全血中血红蛋白检测的纸基微流控芯片及其制作和应用的制作方法

本发明涉及微流控分析应用于全血中血红蛋白定量测定技术领域，特别涉及全血中血红蛋白检测的纸基微流控芯片及其制作和应用，是一种将全血分析中涉及的胞浆预分离、血细胞洗脱、细胞裂解及血红蛋白释放、干扰杂质去除(无机盐、葡萄糖和脂质)等样品预处理单元，与用于循环伏安电化学检测的丝网印刷三电极系统集成的全血血红蛋白检测纸基微流控芯片。

背景技术：

血红蛋作为血液的组成成分，负责从肺部运载氧气到身体各器官和组织，具有非常重要的生理作用(A.N.Schechter,Blood,2008,112,3927)。血红蛋白含量过高或过低都会导致血液输氧能力的降低，严重时使各器官的功能紊乱。血液中血红蛋白浓度的变化与多种疾病相关，如白血病、贫血、心脏病等(X.F.Yang,et al.,Talanta,2003,61,439-445)，血红蛋白疾病遍布人群极广，女性中贫血的病发率就高达64.4％。因此血红蛋白的测定对许多疾病的预防、确诊和治疗都有重要意义。目前血红蛋白含量检测方法主要包括，分光光度法(K.Takahata,et al.,Clin.Chim.Acta,1999,283,129-138)、免疫分析法(K.Zhang,et al.,Anal.Chim.Acta,2000,413,109-113)、化学发光法(Z.S.Traore,et al.,Luminescence,2013,28,56-62)、高效液相色谱法(M.R.V.Bommel,et al.,J.Chromatogr.A,2000,886,19-29；T.H.J.Huisman,et al.,Anal.Chim.Acta,1997,352,187-200)和质谱法(F.Helmich,et al.,Clin.Chim.Acta,2016,460,220-226)。传统方法(色谱、质谱等)虽然检测结果准确稳定，但依赖操作繁琐、价格昂贵的大型检测仪器。比色分析虽然仪器简单，但需有生物毒害的试剂(荧光染料等)辅助检测。电化学生物传感器技术以其响应快、灵敏度高等显著优点在临床诊断领域发展迅速。Pakapongpan等通过自组装过程将亚甲蓝-多壁碳纳米管复合物修饰在玻碳电极表面，该电化学传感器在较宽浓度范围内(5nM～2μM)均对血红蛋白有相应(R.Palangsuntikul,et al.,Electrochim.Acta,2011,56,6831-6836)。Wang等通过电聚合作用制备了一种基于离子液体功能化的石墨烯分子印迹聚合材料，将其作为蛋白分子识别元件修饰玻碳工作电极，用于血红蛋白检测(Z.Wang,et al.,Biosens.Bioelectron.,2014,61,391-396)。2015年Matysiak等将碳封装的铁纳米颗粒修饰在工作电极(碳膜沉积的金石英电极)表面，无需预处理过程，通过外加磁场可直接对全血样品中的血红蛋白进行电化学定量检测，结果表明该修饰电极不受血液样本中杂质干扰，对血红蛋白的电活性响应良好(E.Matysiak,et al.,Biosens.Bioelectron.,2015,64,554-559)。然而上述研究使用成本较高的玻碳电极、银电极和金电极等，电极修饰过程相对复杂，部分方法的检测结果依赖前期的样品预处理效果，传统独立的电级体系亦不利于三电极的集成和批量生产。

