一种时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒及方法与流程

本发明涉及一种时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒及检测方法。

(二)

背景技术：

尿微量白蛋白是指在尿液中出现微量白蛋白。白蛋白是一种血液中正常蛋白质，人体代谢正常情况下，尿液中白蛋白极少，每升尿液白蛋白不超过20mg(<20mg/L)，所以叫微量白蛋白。但糖尿病肾病、高血压肾病等早期肾脏受损和心血管疾病并发症等发生时会造成肾脏固有细胞损伤，使肾脏固有细胞结构及功能发生变化而导致白蛋白含量在尿液中升高。尿液中微量白蛋白在20～200mg/L范围内，就属于微量白蛋白尿，当尿液中微量白蛋白超过200mg/L时，证明患者有大量白蛋白漏出，可能出现低蛋白血症，可发展为肾病，若不及时治疗会进入尿毒症期。尿微量白蛋白见于糖尿病肾病、高血压、妊娠子痫前期，是肾损伤的早期敏感指标。

现有技术中测定尿微量白蛋白的方法主要有免疫比浊法、荧光免疫层析法、酶联免疫法、化学发光法、胶体金法等。其中胶体金法具有操作简单快速的优点，但灵敏度低且定量不准确；酶联免疫法灵敏度高，样品量大可定量检测，但操作时间长且自动化低；免疫比浊法和化学发光法较为敏感、准确，可应用于全自动生化仪，但需要仪器且耗时较长，适合处理大量样本，无法满足快速检测的目的；免疫荧光法是将尿微量白蛋白抗体共价结合于荧光微球表面活性基团上，通过激发后检测线是否产生荧光来判断结果，快速便捷可准确定量同时具有高灵敏度、标记物稳定等优点，在医学免疫检测领域广泛应用。

然而在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的荧光素等发色团进行荧光检测时灵敏度就会严重下降，但大部分背景荧光信号是短时存在的，可利用稀土荧光微球(镧系元素螯合物)作为标记物来标记抗体或抗原。因镧系元素螯合物stoke位移大很容易分辨激发光和发射光，从而排除激发光干扰，且衰变时间长可通过时间分辨消除本底荧光干扰，另外镧系元素螯合物激发光谱宽而发射光谱窄可进一步提高灵敏度和降低本底荧光。因此采用时间分辨荧光免疫技术，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是针对现有技术的不足和缺陷提供一种利用时间分辨荧光免疫层析技术的灵敏性，结合干式免疫荧光分析仪实现高灵敏度、可准确定量、简便快捷的时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒及检测方法。

本发明采用的技术方案是：

一种时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒，包括时间分辨荧光试纸卡、样本稀释液和含有定标曲线的SD卡；

所述时间分辨荧光试纸卡包括检测试纸条，所述试纸条由底衬以及粘贴在底衬上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，所述样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸顺次搭接粘贴在底衬上；

所述硝酸纤维素膜上依次设置有微球线、检测线和质控线，微球线、检测线和质控线相互平行，间隔距离为3～5mm，其中微球线靠近加样孔，质控线远离加样孔，所述微球线由标记有人白蛋白单克隆抗体的时间分辨荧光微球组成，检测线包被有人白蛋白重组抗原，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。

所述时间分辨荧光微球掺杂有固含量1％(w/w)的稀土铕元素，且微球粒径为100nm～300nm，在基态下稳定，在350～380nm的激发光源作用下发射出波长范围在600～620nm的荧光。

微球线中人白蛋白单克隆抗体的含量为50～200μg抗体/200μl荧光微球，检测线中人白蛋白重组抗原包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，质控线中羊抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。

所述检测试纸条由如下方法制备：

(1)时间分辨荧光微球的活化

超声波处理荧光微球2min后，取200μl荧光微球以14000rpm高速离心5～15min后，沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤至1ml，超声波处理2min；加入10～100μl的20～100mg/ml碳二亚胺，混匀5～10min，再加入50～200μl的20～100mg/ml N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀10～20min后14000rpm高速离心5～15min，沉淀用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤至1ml；

(2)时间分辨荧光微球标记人白蛋白单克隆抗体的制备

在上述活化后的荧光微球超声波处理2min后按照50～200μg/200μl加入人白蛋白单克隆抗体，混匀1～3小时，用含0.5％BSA的10～50mM、pH 7.5～8.5Tris-HCl封闭液封闭0.5～1小时后14000rpm高速离心5～15min，用含1％Nacl、0.5％BSA、0.1％Tween20的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-Hcl保存液洗涤并重悬至200μl于4℃避光保存。

(3)包被膜的制备

分别用包被缓冲液(含2.5％蔗糖的10mM PBS缓冲液)将人白蛋白重组抗原和羊抗鼠IgG抗体调整浓度到0.5～2mg/ml，用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，用微球稀释液将标记人白蛋白单克隆抗体的时间分辨荧光微球3～6倍稀释，用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，作为微球线划于硝酸纤维素膜上靠近样品垫方向进行包被，质控线、检测线和微球线间隔3～7mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜。

