溶液的制备：取葛根素对照品适量，精密称定，加30～100％甲醇制成每1ml含40～60μg的溶液。(2)供试品溶液的制备:取风寒感冒颗粒研细，取约2～5g，精密称定，精密加入30～100％甲醇50～100ml，称定重量，超声处理30～60分钟，待溶液冷却至室温，用30～100％甲醇补重，摇匀，用0.22～0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。(3)色谱条件：采用ZORBAXSB-C18色谱柱(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；流动相为以乙腈-0.1％磷酸溶液为3～70：97～30的混合溶液；体积流量0.5～1.5ml/min；DAD检测器，波长为190～250nm；柱温25～45℃，理论板数均不低于10000。(4)测定：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5～20μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到风寒感冒颗粒的HPLC特征图谱。本发明的HPLC特征图谱的最佳构建方法如下：(一下技术方案中记载的各物质的用量或用量范围，旨在表明各物质间的用量比例关系，并不限定在记载的具体数量上)优选地，步骤(1)所述参照物溶液浓度为每1ml50％甲醇含50μg葛根素对照品。优选地，步骤(2)所述供试品溶液的制备步骤如下：取风寒感冒颗粒研细，取约2g，精密称定，精密加入50％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。优选地，步骤(3)所述流动相为以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱。梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～20min，A相：3％、B相：97％；20～35min，A相：3～9％、B相：97～91％；35～60min，A相：9～19％、B相：91～81％；60～85min，A相：19～50％、B相：81～50％；85～90min，A相：50～70％、B相：50～30％；90～100min，A相：70～3％、B相：30～97％；100～110min，A相：3％、B相：97％。按照前述方法构建15批中成药风寒感冒颗粒的HPLC特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件生成由8个共有峰构成的对照特征图谱，所述共有峰中峰2为盐酸麻黄碱峰，峰3为盐酸伪麻黄碱峰，峰4为葛根素峰，峰7为升麻素苷峰，峰8为橙皮苷峰。在对照特征图谱中，以葛根素为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在第一规定值的±5％之内，所述第一规定值为：0.37-峰1、0.53-峰2、0.58-峰3、1.00-峰S、1.03-峰5、1.05-峰6、1.11-峰7、1.39-峰8；取风寒感冒颗粒，按上述方法操作，得到风寒感冒颗粒样品特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对样品图谱与对照特征图谱进行分析，相似度大于0.90为合格产品。本发明的有益效果如下：(1)用本发明所提供的方法能有效的监控不同批次间风寒感冒颗粒的质量，方法具有精密度高、重现性好等特点，有利于全面监控产品的质量。(2)本发明的质量检测方法以盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、葛根素、升麻苷、橙皮苷为对照，建立的风寒感冒颗粒特征图谱注重各个特征峰的顺序和关系，能全面监控产品的整体质量面貌特征，方法科学可靠。(3)本发明的最佳紫外吸收波长为210nm。采用本发明中方法用DAD检测器对风寒感冒颗粒进行测定，根据三维扫描图中所有色谱峰出现最大吸收的检测波长结果分别调取各波长下色谱图，当检测波长为210nm时，特征峰数目较多，各峰面积较高且各特征峰之间分离效果也最好。附图说明图1是风寒感冒颗粒HPLC特征图谱图2是风寒感冒颗粒15批次HPLC特征图谱叠加图图3是风寒感冒颗粒对照特征图谱附图解释：图1中峰2为盐酸麻黄碱峰，峰3为盐酸伪麻黄碱峰，峰4为葛根素峰，峰7为升麻素苷峰，峰8为橙皮苷峰。具体实施方式实施例1建立风寒感冒颗粒HPLC特征图谱测定方法1仪器：UltiMate3000DGLC高效液相色谱仪，紫外DAD检测器；MettlerAE240十万分之一分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；AB204-E电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)等。2试剂与试药2.1试剂：甲醇等为分析纯，磷酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水。2.2试药：盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、葛根素、升麻苷、橙皮苷(均来自中国食品药品鉴定研究院)。3方法与结果3.1参照物溶液的制备：取葛根素对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含50μg的溶液。3.2供试品溶液的制备:取风寒感冒颗粒研细，取约2g，精密称定，精密加取50％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。3.3色谱条件：采用ZORBAXSB-C18色谱柱(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；流动相为以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱；体积流量1.0mL/min；DAD检测器，波长为210nm；柱温35℃；进样量10μL。理论板数均不低于10000。梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～20min，A相：3％、B相：97％；20～35min，A相：3～9％、B相：97～91％；35～60min，A相：9～19％、B相：91～81％；60～85min，A相：19～50％、B相：81～50％；85～90min，A相：50～70％、B相：50～30％；90～100min，A相：70～3％、B相：30～97％；100～110min，A相：3％、B相：97％。3.4测定：分别精密吸取供试品溶液和参照物溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到特征图谱，如图1所示。4.风寒感冒颗粒HPLC特征图谱特征峰指认取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、葛根素、升麻苷、橙皮苷对照品适量，分别精密称定，加50％甲醇制成每1ml含盐酸麻黄碱90μg、盐酸伪麻黄碱90μg、葛根素50μg、升麻苷50μg和橙皮苷100μg的溶液，依法测定。通过上述对照品对色谱峰进行指认，峰2为盐酸麻黄碱峰，峰3为盐酸伪麻黄碱峰，峰4为葛根素峰，峰7为升麻素苷峰，峰8为橙皮苷峰。5.风寒感冒颗粒特征图谱测定方法学考察5.1精密度试验：取风寒感冒颗粒，按步骤(2)方法制成供试品溶液，连续进样5次。结果：5次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间RSD值均﹤2％，表明仪器精密度良好。5.2稳定性试验：取风寒感冒颗粒，按步骤(2)方法制成供试品溶液，分别在0、2、4、8、12小时依法进行检测。结果：5次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间RSD值均﹤2％，表明供试品溶液在12小时之间稳定。5.3重复性试验：取同一批风寒感冒颗粒，按步骤(2)方法制备6份供试品溶液，依法测定。结果：6次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间RSD值均﹤2％，表明方法的重复性较好。6构建风寒感冒颗粒的对照特征图谱6.1取风寒感冒颗粒15批，按实施例1的条件进行测定，得到15批次样品HPLC特征图谱，如图2所示。采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对15批特征图谱进行比较，确定共有特征峰，生成由8个共有峰构成的对照特征图谱，如图3所示。其中参照峰为葛根素峰(4号峰)。6.2相似度分析:以中药色谱指纹图谱相似度评价软件分析，计算15批供试品特征图谱与生成的对照特征图谱的相似度，结果均大于0.90。相似度比较结果见表1。表1HPLC特征图谱相似度评价结果样品批次123456789101112131415相似度10.9450.9210.9970.9880.9750.9210.9150.9630.9770.9150.9920.9830.9410.9937风寒感冒颗粒的质量检测方法7.1取10批风寒感冒颗粒制剂(由A、B、C、D四个不同厂家生产)，按实施例1的条件进行测定，得到10批次样品的HPLC特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对样品特征图谱与对照特征图谱进行分析，相似度大于0.90为合格产品。7.2检测结果为A、B、D三个厂家8批次产品为合格品，C厂家2批次产品为不合格品。综上所述，本发明所构建质量检测方法的稳定性好，精密度高，重复性好，因此本发明发案具有可行性。利用本发明质量检测方法监控所获得的中成药风寒感冒颗粒，质量一致，疗效稳定。当前第1页1 2 3