纸基电化学分析芯片因制备工艺简单、易于操作、成本低廉、便于携带、环境友好、微型集成、分析速度快等优点近年来迅速发展，广泛用于家庭、野外、资源匮乏等地区的生命小分子、癌症标记物、污染物、病原体等的快速检测，但其在全血中血红蛋白的检测未见报道。将血液预处理过程涉及的血浆离心、血细胞清洗、细胞裂解及血红蛋白释放等步骤集成于纸基电化学分析芯片，可消除血液中复杂成分对检测信号的干扰，同时简化了特异性响应电极繁琐复杂的修饰过程，无需外部设备(超声震荡器和离心机)，对于简化操作过程，减少检测成本及试剂用量，普及和推广血红蛋白检测，有重要的现实意义。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供全血中血红蛋白检测的纸基微流控芯片及其制作和应用，通过丝网印刷和激光雕刻技术在纸基上加工胞浆预分离、血细胞洗脱、细胞裂解及血红蛋白释放、干扰杂质去除(无机盐、葡萄糖、脂质等)、三电极系统等多个功能单元；包含不同密度的激光刻蚀阵列微缝的扇形洗脱池，可快速完成不同洗脱剂针对血细胞及血红蛋白的多次洗涤；亚甲蓝修饰的抛光碳工作电极可加速血红蛋白和电极间的电子传递，使三电级系统具有较大的电流响应及检测范围，通过将该芯片不同区域的功能单元叠置及部分翻折，即可获得三维结构的立体纸基微流控芯片来执行其分离、检测等特定功能；应用时整个检测过程操作简单、分析速度快、所需样品体积小，适用于家庭医疗、野外急诊、偏远及不发达等地区的全血中血红蛋白含量的快速检测。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

全血中血红蛋白含量检测的纸基微流控芯片，包括3个功能区域，纸基芯片I区用于胞浆分离后的细胞洗脱，纸基芯片II区用于全血进样与胞浆分离及后期电化学检测，纸基芯片III区用于细胞裂解后血红蛋白洗脱，所述的纸基芯片I区和III区包含不同数目阵列微缝的扇形洗脱池，所述的纸基芯片II区包含由银/氯化银参比电极、亚甲蓝修饰的抛光碳工作电极和对电极组成的丝网印刷三电极系统。

全血中血红蛋白检测的纸基微流控芯片的制作方法，包括如下步骤，

(1)、用绘图软件设计纸基芯片II区的工作电极17和对电极19的电极系统，工作电极17和对电极19垂直设置，以该设计为模板加工成丝网印刷的电极网板A，在色谱纸正面通过电极网板A丝网印刷碳浆，获得包含碳工作电极17和碳对电极19的色谱纸，放入预热150℃的烘箱中烘干5分钟后取出；

(2)、用绘图软件设计只包含参比电极18的银/氯化银电极模板，并加工成丝网印刷的电极网板B，在包含烘干的碳工作电极17和碳对电极19的色谱纸正面，通过网板B丝网印刷银/氯化银浆，得到包含碳工作电极17、碳对电极19和银/氯化银电极18的三电极系统的色谱纸，将三电极系统的色谱纸放入预热150℃的烘箱中烘干5分钟后取出；

(3)、用绘图软件设计全血纸基微流控芯片的疏水结构模板，包括纸基芯片I区、II区和III区，其中纸基芯片I区和III区结构相同均包含八个亲水的扇形洗脱池25和一个中心连接池26，纸基芯片II区整体为疏水结构，以该疏水结构模板为依据加工成疏水结构网板C，疏水结构在包含三电极的色谱纸的背面通过网板C丝网印刷质量比8:1的PDMS和正硅酸乙酯TEOS的液态胶，在预热的150℃烘箱中加热1小时，使PDMS疏水障碍干燥的同时活化碳电极，每次印刷过程都需位置校准；

(4)、再设计激光刻蚀微缝加工模板图，在与纸基芯片I区和III区的八个亲水的扇形洗脱池25相契合的位置设计平行阵列的激光刻蚀微缝，八个亲水的扇形洗脱池25依次交替分布具有不同密度的激光刻蚀微缝27、28，通过激光刻蚀仪以及设计的微缝加工模板图，在包含三电极和疏水结构单元的色谱纸正面，以激光刻蚀仪最大强度16％的激光强度和最大刻蚀速度70％的激光速度加工微缝结构，激光刻蚀开始前进行位置校准，获得包含阵列微缝结构的八个亲水的扇形洗脱池9-16的芯片I区，芯片III区具有相同结构；