(4)在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述试纸条。

所述时间分辨荧光试纸卡由检测试纸条固定在塑料底卡上，试纸表面用卡面压紧，且卡面在对应样品垫和硝酸纤维素膜的部分分别预留加样孔和观察窗。

所述样本稀释液组成如下：NaCl 0.5％，BSA 0.5％，Tween 1％，溶剂为10～50mM、pH7.5～8.5Tris-HCl缓冲液，以270μl/管分装于离心管中。样本缓冲液用于层析样品。

所述含有标准曲线的SD卡，是通过时间分辨荧光试纸条测定不同浓度的校准品，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在SD卡中获得。通过干式荧光免疫分析仪可读取试剂卡上对应的二维码信息并测得相应浓度。

本发明还涉及利用所述试剂盒的定量检测尿微量白蛋白的方法，所述方法包括：

(1)将检测试剂盒和样品置于室温下，待恢复至室温后使用；

(2)开启干式荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应SD卡；

(3)精确吸取30μL待测尿液加入样本稀释液中，混匀；

(4)吸取混合后样本80μL，加入到检测卡加样孔中；

(5)将检测卡插入检测槽，10min后检测并读取和打印检测结果。检测范围2～300mg/L。

本发明所述时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒的检测原理是竞争法，检测人尿液中微量白蛋白的含量。含尿微量白蛋白的尿液样本稀释液滴加在样本加样区，通过毛细作用层析至硝酸纤维素膜微球线，与时间分辨荧光微球标记的人白蛋白单克隆抗体结合，形成微球抗体-抗原复合物，层析至检测区，因检测线固定的人白蛋白重组抗原和样本中微量白蛋白与微球标记的人白蛋白单克隆抗体竞争结合，因此样本中白蛋白越多，检测线处结合的微球抗体越少，而多余的荧光微球标记物继续向前层析，与固定在质控线羊抗鼠结合。反应结束后，用紫外光源(365nm)对检测区扫描检测，检测线和质控线上时间分辨荧光微球发出荧光(615nm)，其衰变时间也较长。利用延缓测量时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光(1～10ns)全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以完全排除特异本底荧光的干扰。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。

本发明的有益效果主要体现在：本发明试剂盒能够准确定量检测人尿液中微量白蛋白的含量，利用时间分辨荧光微球检测技术，可避免样本本身荧光干扰，标记通过共价键将微球与抗体连接，标记产物稳定，具有检测范围宽(2～300mg/L)、灵敏度高(检出限2mg/L)、准确度高、检测快速简便等特点。

(四)附图说明

图1为本发明的时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒中检测试纸条的结构示意图；

其中：1、样品垫；2、包被膜；3、吸水纸；4、微球线；5、检测线；6、质控线；7、底衬。

图2为本发明实施例1所制备的试剂盒标准曲线。

图3为本发明实施例1所制备的试剂盒与西门子免疫比浊法检测尿微量白蛋白试剂盒检测结果相关性比较。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白试剂盒的制备

时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白试剂盒，采用竞争法免疫层析原理，检测人尿液中微量白蛋白。由时间分辨荧光试纸卡、样本稀释液和含有定标曲线的SD卡组成。

如图1所示，在该实施例中，底衬7上顺次搭接样品垫1、包被膜2以及吸水纸3，样品垫1是加样区，用于吸取待测尿液检测样本，包被膜2上设有微球线、检测线和质控线。

包被膜2上微球线上使用特定的激发光(365nm)/发射光(615nm)波长的稀土铕荧光微球(直径约200nm，铕固含量1％)标记人白蛋白单克隆抗体(100μg抗体/200μl荧光微球)，检测线包被人白蛋白重组抗原(1mg/ml)，质控线包被浓度为1mg/ml的羊抗鼠IgG抗体(其中时间分辨荧光微球采购自美国Bangs Lab公司，人白蛋白单克隆抗体采购自重庆探生科技有限公司，人白蛋白重组抗原采购自洛阳佰泰科生物技术有限公司，羊抗鼠IgG抗体来自长沙博优生物科技有限公司)。微球线、检测线和质控线用量为1μl包被液量/cm膜。

在该实施例中，时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒的制备包括以下步骤：

1.时间分辨荧光微球的活化

超声波处理荧光微球2min后，取200μl荧光微球以14000rpm高速离心15min后，沉淀物用100mM，pH为6.0的MES溶液洗涤至1ml，超声波处理2min；加入50μl的100mg/ml碳二亚胺，混匀5min，再加入100μl的100mg/ml N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀15min后14000rpm高速离心15min，沉淀用pH为6.0的MES溶液洗涤至1ml。

2.时间分辨荧光微球标记人白蛋白单克隆抗体的制备

在上述活化后的荧光微球超声波处理2min后按照100μg/200μl加入人白蛋白单克隆抗体，混匀2小时，用含0.5％BSA的50mM、pH8.0Tris-Hcl封闭液封闭1小时后14000rpm高速离心15min，用含1％Nacl、0.5％BSA、0.1％Tween20的50mM、pH8.0的Tris-HCl保存液中缓冲液洗涤两次并超声处理重悬至200μl于4℃避光保存。