(5)、设计激光刻蚀剪切及折叠线加工模板图，在纸基芯片I区亲水的中心连接池26设计八条剪切线，将中心连接池26分成8个同等大小的扇形区1-8，在纸基芯片II区设计圆形结构20(图1和图2A所示圆形实线)，在纸基芯片III区亲水的中心连接池同样设计八条剪切线，在芯片I、II和III区的连接位置设计10条剪切线a-b、b-c、c-d、d-e、e-f、g-h、h-i、i-j、j-k和k-l，在芯片II区设计折叠线b-h和e-k，在所得的色谱纸正面同样通过激光刻蚀仪，以30％激光强度和100％的激光速度加工步骤(5)设计的激光刻蚀剪切及折叠线加工模板图，获得一个镂空的进样区20、26条剪切线以及两条折叠线的纸基微流控芯片；

(6)、对纸基微流控芯片上的碳工作电极和碳对电极表面进行抛光处理，用砂纸在碳工作电极17和对电极19表面，沿同一方向用力均匀的打磨去除电极表面钝化的碳层，得到抛光的碳电极表面23，再用超纯水清洁碳工作电极和碳对电极表面，洗去碳电极表面打磨产生的微细碳颗粒，清洗电极过程中超纯水只流经或接触芯片II的疏水区域，严禁污染芯片亲水位置；

(7)、通过物理吸附法将亚甲蓝修饰到碳工作电极上：将亚甲蓝添加到pH＝7.4磷酸盐缓冲液中，搅拌半小时，配置成40mM的亚甲蓝溶液，以体积比为1000:1的比例配置亚甲蓝-Triton X.100混合溶液，混合均匀静置20分钟，分别将亚甲蓝溶液均匀滴到打磨过的碳工作电极和碳对电极表面，并将其置于防潮柜内避光干燥12小时；

(8)、在芯片II的色谱纸正面镂空的进样区20粘贴与对应区域尺寸相同的1.2μm全血分离膜21，得到进样区24；最终得到抛光修饰过的纸基微流控芯片成品。

全血中血红蛋白检测的纸基微流控芯片的应用，包括以下步骤：

(1)、沿全血纸基微流控芯片上的剪切线a-b、b-c、c-d、d-e、e-f、g-h、h-i、i-j、j-k和k-l将整个纸基微流控芯片分离成芯片I区、芯片II区、芯片III区，使之成为单独的3个小芯片，同样沿芯片I区和芯片III区中心连接池26的剪切线将扇形亲水区1-8分离，这些扇形亲水区均能够向上或向下翻折；

(2)、将芯片II区沿折叠线b-h和e-k翻折，再将芯片II区的进样区24置于芯片I的中心连接池26上方位置，使两个芯片堆叠在一起，此时八个扇形亲水区1-8向下翻折与芯片II区的进样区24无有效；

(3)、将扇形亲水区1和5向上翻起，保持其他扇形亲水区位置不变，使包含密集微缝的扇形洗脱池9和13与芯片II区的进样区24相连接，在进样区24滴加新鲜血液，再在进样区24滴加pH＝7.4磷酸缓冲液进行第一次洗脱，磷酸缓冲液流过与进样区24紧密相连的扇形亲水区1和5，快速流向包含密集微缝的扇形洗脱池9和13，该过程中血浆中小分子物质溶于磷酸缓冲液，通过全血分离膜被带走，而血细胞保留在全血分离膜上，等磷酸缓冲液被扇形洗脱池9和13完全吸收后，将扇形亲水区1和5向下翻折，第一次洗脱结束；将扇形亲水区3和7向上翻起，使包含密集微缝的扇形洗脱池11和15与芯片II区的进样区24相连接，接着在进样区24滴加pH＝7.4磷酸缓冲液进行第二次洗脱，待磷酸缓冲液被扇形洗脱池11和15完全吸收后，将扇形亲水区3和7向下翻折，完成第二次洗脱；

(4)、将扇形亲水区2和6向上翻起，使包含较疏松微缝的扇形洗脱池10和14与芯片II区的进样区24相连接，在进样区24滴加质量分数为0.9％的氯化钠溶液进行第三次洗涤，该过程去除杂质蛋白，同样等生理盐水被扇形洗脱池10和14完全吸收后，将扇形亲水区2和6向下翻折，并将扇形亲水区4和8向上翻起，使扇形洗脱池12和16与进样区24相连接，滴加生理盐水进行第四次洗脱，待生理盐水被扇形洗脱池12和16完全吸收后，将芯片I区和芯片II区分离，完成胞浆预分离和血细胞洗涤过程；

(5)、在芯片II区的进样区24加入去氧胆酸钠溶液，溶化红细胞，释出血红蛋白，再在加入进样区24加入亚硝酸钠溶液将血红蛋白转化成高铁血红蛋白，以消除由于氧化造成的检测误差，完成细胞裂解及血红蛋白释放过程；

(6)、芯片II区的进样区11与芯片III的中心连接池26堆叠连接起来，芯片III除去血细胞中干扰杂质的使用过程与芯片I类似，先使用密集微缝的扇形洗脱池9和13通过pH＝7.4磷酸缓冲液进行第一次洗涤，扇形洗脱池11和15通过pH＝7.4磷酸缓冲液进行第二次洗涤，两次洗涤去除血细胞裂解后释放的小分子物质，再用较疏松微缝的扇形洗脱池10和14通过乙醇进行第三次洗涤，扇形洗脱池12和16通过乙醇进行第四次洗脱，该过程乙醇迅速挥发同时去除脂溶性有机物，洗涤完毕后，将芯片I区和芯片II区分离，完成干扰杂质的分离过程；

(7)、在进样区24滴加pH＝7.4磷酸缓冲液，随之将芯片II区沿折叠线b-h和e-k翻折，使保留在进样区24的待检测的纯化血红蛋白与打磨的碳工作电极表面17、打磨的碳对电极表面19以及银/氯化银电极18有效的连接起来，再将三电极连接到外部设备电流信号检测装置(台式电化学工作站和便携的微型电化学工作站均可)，亚甲蓝具有良好的氧化还原性，在0.17V和0.27V处分别有氧化峰和还原峰，有血红蛋白存在时氧化峰电流相应减小，同时还原峰电流相应增大，该过程亚甲蓝催化血红蛋白的还原，并起到加速电极和血红蛋白之间电子传递的作用，通过循环伏安法，记录峰电流即可检测全血中的血红蛋白含量。

本发明具有下列优点，

1)本发明将全血样品的预处理单元集成于纸基电化学分析芯片，该纸基芯片同时具备胞浆分离、血细胞洗脱、细胞裂解及血红蛋白释放、干扰杂质去除、三电极系统用于电化学检测等功能单元，极大地简化了样品预处理的操作步骤，有效地缩短了分析时间，减少了对离心机等外部设备的依赖。从而实现了全血中血红蛋白检测装置的一体化和便携化。

2)本发明通过激光刻蚀技术设计加工了包含不同数目阵列微缝的扇形洗脱池。针对多种洗脱剂和清洗目标对洗涤时间的不同要求，通过调整阵列微缝的数目，即可获得具有不同流速的扇形亲水通道(阵列的微缝数目越多，液流速度越快)。特殊设计的扇形结构的洗脱池，由于阵列微缝可随扇形面积的延展不断增加，使洗脱池内溶液的流速并不随通道延长而减缓。相较于传统矩形纸基通道，阵列微缝扇形洗脱池可提供更快速稳定的液流速度，更大的溶液容量，以及更为紧密的芯片结构。

3)本发明增加的血液预处理单元，消除了血液中复杂成分对检测信号的干扰，故工作电极无需繁琐复杂的修饰，简单的将亚甲蓝修饰在抛光的碳工作电极表面，即可获得良好的电流响应和较宽的检测范围。该纸基微流控芯片的加工过程简单、成本低廉、易于存储携带。

4)本发明设计的芯片结构通过简单的叠置及翻折，即可获得三维的立体结构，按本发明所诉步骤顺序操作，即可轻松实现血细胞分离、洗涤、裂解、血红蛋白释放、杂质除去和电化学检测。检测过程操作简单、快速、样品和试剂消耗少，特别适用于家庭、野外、偏远及不发达地区的全血中血红蛋白含量检测。