3.包被膜的制备

分别用包被缓冲液(含2.5％蔗糖的10mM PBS缓冲液)将人白蛋白重组抗原和羊抗鼠IgG抗体调整浓度到1mg/ml，用量为1μl包被液量/cm膜，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，用微球稀释液(含0.5％BSA和20％蔗糖的10mM PBS缓冲液)将标记人白蛋白单克隆抗体的时间分辨荧光微球5倍稀释，用量为1μl包被液量/cm膜，作为微球线划于硝酸纤维素膜上靠近样品垫方向进行包被，质控线、检测线和微球线间隔4mm，在湿度<30％，温度45℃烘箱中晾干10小时，封袋，备用；

4.在底衬(尺寸为80*300mm)上顺次相互搭接地粘贴样品垫(尺寸为30*300mm，玻璃纤维棉材质)、包被膜(尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质)和吸水纸(尺寸为28*300mm)得到试纸板，按照要求切割成4mm宽度的试纸条。

本发明检测尿微量白蛋白的时间分辨荧光试纸卡包括检测试纸条，在使用时，试纸条组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳设有两个开孔，加样孔和观察窗，加样孔对应于所述的检测尿微量白蛋白的试纸条样品垫1，结果观察窗对应于所述检测尿微量白蛋白的试纸条的检测线5和质控线6，该检测检测尿微量白蛋白的试纸条可以从该塑料外壳中取出。

本发明试剂盒中，还包括样本稀释液，为含0.5％Nacl、0.5％BSA和1％Tween的50mM、pH8.0Tris-Hcl缓冲液，以270μl/管分装于离心管中。样本缓冲液用于层析样品。

本发明试剂盒中，每盒均含有标准曲线的SD卡(同批次标准曲线相同)，通过时间分辨荧光试纸条测定不同浓度的校准品，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入SD卡并生成二维码，通过干式荧光免疫分析仪可读取试剂卡上对应的二维码信息并测得相应浓度。

实施例2：时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白试剂盒的定量检测

1.标准曲线的绘制

按实施例1制备好的时间分辨荧光试纸卡加入不同浓度白蛋白抗原质控品(302.5mg/L、247.5mg/L、192.5mg/L、137.5mg/L、82.5mg/L、38.5mg/L、11.0mg/L、2.0mg/L共八个浓度，每个浓度设三个重复，均由10mg/ml人白蛋白重组抗原用0.85％生理盐水稀释得到)，加入样本稀释液，层析10min后，通过广州蓝勃生物科技有限公司生产的AFS-1000型干式荧光免疫分析仪读取C、T线荧光信号及C/T值，实验结果及分析见表1：

以微量白蛋白质控品浓度取LOG值和样本信号T/C平均值取LOG值绘制标准曲线，曲线数据见表1，标准曲线如图2所示。其中R值为0.9943，通过该标线对样品中所含微量白蛋白浓度进行浓度定量测定。

2.时间分辨荧光试纸卡性能测试。

最低检出限：用零值样本进行重复测定20次，计算20次结果的均值M与标准差SD，以空白均值加两倍标准差报告方法的检测限(M+2SD)，结果为1.63mg/L，符合灵敏度2mg/L。

线性范围：取2～300mg/L之间八个浓度值，每个浓度重复测量三次，将测定浓度平均值于理论浓度进行线性分析，得到线性方程y＝1.0199x+0.2911，r＝0.9965，表明本发明试剂盒在2～300mg/L线性范围内相关性很好。

精密度：取三批实施例1中所制时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白试剂盒，分别检测247.5、38.5mg/L重复性质控品，每批试剂盒用重复性质控品平行检测10次，247.5mg/L浓度三批批内CV分别为5.25％、7.05％、5.33％，三批批间CV为6.17％，38.5mg/L浓度三批批内CV分别为8.31％、9.55％、9.71％，三批批间CV为9.97％，均在10％以内。

准确度:选择浓度为22mg/L的质控物为检测样本，分为体积相同3份，在其中2份样本中分别加入220mg/L和38.5mg/L的准确度质控品，制成2个不同加入浓度的回收样本，计算加入的待测物的浓度。在另一份样本中加入同样量的无被测物的溶液，制成基础样本。对样本进行3次重复分析，取其均值进行计算。计算回收率＝(分析样品浓度-基础样品浓度)/加入浓度×100％。回收样本220mg/L的回收率为106.03％，28.5mg/L的回收率为97.58％，平均回收率为90.92％。偏差在10％以内。

3.临床样本检测

采集医院检测尿微量白蛋白的尿液样本200份，用本发明的试剂盒和西门子免疫比浊法检测尿微量白蛋白试剂盒两种方法进行检测比较。本发明试剂盒中，取尿液30μl加入样本稀释液，混匀后取80μl加入到检测卡加样孔中，层析10min后通过广州蓝勃生物科技有限公司生产的AFS-1000型干式荧光免疫分析仪读取浓度，同一尿液采用对比系统西门子免疫比浊法检测尿微量白蛋白试剂盒进行浓度检测。两种方法检测结果进行线性分析，如图3所示，其相关性很好r＝0.9893，P>0.05,平均相对偏差小于10％，结果符合临床分析要求，适合用于临床检测。