附图说明

图1为本发明用于全血中血红蛋白含量检测的纸基微流控芯片总装示意图。

图2A为本发明位于纸基芯片II区的电化学检测单元及全血进样区的结构示意图。

图2B为本发明纸基芯片II区的电化学检测单元及全血进样区的剖面图。

图3为本发明位于纸基芯片I区(III区)的包含8个不同洗脱池的杂质分离单元的结构示意图。

图4为本发明设计的纸基芯片I区(III区)与II区配合用于分离血红蛋白的示意图。

图5A为本发明折叠的纸基芯片II区用于分离后的血红蛋白电化学定量检测的正视图。

图5B为本发明折叠的纸基芯片II区用于分离后的血红蛋白电化学定量检测的剖面图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做详细叙述。

全血中血红蛋白含量检测的纸基微流控芯片，包括3个功能区域，纸基芯片I区用于胞浆分离后的细胞洗脱，纸基芯片II区用于全血进样与胞浆分离及后期电化学检测，纸基芯片III区用于细胞裂解后血红蛋白洗脱，所述的纸基芯片I区和III区包含不同数目阵列微缝的扇形洗脱池，所述阵列的微缝数目越多，其具有的液流速度越快，通过调整阵列微缝的数目，即可获得具有不同流速的扇形亲水通道。所述的纸基芯片II区包含由银/氯化银参比电极、亚甲蓝修饰的抛光碳工作电极和对电极组成的丝网印刷三电极系统。

全血中血红蛋白检测的纸基微流控芯片的制作方法，最终所得芯片结构参照图1，包括如下步骤，

(1)、用CorelDRAW 9绘图软件设计纸基芯片II区的工作电极17和对电极19的电极系统，工作电极17和对电极19垂直设置，位置如图1和图2中所示，以该设计为模板加工成200目丝网印刷的电极网板A，在Whatman 1号色谱纸正面通过电极网板A丝网印刷碳浆(Henkel，ED-581-SS)，获得包含碳工作电极17和碳对电极19的色谱纸，放入预热150℃的烘箱中烘干5分钟后取出；

(2)、用CorelDRAW 9绘图软件设计只包含参比电极18的银/氯化银电极模板，并加工成200目丝网印刷的电极网板B，电极18位置如图1中所示，在包含烘干的碳工作电极17和碳对电极19的色谱纸正面，通过网板B丝网印刷银/氯化银浆(Henkel，EL-601)，得到包含碳工作电极17、碳对电极19和银/氯化银电极18的三电极系统的色谱纸，将三电极系统的色谱纸放入预热150℃的烘箱中烘干5分钟后取出；

(3)、用绘图软件CorelDRAW 9设计全血纸基微流控芯片的疏水结构模板(图1中浅灰色区域结构)，包括纸基芯片I区、II区和III区，其中纸基芯片I区和III区结构相同均包含八个亲水的扇形洗脱池25和一个中心连接池26，纸基芯片II区整体为疏水结构，以该疏水结构模板为依据加工成250目疏水结构网板C，依据图1中疏水结构所示位置，疏水结构在包含三电极的色谱纸的背面通过网板C丝网印刷质量比8:1的PDMS和正硅酸乙酯TEOS的液态胶混合物，在预热的150℃烘箱中加热1小时，使PDMS疏水障碍干燥的同时活化碳电极，每次印刷过程都需位置校准，确保加工的三电极和PDMS疏水结构位置严格如图1所示；

(4)、再用绘图软件CorelDRAW 9设计激光刻蚀微缝加工模板图，在与纸基芯片I区和III区的八个亲水的扇形洗脱池25相契合的位置设计平行阵列的激光刻蚀微缝，八个亲水的扇形洗脱池25依次交替分布具有不同密度的激光刻蚀微缝27、28，其中微缝27两条微缝间的间隔为250μm，微缝28的微缝间隔为400μm，亲水扇形洗脱池25中包含阵列的微缝数目越多，溶液在其流动的速度越快，因此针对不同的洗脱剂和清洗目标，调整阵列微缝的数目获得所需流速，通过Universal VLS2.30激光刻蚀仪以及设计的微缝加工模板图，在包含三电极和疏水结构单元的色谱纸正面，以激光刻蚀仪最大强度16％的激光强度和最大刻蚀速度70％的激光速度加工微缝结构，激光刻蚀开始前进行位置校准，获得包含阵列微缝结构的八个亲水的扇形洗脱池9-16的芯片I区，芯片III区具有相同结构；

(5)、用绘图软件CorelDRAW 9设计激光刻蚀剪切及折叠线加工模板图，在纸基芯片I区亲水的中心连接池26设计八条剪切线(图1所示线-线结构的虚线)，将中心连接池26分成8个同等大小的扇形区1-8，在纸基芯片II区设计圆形结构20(图1和图2A所示圆形实线)，在纸基芯片III区亲水的中心连接池同样设计八条剪切线，在芯片I、II和III区的连接位置设计10条剪切线(线-线结构的虚线)a-b、b-c、c-d、d-e、e-f、g-h、h-i、i-j、j-k和k-l，在芯片II区设计折叠线(线-点结构的虚线)b-h和e-k，在所得的色谱纸正面通过Universal VLS2.30激光刻蚀仪，以30％激光强度和100％的激光速度加工步骤(5)设计的激光刻蚀剪切及折叠线加工模板图，获得一个镂空的进样区20、26条剪切线以及两条折叠线的纸基微流控芯片，剪切线的作用是使芯片便于切割分离，折叠线的作用是便于折叠改变芯片立体结构，该结构易于后续的全血样品洗脱分离和电化学检测操作；

(6)、对纸基微流控芯片上的碳工作电极和碳对电极表面进行抛光处理，用1500目砂纸(Starcke GmbH&Co.KG)在碳工作电极17和对电极19表面，沿同一方向用力均匀的打磨40次去除电极表面钝化的碳层，得到抛光的碳电极表面23，打磨过得碳电极表面23具有更高的电子转移速率，再用超纯水清洁碳工作电极和碳对电极表面，洗去碳电极表面打磨产生的微细碳颗粒，清洗电极过程中超纯水只流经或接触芯片II的疏水区域，严禁污染芯片亲水位置；

(7)、通过物理吸附法将亚甲蓝修饰到碳工作电极上：将亚甲蓝添加到pH＝7.4磷酸盐缓冲液中，搅拌半小时，配置成40mM的亚甲蓝溶液，以体积比为1000:1的比例配置亚甲蓝-Triton X.100混合溶液，Triton X.100用以增强疏水的电极表面吸附亚甲蓝溶液的能力，混合均匀静置20分钟，用微型移液枪分别将5μL的亚甲蓝溶液均匀滴到打磨过的碳工作电极和碳对电极表面，并将其置于防潮柜内避光干燥12小时；

(8)、在芯片II的色谱纸正面镂空的进样区20粘贴与对应区域尺寸相同的1.2μm全血分离膜21(Cobetter HD)，得到进样区24；最终得到抛光修饰过的纸基微流控芯片成品。

全血中血红蛋白检测的纸基微流控芯片的应用，包括以下步骤：过程参照图2-5，

(1)、沿全血纸基微流控芯片上的剪切线a-b、b-c、c-d、d-e、e-f、g-h、h-i、i-j、j-k和k-l将整个纸基微流控芯片分离成芯片I区、芯片II区、芯片III区，使之成为单独的3个小芯片，同样沿芯片I区和芯片III区中心连接池26的剪切线将扇形亲水区1-8分离，这些扇形亲水区均能够向上或向下翻折，如图3所示；

(2)、将芯片II区沿折叠线b-h和e-k翻折如图2A所示，再将芯片II区的进样区24置于芯片I的中心连接池26上方位置，使两个芯片堆叠在一起，此时八个扇形亲水区1-8向下翻折与芯片II区的进样区24无有效连接如图4所示；

(3)、将扇形亲水区1和5向上翻起，保持其他扇形亲水区位置不变，使包含密集微缝的扇形洗脱池9和13与芯片II区的进样区24相连接，在进样区24滴加10μL的新鲜血液(图4中步骤①所示)，再在进样区24滴加50μL pH＝7.4磷酸缓冲液进行第一次洗脱(图4中步骤②所示)，磷酸缓冲液流过与进样区24紧密相连的扇形亲水区1和5，快速流向包含密集微缝的扇形洗脱池9和13，该过程中血浆中小分子物质如无机盐、葡糖糖、激素等溶于磷酸缓冲液，通过全血分离膜被带走，而血细胞保留在全血分离膜上，等磷酸缓冲液被扇形洗脱池9和13完全吸收后，将扇形亲水区1和5向下翻折，第一次洗脱结束；将扇形亲水区3和7向上翻起，使包含密集微缝的扇形洗脱池11和15与芯片II区的进样区24相连接，接着在进样区24滴加50μL pH＝7.4磷酸缓冲液进行第二次洗脱，待磷酸缓冲液被扇形洗脱池11和15完全吸收后，将扇形亲水区3和7向下翻折，完成第二次洗脱；

(4)、将扇形亲水区2和6向上翻起，使包含较疏松微缝的扇形洗脱池10和14与芯片II区的进样区24相连接，在进样区24滴加50μL质量分数为0.9％的氯化钠溶液(生理盐水)进行第三次洗涤(图4中步骤③所示)，包含较疏松微缝的扇形洗脱池10和14相对包含密集微缝的扇形洗脱池具有较慢的洗脱速度，该过程去除杂质蛋白，同样等生理盐水被扇形洗脱池10和14完全吸收后，将扇形亲水区2和6向下翻折，并将扇形亲水区4和8向上翻起，使扇形洗脱池12和16与进样区24相连接，滴加50μL生理盐水进行第四次洗脱，待生理盐水被扇形洗脱池12和16完全吸收后，将芯片I区和芯片II区分离，完成胞浆预分离和血细胞洗涤过程；

(5)、在芯片II区的进样区24加入40μL去氧胆酸钠溶液，溶化红细胞，释出血红蛋白，再在加入进样区24加入10μL亚硝酸钠溶液将血红蛋白转化成高铁血红蛋白，以消除由于氧化造成的检测误差，完成细胞裂解及血红蛋白释放过程；

(6)、芯片II区的进样区11与芯片III的中心连接池26堆叠连接起来，芯片III除去血细胞中干扰杂质的使用过程与芯片I类似，参照步骤(2.3)和(2.4)，先使用密集微缝的扇形洗脱池9和13通过滴加50μL pH＝7.4磷酸缓冲液进行第一次洗涤，扇形洗脱池11和15通过滴加50μL pH＝7.4磷酸缓冲液进行第二次洗涤，两次洗涤去除血细胞裂解后释放的小分子物质，再用较疏松微缝的扇形洗脱池10和14通过滴加50μL乙醇进行第三次洗涤，扇形洗脱池12和16通过滴加50μL乙醇进行第四次洗脱，该过程乙醇迅速挥发同时去除脂溶性有机物，洗涤完毕后，将芯片I区和芯片II区分离，完成干扰杂质的分离过程，这种少量试剂多次洗涤的过程可以有效去除血细胞中对电化学检测产生的干扰；

(7)、在进样区24滴加10μL pH＝7.4磷酸缓冲液，随之将芯片II区沿折叠线b-h和e-k翻折如图5A所示，使保留在进样区24的待检测的纯化血红蛋白与打磨的碳工作电极表面17、打磨的碳对电极表面19以及银/氯化银电极18有效的连接起来，再将三电极连接到外部设备电流信号检测装置(台式电化学工作站和便携的微型电化学工作站均可)如图5B所示，亚甲蓝具有良好的氧化还原性，在0.17V和0.27V处分别有氧化峰和还原峰，有血红蛋白存在时氧化峰电流相应减小，同时还原峰电流相应增大，该过程亚甲蓝催化血红蛋白的还原，并起到加速电极和血红蛋白之间电子传递的作用。因此通过循环伏安法，记录峰电流即可检测全血中的血红蛋白含量。